Abstract

medicamentos aprovados alvo cerca de 400 diferentes mecanismos de ação, dos quais tão poucos como 60 são actualmente utilizados como anti- terapias contra o câncer. Tendo em conta que, em média, leva 10-15 anos para uma nova terapêutica do câncer a ser aprovado, eo recente sucesso de reaproveitamento de drogas para os agentes, tais como talidomida, a hipótese de que eficazes, tratamentos de câncer de seguros podem ser encontrados por meio de testes de drogas aprovados em nova terapêutica configurações. Aqui, nós relatamos

in-vivo testes

de uma ampla coleção composto em modelos de xenotransplante de cancro. Usando compostos que alvejam 182 125 mecanismos alvo originais, identificamos 3 drogas que exibiam actividade reprodutível em combinação com a temozolomida quimioterapêutico. drogas candidatas parecem ser eficazes em equivalentes de dose que excedam os níveis actuais de prescrição, o que sugere que serão necessários esforços pré-clínicos adicionais antes que estes medicamentos podem ser testados quanto à eficácia em ensaios clínicos. No total, sugerimos redefinição de drogas é um método relativamente uso intensivo de recursos que pode identificar medicamentos aprovados com uma estreita margem de actividade anti-cancro

Citation:. Roix JJ, Harrison SD, Rainbolt EA, Meshaw KR, McMurry AS, P Cheung, et ai. (2014) Screening Repurposing Sistemática Em modelos de xenotransplante identifica a droga com Novel Anti-Cancer actividade aprovada. PLoS ONE 9 (8): e101708. doi: 10.1371 /journal.pone.0101708

Edição: Felipe Prosper, Clinica Universidad de Navarra, Espanha |

Recebido: 19 de novembro de 2013; Aceito: 10 de junho de 2014; Publicação: 05 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Roix et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Todos os estudos foram patrocinados e financiados pelos Descobrimentos Vale BioMed, Inc. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. JJR, PS e SS são funcionários de descobertas Vale BioMed, Incorporated, que procura descobrir e comercialmente desenvolver novas terapias e diagnósticos para a doença. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Apesar dos esforços de investigação tremendas, um em cada quatro americanos morrerão como resultado de câncer. A busca para identificar novos tratamentos para o câncer tem estimulado numerosos, grandes inovações na pesquisa biomédica e tratamento do câncer está na vanguarda da medicina molecular, onde os diagnósticos adequados e as drogas são usadas para segmentar precisamente a base genética de câncer [1]. Ainda assim, existem controvérsias quanto ao facto de os esforços e os custos de investigação e tratamento do câncer têm realmente resultou em benefícios sociais suficientes; não está claro quando e como uma vitória na guerra contra o câncer pode ser declarada [2] – [4].

Tem sido sugerido que novas terapias para muitas doenças, incluindo câncer pode ser encontrada através da exploração de medicamentos que são já aprovado para utilização. [5] Existem precedentes para o composto “reaproveitamento” existem, e espera-se que a farmacologia diversificada alvo de medicamentos aprovados pode ter utilidade desconhecida, inesperada em doenças além das indicações do rótulo para os quais essas drogas são actualmente prescritos. Como muitos medicamentos aprovados têm uma história bem estabelecida de dosagem segura em populações gerais, indicações romance Repurposing pode provavelmente ser rapidamente testada diretamente em seres humanos, sem a necessidade de extensas avaliações de segurança preliminares.

Tendo em conta este valor potencial, testamos uma ampla coleção de medicamentos aprovados doseados em combinação com quimioterapia em modelos de câncer de xenotransplante de rato. Enquanto a nossa estratégia de rastreio e validação imparcial identificados drogas aprovadas com potencial de combinação de quimioterapia, provavelmente seriam necessários estudos mecanicistas e regulamentares adicionais antes de estes agentes puderam ser avaliadas em ensaios clínicos.

Materiais e Métodos

Animal xenoenxerto Estudos

ratinhos nus atímicos fêmea de 9 semanas de idade (Crl: nU (NCR) –

Foxn1nu

, Charles River) mantidos em ciclo de luz padrão e alimentada

ad libitum

água e NIH 31 dieta foram utilizados para os estudos. xenoenxertos de tumor foram iniciadas pela implantação de 1 mm

3 fragmentos de tumor de xenoenxerto de tecido fonte mantido por transplante em série. O crescimento do tumor foi monitorizado como o tamanho médio aproximou-se do intervalo alvo de 80 a 120 milímetros

3, e os animais foram, então, subsequentemente randomizados para grupos de tratamento. Os tumores foram medidos em duas dimensões usando pinças, e o volume foi calculado utilizando as fórmulas padrão.

A temozolomida foi administrado por via oral, uma vez por dia durante os primeiros cinco dias do estudo. Tratamentos combinados foram administrados uma vez por dia usando a rota indicada e formulação; . Drogas experimentais foram tratados durante e após a administração de temozolomida para identificar efeitos de sensibilização, tanto simultânea e acompanhamento sobre a exposição

Todos pecuária, tratamentos e cuidados veterinários foram realizadas por pessoal treinado em instalações AAALAC credenciados; protocolos e condução do estudo foram sujeitos a IACUC revisão e aprovação pelo Charles River.

Métodos Estatísticos, Apresentação de estimativas de potência

Para capturar os dados de tempo-curso de estudos de xenotransplante, foram empregados log-rank Mantel análise de sobrevivência-COX, onde cutoff sobrevivência foi definida pelo surgimento de uma carga tumoral específico sobre estudo. Na sequência de análises de estudos-piloto, determinamos que um 500 milímetros

3 tumor volume de corte capturado adequadamente os efeitos terapêuticos da dose aumentada de temozolomida. Log-rank qui-quadrado foi usado para calcular e informar testes de significância; tamanhos de efeito são relatados como razões de risco de Mantel-Haenzel, onde uma proporção de protecção reflecte a capacidade do tratamento experimental para atrasar ou prevenir a progressão do tumor para além de 500 mm

3. Como discutido no resultado, a escolha de pontos de corte maiores do que este limiar não influenciou significativamente os resultados. 1.000 milímetros

3 foram um pouco mais variável, com efeitos afetam sistemáticos sobre precisão estatística dentro e entre os grupos; o crescimento em 500 mm

3 apareceu mais homogênea.

Para o rastreio, normalmente 10 animais foram designados para receber 5 mg /kg em monoterapia temozolomida, enquanto mais frequentemente 5 animais foram designados para tratamento de combinação. Os cálculos de energia indicada neste desenho do estudo foi adequado para discernir uma redução de 2,6 vezes no risco de taxa de sobrevivência, com poder de 80% ao nível de significância de 0,05 (usando fórmulas derivados contidos: https://www.cct.cuhk.edu. hk /stat /sobrevivência /Rubinstein1981.htm). Como discutido abaixo, o impacto prático de descobrir tamanhos do efeito desta magnitude rendeu observações onde a combinação experimental desde adicionados eficácia equivalente a um aumento de 2 vezes na dose de temozolomida. Em uma outra luz, a nossa abordagem é uma loucura que normalmente produzem o seguinte: enquanto todos os 10 animais tratados com monoterapia temozolomida alcançado fardos tumor além de 500 mm

3 prazo de 15 dias, as batidas de tela significativas puderam ser identificados quando não mais do que 1 de 5 animais em a combinação coorte tinha uma carga tumoral mais de 500 mm

3 após 30 dias de tratamento e acompanhamento.

Repurposing Biblioteca

a lista de candidatos de medicamentos aprovados foi compilado a partir drugbank [ ,,,0],6], a Therapeutic Targets banco de dados [7], e do manual Merck de Diagnóstico e terapêutica. Após as avaliações de custo e disponibilidade, os estoques compostos à escala grama foram provisionados de vários fornecedores. fórmulas e vias adequadas para a administração crónica de doses foram identificados por pesquisa bibliográfica. metas e mecanismos de drogas foram consultados contra a última edição do alvos terapêuticos banco de dados. Até à data, TTD categoriza 364 alvos como “bem sucedido”, tendo sido alvo de drogas aprovadas. Nosso conjunto experimental foi mapeado para 124 alvos bem sucedido, ou cobertura de aproximadamente 35%. Nossa estimativa de cobertura é conservadora, como nós ignorado as relações um-para-muitos para drogas que mapeados para alvos múltiplos; múltiplos alvos de qualquer droga não foram contados duas vezes, se pelo menos um dos vários alvos de uma droga foi redundante alvo de uma outra droga.

temozolomida /Candesartan PK Interaction Estudo

Radio-isótopo marcado temozolomida ( 4-metil-

14C-5-oxo- 2,3,4,6,8-pentazabicyclo [4.3.0] nona-2,7,9-triene- 9-carboxamida) foi sintetizado (Moravek) tal que contagem de cintilação poderia avaliar o seguinte: composto intacto; metabolitos activos; bem como aductos covalentes conhecido para ser formada a seguir metabolismo reactivo de temozolomida em tecidos-alvo [8]

Dose experiências de interacção foram realizados em ratinhos nus do sexo feminino que carregam xenoenxertos U87MG fragmento de tumor, como descrito acima.; animais tinha a carga de tumor de ~ 400 mm

3 na altura da dosagem. Os ratinhos foram administrados i.p., quer de veículo ou candesartan durante um dia anterior dosagem combinação com C14-temozolomida. No dia seguinte, uma dose de 5 mg /kg de C14-temozolomida era administrada por via oral isoladamente ou imediatamente após uma dose de 10 mg /kg por injecção i.p. candesartan administração.

Nos pontos de tempo indicado, os tecidos foram coletadas e avaliadas para distribuição de rádio-isótopo por métodos cintilográficos padrão.

Combinação estudo de tolerabilidade

8-10 semanas de idade, masculinos saudáveis ​​C57BL /6J foram administrados quer sozinhos temozolomida a 25 mg /kg, ou em conjunto com agentes de combinação com as vias e doses indicadas. Após seis dias de combinação de doseamento, a administração de temozolomida foi interrompido, enquanto que os agentes de associação foram administrados durante mais 4 dias. Os animais foram sacrificados nos pontos de tempo indicados, e amostras de sangue foram analisadas para os parâmetros do hemograma, utilizando métodos hematológicos padrão.

Estudo de Resposta de Dose Faixa de Informação de fundo

de prescrição rótulos de informação foram usados ​​para guiar a dose selecção para estudos de resposta à dose-gama

para o risedronato (nome comercial: Actonel [9])., não clínicos estudos carcionogenicity 80 semanas foram realizados em ratinhos com 32 mg /kg /dia. Usando normalização área de superfície corporal, o rótulo estima esta é o equivalente de dose de 6,5 vezes a dose máxima diária recomendada em seres humanos (30 mg /dia), o qual é indicado para utilização na doença de Paget. Portanto, o nível de triagem e verificação de topo de dose-gama nas nossas experiências com ratos de 7,5 mg /kg /dia é apenas ligeiramente acima da dose diária máxima recomendada humano (MHRD), com base na área de superfície corporal normalização. A dose mais baixa do rato testado, 1,5 mg /kg /dia, é substancialmente equivalente à dose diária humana baixa (5 mg /dia), que é recomendado no tratamento da osteoporose

Para candesartan (nome comercial: Atacand [10. ]), não clínicos estudos de carcinogenicidade 104 em ratinhos foram conduzidos a 100 mg /kg /dia. A etiqueta Atacand estima que esta dose provocou exposições sistémicas em ratos (com base no AUC) que eram aproximadamente 7 vezes superiores às obtidas nos seres humanos após a administração do MHRD, 32 mg /dia. Portanto, o nível de triagem e verificação de topo de dose-gama nas nossas experiências com ratos de 10 mg /kg /dia foram provavelmente acima da MHRD, numa base exposição AUC normalizada, sobretudo tendo em conta a dosagem inicial por via i.p., p.o., em vez de rota. experiências com ratos em 2,5 mg /kg /dia por via oral deve ser em grande parte reflexo da baixa dose de entrada indicada para uso em adultos hipertensos (8 mg /dia)

Para terbinafina. (nome comercial: Lamisil [11]), os estudos de carcinogenicidade em ratos de 28 meses foram realizadas em 69 mg /kg /dia; esta dose é indicado para ser 2 vezes a MHRD, com base em comparações de exposição AUC. Nossos estudos de rastreio e da dose de gama em i.p. ratos usados administração, sugerindo o dia kg de dose de 50 mg //por esta via é provavelmente bem acima do equivalente MHRD, dado que a droga exibe biodisponibilidade modesta em várias espécies [12], [13]. Em apoio a esta, de 50 mg /kg, em doses orais ratinhos foram mostradas anteriormente para provocar concentrações sistémicas de pico na ordem de 1 ug /mL de [14], que é equivalente à Cmax observada em seres humanos após uma dose de 250 mg. Nós não perseguir um estudo para definição da dose oral de-gama em nossos modelos do rato, dadas as respostas pobres observado após a titulação da dose por injecção i.p. rota.

Resultados

Nós projetamos uma estratégia de teste experimental encenada, a fim de rastrear, confirmar e validar medicamentos aprovados que podem ter actividade potencial como agentes quimioterápicos combinados (Figura 1A). Primeiro, tentou uma tela relativamente rápida de eficácia primário usando números baixos de origem animal (normalmente 10 controle e 5 animais experimentais por combinação), testando cada composto com uma dose única. visitas promissoras a partir do ecrã primário foram re-testado no mesmo modelo para avaliar a reprodutibilidade. sucessos reprodutíveis foram próxima testado em dois modelos de xenotransplante adicionais para testar se os resultados foram generalizados. Vários compostos foram testados em estudos de dose-resposta, bem como estudos-piloto adicionais com vista a caracterizar a possível actividade mecanicista por trás de cada batida. Em última análise, o nosso esquema de testes (Figura 1A) foi desenhado para identificar compostos que demonstraram reprodutível farmacologia, robusta digno de tradução rápida em ambientes clínicos.

A. funil de testes experimentais. medicamentos aprovados foram identificados e re-confirmado em um modelo de triagem. Visitas foram ainda testados modelos complementares, e caracterizada em estudos-piloto de farmacologia. B. U87-MG Triagem Modelo de Design e Caracterização. Em experiências de dose para determinação de gama, o nível de dose de 5 mg /kg de temozolomida foi escolhida como a dose eficaz que parcialmente utilizada em estudos de associação subsequentes. C. apresentação do ecrã primário. As taxas de risco de drogas aprovadas em análise de sobrevivência (500 mm

3 tumor fardo de corte) são representados pela classificação. estimativas de confiança de dois lados são mostrados, com sucessos significativos (N = 12, Tabela 1) destacada em vermelho. D. Hit análise da taxa. tamanhos de efeito análise de sobrevivência observado experimentalmente (q) são plotados contra a distribuição qui-quadrado; a estatística de Kolmogorov-Smirnov confirma a null, que cada derivam da mesma distribuição subjacente.

Nós estabelecemos um sistema modelo e coleta de composto para examinar uma ampla gama de farmacologia em um ambiente clinicamente relevante. Estamos focados em glioblastoma como uma doença de ajuste com alta necessidade clínica não satisfeita. A nossa pesquisa primária foi realizada na linha celular de cancro humano U87-MG glioblastoma derivado; xenotransplantes desta linha foram desenvolvidos utilizando fragmento de tumor métodos de passagem serial. Nós confirmamos este modelo foi responsivo a um quimioterápico padrão de atendimento para glioblastoma; a temozolomida drogas de alquilação induziu respostas tumorais completas na maioria dos animais a uma dose de 100 mg /kg. Com base em estudos farmacológicos anteriores, nota-se o modelo U87-MG parece relativamente ao tratamento de refractário: exposições obtidos próxima da dose de resposta completa (AUC

0-inf ~125 ug * h /mL, dados não mostrados) provavelmente excedidos os obtidos em seres humanos quando seguindo as directrizes de dosagem padrão (AUC

0-inf ~ 20 ug * h /mL).

Nós reuniu uma coleção composto diversificado para testar a maioria dos mecanismos farmacológicos alvo de medicamentos actualmente aprovados. alvo os cerca de 1.200 medicamentos prescritos provavelmente há mais de 300 mecanismos farmacológicos únicas [15], [16] -que estimar nossa biblioteca selecionada de 182 compostos recapitula cerca de 35% por cento da farmacologia alvejado pela farmacopéia humana (métodos). Em termos práticos, nos baseamos na literatura publicada para ajudar escolheu doses e formulações de drogas. Fundamentalmente, os níveis de dosagem e vias de administração foram selecionados para obter exposições de drogas perto ou além daqueles conseguido usando doses que são máximas toleradas em humanos (Tabela S1 S1 Arquivo). Em suma, temos seguido uma estratégia de “ganancioso”, que primeiro investigou os efeitos supra-farmacológico no modo de rastreio, seguido de validação hit em exposições mais perto a situação no uso clínico diário.

Várias descobertas notáveis ​​pôde ser observado durante a nossa principal tela eficácia do composto 182 definida no modelo U87-MG (Figura 1C, Tabela S1 S1 do ficheiro). Em primeiro lugar, utilizando métodos experimentais que eram tecnicamente viável e razoavelmente recurso efetivo, pudemos observar que a temozolomida e drogas aprovadas mostrou eficácia combinação durante períodos relativamente high-throughput screening. Doze acessos primários foram identificados que atrasou o tempo necessário para atingir a carga de tumor palpável em animais tratados (Tabela 1). Estes acertos exibiram eficácia em combinação com temozolomida amplamente comparável ao que poderia ser obtido através da duplicação da dose terapêutica de temozolomida (Figura 1C, Métodos). Os resultados foram reprodutíveis: em 10 de 11 experiências, uma dose activa de temozolomida (100 mg /kg) era altamente significativamente diferente da dose moderada (5 mg /kg), usado em testes de combinação, e mostraram discriminação estatística modesta no estudo restante (dados não mostrados). Encorajadoramente, os agentes quimioterapêuticos conhecidos e docetaxel etoposido mostrou eficácia em combinação com temozolomida (Tabela 1). Além disso, a taxa de acerto primária global (6,6%) não pareceu excessivamente elevada, o que poderia sugerir efeitos inadequados devido à variabilidade experimental. Ao mesmo tempo, a taxa de acerto apareceu suficientemente diferente de zero, o que sugere a nossa abordagem pode discriminar visitas, embora não sendo excessivamente restritivo. Em suma, nossa tela de redirecionamento primário confirma uma expectativa razoavelmente previsível: no total, medicamentos aprovados não provocar efeitos anti-câncer, enquanto uma modesta coleção de drogas podem apresentar farmacologia útil em combinação com quimioterapia padrão (Figura 1D)

Realizamos estudos de confirmação por 33 drogas a partir da tela principal que não eram conhecidos quimioterápicos (Figura S1). Oito dos onze (73%) os candidatos que exibiram significância estatística no ecrã primário foram confirmados num segundo teste. Também consultado 22 medicamentos adicionais que não apresentaram significância inicialmente. Como antecipado, menos (3 de 22; 14%) destes agentes demonstraram eficácia no ecrã secundário se eram negativos no ecrã primário, o que sugere um outro grau de validação para a nossa abordagem experimental. Como um passo adicional de confirmação, que doseada oito dos acessos primários na ausência de temozolomida (Figura S1). Como seria de esperar, nenhum destes medicamentos seguros mostraram efeitos anti-câncer primário, sugerindo novamente que a nossa tela revelou novos medicamentos com potenciais efeitos anti-tumorais apenas no fundo da quimioterapia padrão.

Nós ainda validado 15 confirmados acertos em dois modelos de xenoenxerto adicionais: o melanoma A375 e SF295 glioblastoma linhas de cancro humanos (Métodos complementares, Figura 2). Seis drogas demonstraram actividade em um destes modelos ortogonais quando administrado em combinação com a temozolomida. Em resumo, a nossa estratégia de rastreio parece ter descoberto várias drogas que exibem

atividade bona fide

com a temozolomida agente alquilante em vários tipos de tumor.

A. Hit validação em modelos adicionais. Seleccionados visitas de rastreio primário foram testados em combinação com doses sub-eficazes de temozolomida em um modelo de modelos de xenoenxerto de glioblastoma e melanoma. Para avaliar os efeitos farmacológicos terbinafina foi doseada p.o. no modelo A375 em um intervalo de dose cinco vezes maior do que a sua dose de rastreio administrados por injecção i.p. rota. Nas comparações de tela principal, o risedronato foi significativa pela análise de sobrevivência em um cut-off de 1.000 milímetros

3, mas não 500 milímetros

3. combinações de medicamentos B. Hipertensão. As drogas foram administradas em combinação, no modelo U87-MG, com a dose no ecrã primário, ou como indicado em materiais suplementares. Efeitos sobre o crescimento do tumor foram avaliados no dia 20 do estudo. Significa mais SEM mostrado (N = 10); candesartan e temozolomida 100 mg /kg significativa pela M-ANOVA a p . 0,05

Fornecido com algum grau de confiança, procurou-se caracterizar ainda mais os nossos sucessos resultantes. Devido à sua imparcial, natureza empírica, nossa tela deve revelar efeitos anti-câncer causados ​​por uma diversidade de fatores. Em primeiro lugar, combinação de fármacos podia modular a actividade intrínseca da temozolomida, pelo que afectam tanto a sua actividade primária de alkalation ADN, ou modificando as respostas consequentes danos de ADN, incluindo a paragem do ciclo celular e apoptose. Da mesma forma, a temozolomida e alquilação do DNA induzido poderia, de forma neomorphic, converta a sinalização induzida por uma combinação de drogas em sinais de crescimento celular ou sobrevivência de células novas. Além disso, qualquer e todas estas situações pode ser o resultado quer de células autónoma ou não-celulares processos autónomos: os dois agentes em conjunto poderia ter como alvo uma célula de cancro isolado, ou induzir sinalização autócrina ou parácrina para, finalmente, causar o crescimento do tumor reduzido e sobrevivência. Nós exploramos alguns possíveis mecanismos de eficácia para um fármaco candidato de interesse, o candesartan bloqueador do receptor de angiotensina II.

Primeiro, avaliamos se concomitante dosagem candesartan simplesmente alterou a farmacocinética primárias de temozolomida [17], [18 ]. Encontramos candesartan não alterou significativamente a biodistribuição de temozolomida em vários tecidos, sugerindo que este candidato repurposing não mediar os seus efeitos apenas por meio de interações metabolismo de fármacos (Tabela S2 no arquivo S1). Além disso, testou-se o candesartan aumentaram directamente a toxicidade celular de temozolomida em células U87MG cultivadas. Uma proporção fixa (1-a-2,4) foi empregue combinação, a partir de concentrações de 40 uM suprapharmacologic temozolomida e 16,7 uM de candesartan, respectivamente. Do outro lado estas concentrações, observamos limitado

in-vitro potência

de candesartan combinação e temozolomida (Figura S2), e, portanto, voltou-se para

in vivo modelos

para explorar a natureza desta farmacológico interação.

em seguida, avaliou a forma como outros medicamentos com mecanismos farmacológicos semelhantes iria realizar no modelo de triagem U87MG primário. Curiosamente, verificou-se que múltiplos angiotensina II fármacos inibidores do receptor ( “-artans”) foram também eficazes em combinação com temozolomida (Figura 2b). Além disso, medicamentos adicionais, tais como o inibidor da renina aliskerin, bem como bloqueadores de canais de cálcio (amlodipina) e inibidores da ACE (enalapril) também apareceu marginalmente eficazes. Estes resultados sugerem várias conclusões interessantes: 1.) nossos resultados de tela principal pode ser confirmado com fármacos que actuam via mecanismos de acção semelhantes 2.) um farmacóforo desconhecido alvo de vários andaimes inibidores-receptor de angiotensina II podem possuir farmacologia anti-câncer 3.)

in-vivo

telas podem revelar a atividade biológica complexa nas vias que podem ser inibidas por diversas drogas.

por fim, avaliou-se a combinação de candesartan /temozolomida causou toxicidade especificamente em tecidos de câncer, ou mais geralmente alterada a margem farmacológico da temozolomida. Observou-se que, em doses elevadas, combinação candesartan diminuição de linfócitos e contagens de glóbulos vermelhos; estes são dois eventos adversos que limitam a dose que afectam a utilização aprovada do temozolomida nos seres humanos (Tabela S3 no ficheiro S1). Além disso, notou-se que doses elevadas de candesartan agravada perda de peso e outros sinais constitucionais deficiência de saúde em ratinhos quando administrado em combinação (dados não mostrados). Estes achados sugerem duas conclusões. Em primeiro lugar, enquanto a eficácia adicional conferida pela adição de candesartan pode ser desejável, a combinação pode também aumentar a eventos adversos, resultando num perfil de risco-benefício em grande parte inalterada de temozolomida isoladamente dosagem. Em segundo lugar, a farmacologia mecanicista subjacente nossos resultados é provável complexa: candesartan pode alterar tanto fatores intrínsecos e secretados que causam diminuição da viabilidade tanto em uma célula-autônoma, e não célula autónoma, moda, pois isso poderá levar ao câncer suboptimal alvo. Embora fora do âmbito da investigação relatamos aqui, é provável que os estudos pré-clínicos adicionais podem provar que nossa tela revelou oportunidades terapêuticas novas e desejáveis.

Enquanto estudo mecanicista de nossos sucessos de triagem pode ser útil, ele também poderia ser preferível para validar os candidatos directamente através de testes clínicos. Para traduzir rapidamente os nossos achados, manteve-se necessário demonstrar a eficácia em exposições de drogas mais perto o que é alcançado no uso humano todos os dias. Foram utilizados os rótulos de prescrição para candesartan, a terbinafina antifúngica, eo risedrontate bisfosfonato para selecionar uma gama de doses orais para testar o modelo U87MG (métodos). Em comparação com os nossos esforços de rastreio em doses máximas toleradas, a eficácia de cada uma destas drogas diminuiu para níveis insignificantes como cada um foi testado mais perto doses equivalentes para rotular-aprovado (Figura 3). Em termos gerais, estes resultados implicam que os estudos de segurança adicionais, tanto sozinho e em combinação com, possivelmente, a temozolomida, são necessários para que estes candidatos de droga pode ser testada em pacientes de cancro humanos.

. confirmação intervalo de dose candesartan no modelo U87-MG. Candesartan foi confirmado na sua dose triagem e rota; a eficácia diminuiu após a administração oral perto e abaixo da dose equivalente indicado MTD de 14,3 mg /kg. B. risedronato confirmação intervalo de doses. O risedronato de combinação exibiram efeitos modestos quando administrado oralmente a 7,5 mg /kg, que perto MHRDD dose equivalente de 5 mg /kg (comparar com o resultado da tela a 15 mg /kg, i.p.). A tendência de exposição a uma dose era modesto, e apareceu equivalente em doses ligeiramente abaixo de 5 mg /kg. C. terbinafina dose de confirmação de gama. A terbinafina foi testada por injecção i.p. administração. A eficácia diminuída como fármaco foi administrado a seguir a dose humana equivalente de 4 mg /kg. Grupo significa mostrado; coorte SEM não mostrado para maior clareza.

Discussão

Várias conclusões importantes são sugeridas pelos nossos esforços para descobrir candidatos Repurposing drogas em câncer. Em primeiro lugar, apesar de sua complexidade, o

in-vivo

estudos que realizamos pode identificar vários novos candidatos a fármacos pela triagem descoberta de base ampla em muitas dezenas, se não centenas, de compostos. A farmacologia visitas de exposição que parece consistente e reproduzível em vários sistemas modelo, e pode sugerir estrutura-actividade e da via de relacionamentos que eram previamente desconhecido e inesperado.

O nosso princípio de motivação na realização direta in vivo, ao contrário primária combinação de triagem celular, era descobrir atividades de drogas em complexos, contextos multicelulares que são difíceis de modelar utilizando sistemas in-vitro. Encorajador, nota-se que recentemente, grupos adicionais foram amplamente confirmada nossas descobertas sobre a interação entre a inibição da angiotensina e quimioterapia. Os autores propõem um modo-de-ação vasculogénese envolvendo complexos no tecido do estroma tumoral complexo [19]. Um ensaio clínico em curso (NCT01821729) pode confirmar ainda mais o potencial terapêutico da farmacologia complexo descoberto em nossas telas.

Apesar destas vantagens de telas in vivo, notamos também várias limitações importantes. Mais importante ainda, presume-se que as telas Repurposing identificar drogas que podem ser rapidamente testadas para eficácia em ensaios clínicos. Até à data, os nossos esforços só têm rendido candidatos que exigiria extensas estudos de segurança pré-clínica e clínica antes eficácia poderia ser testado em pacientes. Enquanto isto pode parecer ser a consequência provável de nossas telas primárias “gananciosas” que testaram doses quase máxima tolerada, destacamos um risco inverso: parece provável a taxa de acerto de tela principal teria diminuído a trivial ou níveis próximos de zero, teve avaliou doses mais baixas inicialmente.

Tomado no contexto, sugerimos que in-vivo da adaptação dos ecrãs no fundo da terapia do cancro pode ser relativamente recursos ineficientes. Como pano de fundo, este estudo reflete o trabalho de vários membros da equipe que contribuíram esforços significativos ao longo de aproximadamente 18 meses. Tomado de um ponto de vista tanto fundos comprometidos ou esforço coletivo, o projeto consumiu recursos em grande parte equivalentes às exigidas para a transição de um único romance de droga a partir de estudos de segurança pré-clínica e clínica, em estudos de eficácia em pacientes com câncer. Descobrimos romance farmacologia com uso potencial para o tratamento do câncer, mas também reconhece que o equilíbrio entre o esforço eo valor de reaproveitamento telas em relação a outras prioridades de investigação poderia revelar-se difícil em toda a comunidade de pesquisa do câncer em geral.

Informações de Apoio

Figura S1.

monoterapia eficácia do candidato bate em xenoenxertos U87-MG. Os compostos foram administrados na mesma dose e via empregue durante o rastreio primário. As medições do tumor foram avaliados no dia 16. meio do Grupo são mostrados; de erro é SEM, N = 8-10

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101708.s001

(PPTX)

Figura S2.

efeitos combinados modestas de temozolomida e candesartan em células U87MG in-vitro. as células U87MG foram cultivadas em condições padrão (DMEM com FBS a 10%), e expostos durante 72 horas com os compostos a várias concentrações. A maior concentração de temozolomida empregue foi de 300 uM, pelo menos, um registo acima concentrações terapêuticas médias observadas durante a administração clínica. Candesartan foi testada a concentração varia tão alto quanto 16,7 uM, mais uma vez muito além exposições de drogas terapêuticas. Os compostos foram combinados a uma proporção de dosagem fixa de 2,4 a 1 (por exemplo, 40 uM de temozolomida para 16,7 uM candesartan). A cisplatina foi utilizada como um composto de controlo citotóxico, em concentrações a partir de 100 uM. A viabilidade celular foi avaliada utilizando métodos colorimétricos (MTS ensaios). Temozolomida mostrou efeitos menores na viabilidade U87MG até 300 uM in vitro. A adição de candesartan até 16,7 uM não potente potenciar o tratamento com até 40 uM temozolomida, em comparação com a cisplatina, o que induziu a inibição proeminente da viabilidade celular

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101708.s002

( PPTX)

arquivo S1.

Tabelas S1-S3. Tabela S1. Biblioteca Cancer Phenix. Fornecido como arquivo do Excel em materiais suplementares on-line. Tabela S2. Estudos de confirmação no modelo de xenoenxerto U87MG. Os ratinhos portadores U87-MG foram doseados com temozolomida em combinação com os agentes listados. Análise de sobrevivência foi realizada como descrito; métricas são fornecidos para efeitos de comparação. Tabela S3. alterações hematopoiéticas por candesartan em combinação com a temozolomida. C57BLJ6 ratos foram doseados com temozolomida, com ou sem o candesartan nas doses e vias indicadas. Amostras de sangue foram coletadas para análise completa de sangue contagem de hematologia. parâmetros inalterados não são mostrados; populações de células que mostram alterações significativas (em itálico) em vários grupos de dose são apresentados abaixo. * P 0,05 com ANOVA, teste de post-hoc de Dunnett. Os valores mostrados são grupo média (EPM), n = 10.

doi: 10.1371 /journal.pone.0101708.s003

(DOCX)

Agradecimentos

Os autores agradecem aos