Abstract

A fim de compreender os mecanismos moleculares de Bifidobacterium infantis timidina quinase /nucleosídeo ganciclovir analógico (BI-TK /GCV) sistema de tratamento que foi provado que exibem actividade de crescimento anti-tumoral sustentável e induz a apoptose no cancro da bexiga, uma abordagem proteómica de etiquetas isobáricas para relativa e absoluta quantificação (iTRAQ), seguido por cromatografia líquida-espectrometria de massa foi usado (LC-MS /MS). 192 sub-regulada e 210 proteínas sobre-regulada foram identificados após o tratamento com o sistema de BI-TK /GCV em Sprague-Dawley (SD) ratos. análise de Western blot e imunohistoquímica confirmou que Peroxirredoxina-I (Prx-I) foi significativamente regulada no cancro da bexiga após o tratamento. Prx-I silenciamento por transfecção de Prx-I shRNA crescimento significativamente suprimido, promovidos apoptose e regulados do ciclo celular em células T24 e reduziu a fosfo-NF-kB p50 e proteína p65 expressão que revelou as ligações entre Prx-I e de NF-kB via implicada por análise de caminho Ingenuity (IPA). Estas descobertas produzir novos insights sobre a terapia de câncer de bexiga, revelando Prx-I como um novo alvo terapêutico e indicando BI-TK /sistema de GCV como uma terapia potencial por down-regulação da Prx-I através de NF-kB via de sinalização.

Citation: Jiang L, Xiao X, Ren J, Tang Y, Weng H, Yang Q, et al. (2014) proteômica Análise de cancro da bexiga Indica Prx-I como uma molécula chave no BI-TK /Sistema de Tratamento de GCV. PLoS ONE 9 (6): e98764. doi: 10.1371 /journal.pone.0098764

editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de dezembro de 2013; Aceito: 06 de maio de 2014; Publicação: 06 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela bolsa de pesquisa da Fundação Natural Científico da China (No. 81.072.087 /H1619). O URL para o National Natural Science Foundation da China: https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/default.htm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de bexiga é o câncer urológico mais comum em. Ásia e seu manejo clínico é extremamente caro [1]. Em 2014, são esperados cerca de 74.690 novos casos de câncer de bexiga de ser diagnosticada, e cerca de 15.580 deles vai morrer [2]. O cancro da bexiga pode ser dividido em dois subtipos principais clínicos e patológicos: tipo não-invasiva do músculo superficial e tipo músculo-invasiva avançada [3]. Em geral, o cancro da bexiga superficial é tratado com ressecção endoscópica com prognóstico favorável, mas, por vezes, se repete com a progressão de grau [4]. A gestão do cancro da bexiga avançado é um grande desafio, e estes pacientes têm um prognóstico menos favorável, com uma taxa de sobrevivência muito baixa em 5 anos; portanto, as opções terapêuticas mais agressivas são necessárias, como cistectomia radical e desvio urinário [5]. Além disso, o câncer de bexiga especialmente o tipo avançado ocorrer novamente em um número substancial de pacientes, e até mesmo resultar em morte e, portanto, de preferência abordagens menos agressivas devem ser desenvolvidas para combater a doença.

vírus Herpes simplex timidina cinase (HSV -tk) terapia de gene suicida como uma estratégia mediada amplamente aceite para cancro da bexiga pode converter o ganciclovir análogo de nucleósido não-tóxico (GCV) em uma forma trifosforilado tóxico, que, subsequentemente, provoca a morte de células que se dividem rapidamente [6]. Nós anteriormente recorreram a

Bifidobacterium infantis

(BI), que é uma bactéria de direccionamento tumoral, porque localiza selectivamente e prolifera dentro das regiões de hipoxia de tumores como uma bactéria não patogénico e anaeróbia [7], [8] . Descobrimos que o BI e TK /GCV sistema (BI-TK /GCV) exibiu uma atividade de crescimento sustentável anti-tumor no modelo de cancro da bexiga de roedores in vivo, que envolveu tanto vias intrínseca de apoptose [9].

Num esforço para compreender os mecanismos moleculares subjacentes e identificar a molécula de proteína alvo potencial deste sistema de tratamento seguro e eficaz, recorreu-se a espectrometria de massa (MS) isobáricas etiquetas baseados para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) para se obter diferencial global perfis de proteínas. Além disso, investigou-se a via molecular de Peroxirredoxina-I (Prx-I), uma das proteínas identificadas sub-regulada no cancro da bexiga identificado por iTRAQ após o tratamento com BI-TK /GCV.

Materiais e Métodos

Materiais

O sistema BI-TK /GCV tratamento foi construído com sucesso pelo nosso grupo de pesquisa (Chongqing, China) [9].

animais experimentais

setenta ratos Sprague-Dawley (6-8 semanas de idade, pesando 180-200 g) foram adquiridos de Chongqing Nacional da indústria de base biológica de Centro Experimental animal (China) e alojados sob condição específica livre de patógenos em 23-27 ° C e umidade 55-65% com os ciclos de luz-escuro de 12 h. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo uso e cuidados Comité das University Medical Chongqing o Animal. Um tumor modelo da bexiga de rato foi construído por perfusão de N-metil-nitrosoureia (MNU) (Sigma, EUA). MNU foi diluída para 20 g /L de uma solução tampão de ácido cítrico. Cada bexiga foi perfundida com 0,1 ml de uma vez a cada 2 semanas, para um total de quatro perfusões.

Os estudos in vivo

Sessenta ratos Sprague-Dawley machos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (cada

N

= 15): um grupo de solução salina normal, um grupo BI, um grupo BI /pGEX-1, e um grupo bi-TK. Após a Bifidobacterium foi concentrada, a cerca de 0,5 ml das intervenções correspondentes foi injectado através da veia da cauda (contagem de bactéria, 4,4 × 10

9) uma vez por semana durante 4 semanas. Todos os grupos receberam uma injecção intraperitoneal diária de GCV (50 mg /kg) durante 28 dias. Todos os ratos foram sacrificados, sob anestesia com pentobarbital de sódio. Uma parte dos tecidos de cancro da bexiga dos quatro grupos foram preservadas em parafina para análise imuno-histoquímica (IHC), e o resto dos tecidos foram mantidas a -80 ° C para posterior análise.

preparação de amostra de proteína e rotulagem iTRAQ

Os tecidos foram lisadas num tampão de lise (ureia 7 m, 1 mg /ml de ADNasel, 1 MMNA

3VO

4, e 1 milimetro fenilmetano sulfonylfl uoride, PMSF) e centrifugou-se a 6000 g e 4 ° C durante 30 min. O sobrenadante foi recolhido e o teor total de proteína foi medida utilizando 2D Quantificação Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). Cada uma das amostras foi digerido com 20 ul de solução 0,1 ug /uL de tripsina (Promega, Madison, EUA) a 37 ° C durante a noite e, em seguida, marcada com as marcas iTRAQ como se segue: (i) o grupo solução salina normal, 114 Tag; (Ii) o grupo BI-TK, 115 marcas; (Iii) BI /pGEX-1 grupo, 116 marcas; (Iv) o grupo BI, 117 tags. As amostras marcadas foram reunidas antes de posterior análise.

de permuta catiónica forte (SCX) cromatografia

Para reduzir a complexidade da amostra por cromatograf ia líquida (LC) -MS /MS análise, as amostras foram reunidas diluído 10 vezes com uma SCX tampão a (10 mM KH

2 PO?

4 em 25% de acetonitrilo, pH 3,0) e usado para um 2,1 x 200 milímetros polysulfoethyl uma coluna SCX (PolyLC; Columbia, EUA). A coluna foi eluída com um gradiente de 0-25% de tampão B SCX (10 mM de KH

2 PO?

4, pH 3,0, em acetonitrilo a 25% contendo KCl 350 mM), durante 30 min, seguido por um gradiente de 25- 100% tampão SCX B durante 40 min. Estas fracções foram liofilizadas SCX num concentrador de vácuo e submeteu-se C-18 (100 mg capacidade, Supelco; Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) de limpeza utilizando uma coluna de extracção.

Electropulverização tempo de iões quadrupolo -of-voo MS (ESI-Q-TOF-MS) Análise

MS foi realizada utilizando um nano-LC acoplados em linha para um espectrómetro de massa QStar Elite (Applied Biosystems). O eluente LC foi dirigido a uma fonte de ESI por análise Q-TOF-MS. O espectrómetro de massa foi ajustado para realizar a informação de aquisição dependente (IDA) em modo de ião positivo, com uma gama de massa seleccionada de 300-2,000 m /z. Os péptidos com dois a quatro estados de carga foram selecionadas por espectrometria de massa em tandem, e o tempo de somatório de eventos MS /MS foi ajustado para 3 s. A quantificação relativa de proteínas, em caso de iTRAQ, foi realizada nas varreduras de MS /MS e foi a relação entre as áreas sob os picos a 113, 114, 115, e 116 Da, que eram as massas das marcas que correspondem ao reagentes iTRAQ.

análise proteômica

os processos de bioinformática e função molecular das proteínas identificadas no grupo BI-TK após o tratamento foram classificados pelo sistema de classificação PANTHER (www.pantherdb.org). As vias de proteínas diferencialmente expressos identificados por iTRAQ foram analisados ​​pelo programa de análise de via Engenho (IPA) (https://www.ingenuity.com). No Engenho de software, os dados foram utilizados para extrair redes interactivos entre as proteínas no índice da base dados Proteína Internacional (IPI). Uma rede com uma pontuação superior a 2 é geralmente considerado válido.

Validação por Western blot e IHC

Western blot e IHC foram utilizados para confirmar a expressão de Prx-I. T As amostras de proteína (cerca de 20 mg) foram separados utilizando SDS-PAGE. Após a electroforese de SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF. Subsequentemente, os lisados ​​foram incubados com um anticorpo primário anti-Prx-I monoclonal de coelho (1:1500) (Abcam, EUA). Os sinais imunorreactivas foram detectadas pelo kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Suécia). Os procedimentos foram conduzidos de acordo com as instruções do fabricante. tecidos de cancro da bexiga de quatro grupos foram incubadas durante a noite com anticorpos primários. Os tecidos foram incubados com anticorpos secundários durante 2 h. Os núcleos das células foram contrastadas com hematoxilina. A proporção de células de tumor coradas positivamente foi determinada por Image-Pro Plus (IPP) 6,0 e foi classificada como se segue: 0, negativo; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. A intensidade da imunocoloração foi pontuado como se segue: 0, ausente; 1, amarelo claro; 2, marrom amarelado; 3, marrom. A proteína em tecidos de cancro da bexiga foi avaliada por meio do índice de coloração (SI):.

SI

= proporção × intensidade de células tumorais positivas

Prx-1 Knockdown por shRNA

células T24 foram submetidos a Prx1 knockdown. RNA hairpin curto (shRNA) foi exprssed com sistema de GV102 (GeneChem, China). Os três pares de sequências de sentido e anti- sentido de oligonucleótidos dirigidas Prx1 humana (GeneBank_ID: NM_002574) foram como se segue: PRDX1-RNAi (SH-1) de cadeia de sentido 5′-GATCCCGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (SH-1) cadeia anti-sentido 5’-AGCTATCCAAAAAGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCGG-3 ‘; PRDX1-RNAi (sh-2) sentido vertente 5’-GATCCCGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (sh-2) cadeia anti-sentido 5′- AGCTATCCAAAAAGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCGG-3′; PRDX1-RNAi (sh-3) sentido vertente 5’-GATCCCCCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (sh-3) cadeia anti-sentido 5′- AGCTATCCAAAAACCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGGG-3’.A sequência do alvo Prx-I mexidos foi usado como um negativo controle (con sh). As células T24 foram transientemente transfectadas com os vectores de expressão Prx1-shRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA). células T24 não infectados (parentais) e Prx-I controlar shRNA células infectadas T24 (con sh) também foram utilizados. A maior eficiência de knockdown por vectores shRNA em células T24 foi determinada por quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR). As sequências dos iniciadores para Prx-I foram 5′-AGCCTGTCTGACTACAAAG-3 ‘(para a frente) e 5′-TCTGCCCTATCACTGAAAG-3′ (reverso), que rendeu um produto 104 bp. As sequências dos iniciadores para o GAPDH controle interno foram 5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ‘(para a frente) e 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ (reverso), que rendeu um produto de 110 pb. O valor da expressão Prx-I em comparação com a de GAPDH foi calculada como 2-ΔΔCt. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Em seguida, as manifestações de Prx-I em células T24 derrubado por shRNA foram medidos por transferência Western.

proliferação celular ensaio

Após a transfecção com Prx-I shRNA durante 24 h, as células foram T24 semeadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 4 x 10

3 células, num volume final de 100 poços, e as células não transfectadas ul /foram usadas como controlo. A taxa de proliferação das células foi calculado em pontos de tempo diferentes (24, 48 e 72 h) utilizando células de contagem Kit-8 (CCK-8) (Sigma, EUA). As experiências foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância a 450/630 nm foi medida com um espectrofotómetro Thermo (Waltham, EUA). Calculou-se a absorvância média a partir de seis poços por grupo.

análise de citometria de fluxo

Após a transfecção durante 48 h, as células foram tratadas com tripsina e centrifugou-se a 1500 rpm durante 5 min. As células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS. Depois de coradas com 50 ug /ml de anexina isotiocianato V-fluoresceína (FITC) (BD Biosciences, EUA) e 20 ul de 500 ug /mL de iodeto de propídio (PI) (Sigma, EUA) para a detecção de apoptose, as células foram incubadas no escuro a temperatura ambiente durante 15 minutos e submetido a análise de citometria de fluxo (FACS). Em seguida, as células foram recolhidas, lavadas com PBS, fixadas com etanol a 75% a -20 ° C durante a noite. As células fixadas foram lavadas duas vezes com PBS frio, adicionaram-se 500 uL de solução de ADN de coloração (incluindo 200 ug /ml de RNase A e solução corante iodeto de propídio /ml 20 ug) e incubado durante 30 minutos. Finalmente, as células foram sujeitas a análise do ciclo celular por FACS. Os dados foram analisados ​​e avaliados no programa ModFit (Topsham, EUA).

Efeito da Prx-I em fosfo-NF-kB p50 e p65

A ligação entre Prx-I eo NF-kappa-B (NF-kB) de sinalização complexo tinha sido implicado na via da proteína do IPA. Por conseguinte, a fim de explorar se o efeito de Prx-I em proteínas sinalizadoras apoptóticos era atribuível a inibição do NF-kB, foi avaliada níveis nucleares de fosfo-p50 de NF-kB e de p65 (Abcam, EUA) por transferência de Western.

A análise estatística

Os dados foram expressos como média desvio ± padrão (SD) e comparados através de análise de variância. O nível de diferença significativa foi definida como P 0,05. Todas as análises foram realizadas em SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, EUA) para Windows.

Resultados

Quantificação e identificação de proteínas diferencialmente expressos por iTRAQ

Um total de 2.343 única proteínas foram identificadas com 95% de confiança pelo algoritmo de pesquisa ProteinPilot contra o IPI rato v3.49 banco de dados de proteínas. Um valor de corte rigoroso de uma mudança de 1,3 vezes resultou em um conjunto final de 402 proteínas diferencialmente expressas, incluindo 192 proteínas regulada para baixo e 210 proteínas up-regulamentadas do grupo BI-TK após o tratamento. Surpreendentemente, um romance molécula Prx- I chamou a atenção particular, com uma diminuição de 0,52 vezes no grupo BI-TK versus o grupo de soro fisiológico normal. Um diagrama esquemático de iTRAQ é mostrado na Figura 1A, e o espectro MS /MS de Prx- I (sequência peptídica: VVGDHVEVHAR) é mostrado na Figura 1B. As etiquetas iTRAQ são como se segue: (i) o grupo de soro fisiológico, 114 Tag; (Ii) o grupo BI-TK, 115 marcas; (Iii) o /pGEX-1 grupo BI, 116 marcas; (Iv) o grupo BI, 117 tags. O ID de proteínas em IPI, nome e funções principais com mudanças de abundância são simbolizadas na Tabela S1

A:. Diagrama esquemático mostrando o fluxo de trabalho de iTRAQ. B: espectro MS /MS mostrando os péptidos de Prx-I (sequência peptídica: VVGGDHVEVHAR). Os 4 contornos de pico descrevem que os volumes de amostra são os mesmos que garante os resultados são autênticos e confiável.

Bioinformatic análise funcional de proteínas diferencialmente expressos após o tratamento com BI-TK /GCV

Para sondar seus papéis biológicos do efeito curativo da BI-TK /GCV sobre o cancro da bexiga, as proteínas diferencialmente expressos foram categorizados em vários processos e classes de função com base no sistema de classificação PANTHER. Na análise processo biológico, a maior proporção de proteínas diferencialmente expressas estava no processo metabólico, seguido por processo celular e processo de comunicação celular (Figura 2A). Notavelmente, as proteínas envolvidas na actividade catalítica, ligação, a actividade estrutural molécula, a actividade da enzima regulador, e a actividade do receptor foram as cinco principais categorias função molecular (Figura 2B). Além disso, proteínas envolvidas na actividade antioxidante foi responsável por 1,3%, respectivamente. A Figura 2C representa os caminhos primários gerados pelo IPA das proteínas expressas diferencialmente. Esta rede marcou 36 e consistiu de 37 proteínas envolvidas na apoptose, estresse oxidativo e metabolismo. Em particular, Prx-I, a proteína marcada para baixo-expressa após o tratamento, está directamente relacionada com o factor de transcrição NF-kappa-B (NF-kB) complexa via nesta rede, indicando que Prx-I pode desempenhar um papel importante na apoptose de cancro da bexiga pelo sistema BI-TK /GCV em parte através da via de sinalização de NF-kB.

classificação PANTHER de proteínas com base no processo (a) Biológica ea função molecular (B). (C) interplaying rede de proteínas com a mudança abundância gerada pela análise de caminho Ingenuity (IPA). A rede implícita a ligação de Prx-I e NF-kB complexa.

Validação de Prx-I por Western blot e IHC

Os níveis de Prx- expressão diferencial I, identificados por iTRAQ abordagem foram validados por Western blot (Figura 3A). Em comparação com o grupo de soro fisiológico normal, a expressão de Prx-I é regulada negativamente nos outros três grupos (especialmente no grupo bi-TK), o qual é semelhante aos resultados obtidos por iTRAQ. Além disso, a expressão Prx-I nos tecidos do tumor foi verificada por análise de IHC (Figura 3B). O teor de Prx-I em células cancerosas da bexiga de grupo bi-TK foi significativamente menor do que nos outros grupos (p 0,05, Figura 3B)., O que é consistente com os resultados obtidos por iTRAQ e Western blot

A: Expressões de Prx-I em quatro grupos por análise de Western blot. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. B: Imagens representativas que mostram a imunoexpressão da Prx-I em tecidos tumorais de quatro grupos. Em comparação com o grupo de soro fisiológico normal, a expressão de Prx-I é regulada negativamente nos outros três grupos (especialmente no grupo bi-TK), o qual é semelhante aos resultados obtidos por iTRAQ. (Asterisco (*) indica P 0,05 no grupo BI-TK contra o grupo solução salina normal)

qPCR e Western blot para a eficiência interferindo em células T24

Primeiro, o Prx- I os níveis de mRNA de quatro vectores shRNA transfectadas durante 48 h nas linhas de células T24 foram medidos por qPCR utilizando Lipofectamine 2000. a expressão Prx-I diminuiu em ~ 40%, 26%, 18% e 1% em SH-1, SH -2, grupos SH-3 e con sh, respectivamente, comparado com o grupo dos pais (Figura 4A). Para confirmar esta eficiência de interferência, os níveis de expressão de proteína de Prx-I em células T24 após a transfecção foram analisados ​​por Western blot. Os resultados mostraram que os níveis de Prx-I diminuiu significativamente por ~48%, 30%, 18% e 3% do valor basal na sh-1, sh-2, SH-3 e con sh grupos, respectivamente (Figura 4B), indicando que a maior eficiência interferir em células T24 foi no grupo SH-1 |

a:. a expressão de ARNm de Prx-I foi analisada por qPCR. GAPDH serviu como um controlo interno. B: Os níveis de proteína Prx-I foram analisados ​​por Western blot após a transfecção. Sh-1 tratamento levou a uma redução significativa na expressão da proteína Prx-I em células T-24. (Asterisco (*) indica P 0,05 em grupo SH-1 versus grupo parental)

Prx-I knockdown crescimento celular inibido

T-24

Os efeitos da Prx-I shRNA transfecção no crescimento celular T24 foram investigados através de ensaios CCK8. Uma ligeira inibição do crescimento foi observada às 24 h após a transfecção. Além disso, foram observados efeitos inibidores evidentes sobre a proliferação celular em Prx-I knockdown células às 48 e 72 horas, em comparação com os grupos pais e con sh (Figura 5, p 0,05), sugerindo que a inibição da Prx-I poderia suprimir o crescimento de células T24 in vitro.

as taxas de crescimento em Prx-I knockdown grupo foi significativamente reduzida, em comparação com os grupos SH dos pais e engodo, medidos pelo ensaio CCK8.

Efeito da PRX-I shRNA transfecção na apoptose e ciclo celular de

células T-24

os efeitos do PRX-I knockdown na apoptose e ciclo celular das células T24 foram investigados. Após 48 h de transfeco, a taxa de apoptose no grupo SH-1 (21,99 ± 1,10%) foi significativamente mais elevada em comparação com o grupo de con shRNA (4,51 ± 0,73%) e o grupo parental (4,96 ± 0,46%) (P 0,05) (Figura 6A). Análise do ciclo celular mostraram que a razão de fase G0 /G1 no grupo SH-1 (61,13 ± 0,50%) foi significativamente mais elevada em comparação com o grupo de con SH (49,62 ± 0,84%) e o grupo parental (48,03 ± 1,17%) (P 0,05) (Figura 6B)

a:. apoptose-I Prx knockdown induzida em células T24. B:. Imagens representativas de análise FACS mostrando parada do ciclo celular G0 /G1-I Prx knockdown induzida em células T24 com uma diminuição correspondente em células em fase S (P 0,05)

Efeito da Prx- I no NF-kB via

Tal como descrito acima, Prx-I está directamente ligado ao complexo NF-kB, que tem sido implicado na via da proteína (Figura 2C). Para explorar a possibilidade de os efeitos de Prx-I por proteínas de sinalização apoptóticas foram atribuíveis a inibição do NF-kB, as formas activadas de p50 fosfo-NF-kB e de p65 foram analisados ​​por Western blot após a transfecção com Prx-I shRNA em células T24. Uma diminuição significativa (P 0 · 05) na expressão de proteínas, tanto a fosfo-NF-kB p50 e p65 foi observada em 1-SH grupo (Figura 7), em comparação com os grupos con sh e parentais, indicando que Prx-I knockdown activação inibiu de P50 de NF-kB e p65 em células T24.

Uma diminuição significativa na expressão de proteínas, tanto a fosfo-p50 de NF-kB e de p65 em grupo SH-1. (Asterisco (*) indica P 0,05 em grupo SH-1 versus grupo parental)

Discussão

Em nosso estudo anterior, BI-TK /GCV foi construído e mostrou-se eficaz em inibindo o crescimento progressivo de tumor da bexiga que estava relacionado com a apoptose in vivo [9], [10], indicando que o BI-TK /GCV foi um sistema de tratamento de sucesso e pode proporcionar uma nova estratégia para o tratamento de cancro avançado da bexiga ou metastático no futuro .

neste estudo, uma abordagem proteômica iTRAQ foi utilizada para identificar proteínas diferencialmente expressas, com o objetivo de revelar os mecanismos moleculares e fornecer suporte teórico para a eficácia do BI-TK sistema /GCV. iTRAQ identificou 402 proteínas diferencialmente expressos em tecidos de cancro da bexiga após o tratamento, incluindo 192 proteínas reprimidos e 210 proteínas regulados positivamente. As proteínas alvo com abundância diferencial (Tabela S1) desempenharam um papel central em vários percursos celulares, incluindo metabolismo, apoptose, actividade antioxidante, do ciclo celular, a proliferação, a transdução de sinal e a adesão celular. Embora o mecanismo exato pelo qual BI-TK /GCV atinge os seus alvos intracelulares não é clara, as proteínas alvo de BI-TK /GCV são supostamente para participar na proliferação e apoptose das células de câncer de bexiga, e fornecer novos alvos para a terapia futuro.

Prx-I destacou-se na nossa análise proteômica, porque raramente havia sido ligada diretamente com cancro da bexiga, embora tenha sido mostrado para baixo-express em tecidos de cancro da bexiga após o tratamento com BI-TK /GCV. A família peroxiredoxina de mamífero (Prx) que consiste em seis proteínas é H

2O

2-scavenging enzimas presentes em células procariotas e eucariotas [11] – [13]. Prx-I pertence à típica-2-Cys e é a isoforma mais abundante e ubiquamente distribuído de PRDX [14], [15], que tem sido estreitamente associadas com a proliferação celular e diferenciação, sinalização redox intracelular, e a apoptose [16] – [19]. PRX-I é altamente expresso em órgãos sólidos e em tecidos de alguns tipos de câncer [20] -, e também está associada positivamente com as taxas de recorrência e progressão do câncer da bexiga [24], [25]. Da mesma forma, Prx-I sobre-expressão está associado com a sobrevivência diminuída em geral, mau resultado clínico, e resistência de células de cancro para a radioterapia e quimioterapia [26] – [28], enquanto que o baixo-expressão de Prx-I por ARNi está associada com desafios terapêuticos para o cancro do fígado, cancro do esófago, e cancro da tiróide [29] – [31]. Na verdade, com base na análise iTRAQ (Tabela S1), transferência de Western (Fig. 3A) e análise de IHC (Fig. 3B), no presente estudo, Prx-I expressão significativamente reduzida em tecidos de cancro da bexiga após o tratamento com BI-TK /GCV , indicando que Prx-I pode contribuir para o efeito de tratamento de BI-TK /GCV sobre o crescimento e anti-pro-apoptose de cancro da bexiga. Knockdown do gene Prx-I por shRNA suprimiu significativamente o crescimento, promoveu apoptose e regulados do ciclo celular em células cancerosas da bexiga (Figura 6, 7). Estes resultados demonstram o papel positivo da Prx-I no desenvolvimento de cancro da bexiga. Presumimos que o sistema de tratamento de BI-TK /GCV é capaz de prevenir o crescimento do tumor e induzir a apoptose no modelo de cancro da bexiga por roedor Prx-I-expressão regular negativamente. Mas o que via de sinalização é através

Felizmente, as ligações entre Prk-I e a sinalização complexo NF-kB têm sido implicados na via da proteína do IPA (Figura 2C), o que nos leva a encontrar a pista . Prxs têm sido implicados como fatores-chave regulamentares em redox sinalização [32] – [34]. Prxs pode saciar o segundo mensageiro H

2O

2 e inibir a transdução de sinal, ativando o metabolismo do H

2O

2. Superoxidação de Prx a partir de um ácido cisteína-Sulfênicos (Cys-SOH) a um ácido ciste�asulf�ico (Cys-SO

2H) pode parar o metabolismo do H

2O

2, permitindo a acumulação de H

2O

2 a concentração e a propagação de sinal de transdução. Redução de Cys-SO2H para Cys-SOH é alcançado através das ações de sulfiredoxin, que restaura Prx mediada H

2O

2 metabolismo [35] – [37]. Prx1 citoplasmática regula H

2O

2 dependente da activação de NF-kB e translocação nuclear, e Prx1 nuclear regulamenta NF-kB /DNA de ligação através da eliminação de H

2O

2 como uma subunidade p50 oxidante [ ,,,0],38]. Prx1 aumenta ciclooxigenase mediada por p65 (COX-2) expressão do gene do receptor de estrogénio em células de cancro da mama humano deficiente (ER) (MDA-MB-231), e knockdown de Prx-I pode atenuar a expressão de COX-2, reduzindo a ocupação de NF -κB no seu elemento promotor a montante, o que indica que Prx-I actua como uma chaperona para aumentar o potencial de transactivação de NF-kappaB em células cancerosas ER-deficiente-mama [39]. Na verdade, no presente estudo, knockdown de Prx-I reduzido expressão de proteínas de fosfo-NF-kB p50 e p65, e, assim, ele suprimiu o crescimento, promoveu apoptose e regulados do ciclo celular de células cancerosas da bexiga através da inibição da via de NF-kB, que conformado com a rede IPA (Figura 2C).

Conclusões

em conjunto, identificamos que Prx-I, juntamente com a via NF-kB contribuiu para o cancro da bexiga, pela primeira vez. O sistema de tratamento de BI-TK /GCV exibiu uma actividade anti-tumoral de crescimento sustentado e a apoptose induzida em tecidos de cancro da bexiga por inibição de I-Prx através da via NF-kB. Nossa pesquisa oferece uma nova visão sobre o tratamento do cancro da bexiga e indica que BI-TK /GCV sistema de tratamento, visando à Prx-I pode ser uma nova estratégia terapêutica no futuro.

Informações de Apoio

Tabela S1.

iTRAQ Análise de proteínas diferencialmente expressos no grupo soro fisiológico normal (iTRAQ 114), grupo bi-TK (iTRAQ 115), /pGEX-1 do grupo BI (iTRAQ 116) e grupo BI (iTRAQ 117)

doi.: 10.1371 /journal.pone.0098764.s001

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