Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo; tempos de sobrevivência são pobres, apesar da terapêutica. O papel do domínio de dois poros K

+ (K2P) canal TASK-1 (KCNK3) no cancro do pulmão é actualmente desconhecido. Descobrimos que TASK-1 é expressa em não-pequenas linhas celulares de cancro do pulmão (NSCLC) a níveis variáveis. Numa altamente TASK-1 que expressa linha de células NSCLC, A549, um pH característico e sensível à hipoxia não-inactivadora K

+ corrente foi medida, indicando a presença de canais TASK-1 funcionais. Inibição de TASK-1 levou a despolarização significativa nestas células. Knockdown de TASK-1 por siARN aumentou significativamente a apoptose e a proliferação reduzida de células A549, mas não em fracamente TASK-1 que expressam as células NCI-H358. Na

+ – juntamente transporte de nutrientes através da membrana celular é funcionalmente acoplado ao efluxo de K

+ via K

+ canais, assim TASK-1 podem potencialmente influenciar Na

+ – juntamente transporte de nutrientes. Em contraste com TASK-1, que não foi diferencialmente expressos em câncer de pulmão vs. tecido pulmonar normal, encontramos o Na

+ – transportadores de nutrientes acoplados,

SLC5A3

,

SLC5A6

, e

SLC38A1

, transportadores para mio-inositol, biotina e glutamina, respectivamente, para ser significativamente sobre-expressa em adenocarcinomas do pulmão. Em resumo, nós mostramos pela primeira vez que o canal TASK-1 regula a apoptose e proliferação em um subconjunto de NSCLC

Citation:. Leithner K, Hirschmugl B, Li Y, Tang B, Papp R, Nagaraj C , et ai. (2016) TASK-1 regula apoptose e proliferação em um subconjunto de células não pequenas do pulmão. PLoS ONE 11 (6): e0157453. doi: 10.1371 /journal.pone.0157453

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos

Recebido: 14 Dezembro, 2015; Aceito: 31 de maio de 2016; Publicação: 13 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Leithner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Para in silico analisa conjuntos de dados de expressão de genes em amostras de adenocarcinoma de pulmão e pulmões normais (GDS3257) publicados na expressão gênica foram usadas Ominbus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Financiamento : o estudo foi apoiado por fundos do Oesterreichische Nationalbank (Fundo de aniversário, número do projeto 12713 para HO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O nosso trabalho foi financiado pelo Oesterreichische Nationalbank (Fundo aniversário, número do projeto 12713). O Oesterreichische Nationalbank não tem quaisquer interesses comerciais associados aos projectos financiados, incluindo o nosso projeto. O Oesterreichische Nationalbank é de propriedade do governo federal da Áustria, e do Fundo de aniversário suporta apenas pesquisa independente de muito diversos campos de pesquisa. Os projetos são analisados ​​por peritos independentes, pesquisadores internacionais (peer-review) e os resultados obtidos não são de qualquer forma utilizada pelo Oesterreichische Nationalbank, nem o Oesterreichische Nationalbank tem qualquer impacto sobre os objectivos dos projectos. Isto não altera a nossa adesão às políticas de PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão para o maior número de mortes por câncer em todo o mundo [1]. Aproximadamente 85% dos cancros do pulmão são os cancros do pulmão não pequenas (NSCLC) e 15% são cancros do pulmão de células pequenas. cancros do pulmão são frequentemente avançado no momento do diagnóstico [1] e sobrevivência é pobre, apesar da terapêutica [2].

K

+ canais têm sido mostrado para ser envolvido em praticamente todas as características de câncer, como a proliferação sustentada , evasão de apoptose e invasão (para revisão ver [3,4]). No total, 77 genes codificam os canais de potássio. Existem quatro classes principais de K

+ canais: tensão fechado K

+ canais,-cálcio activado K

+ canais, oscilo-retificador K

+ canais, e de dois poros domínio K

+ canais (canais K2P) [3]. Enquanto muitos K

+ canais abertos em cima de um gatilho específico, por exemplo, alterações no potencial de membrana, os canais de K2P são constitutivamente activa. Um canal K2P funcional é um dímero de duas subunidades do canal de [5,6]. K2P canais são agrupados em seis subfamílias com base nas suas propriedades estruturais e funcionais. Um dos grupos, a tarefa (relacionados com Twik, sensíveis ao ácido) K

família + canal, compreende os canais K2P ácido e sensíveis ao oxigénio, TASK-1 (codificada pelo gene

KCNK3

), tASK-3 (

KNCK9

) e tASK-5 (

KCNK15

) [5,6]. TASK-5 está estruturalmente relacionado com TASK-1 e TASK-3, mas é eletricamente silenciosa. TASK-1 é único entre os canais iônicos na geração de um retificador-aberto “vazamento” K

+ corrente que é regulada por ambos, um aumento ou diminuição do pH extracelular na faixa fisiológica [5,7]. As propriedades de TASK-3 são semelhantes às TASK-1, no entanto, o pKa para a tarefa-3 correntes é desviado para um nível mais ácido (pH 6,7) [5,7]. Além diferentes funções em neurónios, TASK-1 tem sido mostrado para ser funcionalmente expresso no coração, e para definir o potencial de membrana em repouso e regular o tom em células de músculo liso das artérias pulmonares, intestino, bexiga e [5,7]. Além disso, TASK-1 tem mostrado ser um marcador para o tecido adiposo castanho [8,9].

K2P canais, como o canal TASK-1, fornecem geralmente o efluxo de K

+ a partir de células ao longo do seu gradiente electroquimico. Juntamente com a acção de Na

+ /K

+ – ATPase, K

+ efluxo determina o potencial de membrana em repouso [5,7]. Uma vez que o controlo do potencial de membrana é importante também em células não-excitáveis, v.g. para o controle da entrada de cálcio dependente de voltagem, mas também para o Na

+ – transporte de solutos conduzido, avaliamos se TASK-1 é funcionalmente expressa em células de câncer de pulmão e câncer de pulmão humanos

Materiais e Métodos.

As linhas celulares

O humano NSCLC linhas de células A549 (Cat. No. 300114), A427 e SK-MES-1 (SK-MES (Cat No. 300111.); Cat. No. 300339) foram comprados diretamente do celular linhas de serviço (Eppelheim, Alemanha). As células A549 e A427 foram cultivadas em DMEM /F-12 (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Biowest, Ringmer, Reino Unido) e antibióticos (penicilina e estreptomicina). SK-MES-1 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% FCS e antibióticos. As linhas de células NSCLC humanas NCI-H23 (mais conhecido como H23, número ATCC CRL-5800), NCI-H358 (mais conhecido como H358, número ATCC CRL-5807), e NCI-H441 (mais conhecido como H441, ATCC número HTB-174) foram adquiridos diretamente da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células MOR e células NCI-H460 (mais conhecidos como H460) eram um presente de Martin P. Barr, Instituto de Medicina Molecular, do Hospital St. James e Trinity College Dublin, Dublin, Irlanda. H23, H358, H441, H460, e MOR células foram cultivadas em meio RPMI (Gibco), suplementado com 10% de FCS (Biowest) e antibióticos. Testes para descartar a contaminação por micoplasma foram realizadas regularmente.

NSCLC e tecido pulmonar

amostras de tecido NSCLC e correspondentes amostras de tecido pulmonar normal foram obtidos a partir de doze pacientes que foram encaminhados para ressecção cirúrgica para a Divisão de Cirurgia Torácica e hiperbárica Cirurgia da Universidade de Medicina de Graz. Antes da cirurgia assinado consentimento informado por escrito para este estudo em particular foi obtido de todos os pacientes. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Graz (Graz, Áustria) Ética e conduzida de acordo com a declaração de Helsinki.

hipóxica tratamento

células NSCLC foram semeadas na cultura pratos e deixadas a aderir durante 24 horas. Em seguida as células foram cultivadas durante 72 horas a 37 ° C em ambiente (21%) de oxigénio ou 1% de oxigénio no sistema automatizado Xvivo G300CL (BioSpherix, Lacona, NY) antes da extracção do ARN, proteína de amostragem, ou gravações de patch clamp. A exposição ao oxigénio foi controlada ao longo das experiências na estação de trabalho hipóxico. O pH do meio de cultura foi medido no final da experiência utilizando o Medidor de pH WTW 3110 (WTW, Weilheim, Alemanha) imediatamente após a retirada da incubadora.

Electrofisiologia

O whole- técnica de patch clamp celular foi usado como descrito anteriormente para medir o potencial de repouso sob a pinça de corrente e K

+ correntes sob braçadeira de tensão [10]. Todos os reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Resumidamente, as células foram superfundidas à temperatura ambiente com solução de banho (em mM): NaCl 140,5, KCl 5,5, CaCl

2 1,5, MgCl

2 1, glucose 10, Na

2HPO

4 0,5, KH

2 PO?

4 0,5, HEPES 10; pH ajustado para 7,3 com NaOH. Para a gravação TASK-1, pipetas foram preenchidos com as seguintes soluções (em mM): KCl 20, metanossulfonato de potássio (para suprimir Cl

– correntes) 135, MgCl

2 1, CaCl

2 0,1, Na

2ATP 2, (éter SS-aminoetil) etilenoglicol bis-N, N, N ‘, N’-tetraacético (EGTA) 3, HEPES 20; pH ajustado para 7,2 com KOH. O não-inactivação de TASK-1 K

+ corrente (I

KN) foi obtida a partir do potencial de manutenção de 0 mV, intensificando a tensão de 60 mV e, em seguida, aumentando a -100 mV ao longo de um período de 1,6 segundos . Para isolar o não-inativação TASK-1 K

+ corrente (I

KN) a partir de K-dependente tensão

+ correntes, as células foram fixada em 0 mV durante pelo menos 5 min. Os dados foram analisados ​​com o software pCLAMP 9,0 (Axon Instruments, Foster City, CA).

Gene silenciamento com siRNA

siRNA segmentação TASK-1 e não silenciar siRNA foram obtidos a partir Ambion (Waltham , MA). Não silenciamento siRNA (controlo negativo # 1 siRNA, Ambion) não apresenta qualquer homologia de sequência com sequências de genes humanos. A transfecção foi realizada a uma concentração final de 40 nM de ARNsi utilizando Effectene (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A eficácia foi avaliada 48, 72, e 96 horas após a transfecção por qPCR e Western blot.

extracção de ARN e a síntese de ADNc

O ARN total foi extraído utilizando o Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen) combinado digestão com ADNase (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (1 ug) foi transcrito de forma reversa utilizando o RevertAid H Minus kit de síntese de primeira cadeia de cDNA (Fermentas, Burlington, Canadá).

PCR (qPCR)

reacções qPCR

quantitativo em tempo real fosse realizado no real-Time System 7900 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando o TaqMan

® Ensaios de Expressão gênica (Applied Biosystems)

KCNK3

(tASK-1), Hs00605529_m1;

KCNK9

(TASK-3), Hs00363153_m1;

SLC2A1

(GLUT1), Hs00892681_m1;

HK2

, Hs00606086_m1;

ACTB

(ß-actina), Hs99999903_m1 (gene de referência). A PCR foi realizada em reacções de 10 ul contendo ADNc (equivalente a 25 ng de ARN total), 1x TaqMan

® Gene Expression Mastermix (Applied Biosystems) e 1x TaqMan

® Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Média ciclo limiar (Ct) número de corridas em triplicado foram utilizados para análise dos dados. A expressão relativa do gene de interesse no tratado versus as células de controlo foi calculado como 2

ΔΔCt. ΔCt foi calculada subtraindo o número Ct do gene de interesse a partir de que o gene de referência. Para o cálculo do ΔΔCt, ΔCt valores do grupo de controlo foram subtraídos dos valores ΔCt-do grupo tratado.

Western blot

As células foram lisadas em gelo em tampão RIPA (Sigma-Aldrich ) contendo inibidores de protease. 50 ug de proteína foi aplicada num gel de acrilamida a 10%, separadas por electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio-usando o Mini-PROTEAN

® unidade de electroforese (BioRad, Hercules, CA) e transferidas para uma membrana PVDF (BioRad). A imunodetecção foi realizada com anticorpos anti TASK-1 anticorpo policlonal de coelho (Alomone Labs, Jerusalém, Israel; APC-024) diluída a 1: 500, ou um anticorpo monoclonal de ratinho TASK-3 (Abcam, Cambridge, MA; ab50042) diluído a 1: 1000. A atividade da peroxidase foi detectada usando a detecção de quimiluminescência (SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente, Thermo Scientific, Waltham, MA). Como um controlo de carga, as membranas foram coradas com um anticorpo policlonal para a p-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). As células transfectadas de ARNip

ensaios de apoptose

TASK-1 siRNA ou controlam foram novamente plaqueadas a 2×10

4 células /cm

2. Após 24 horas foram adicionados estímulos apoptóticos: cisplatina, ou DMEM meio sem glicose (Gibco). Após mais 72 horas as células e as células aderentes foram colhidas flutuantes e a suspensão foi centrifugada a 400 g durante 5 min. A percentagem de células apoptóticas foi determinada com a caspase-3 intracelular Actividade Assay Kit I (PhiPhiLux

® G1D2, Merck, Darmstadt, Alemanha) ou, após a interrupção do kit pelo fabricante, pelo CellEvent Caspase-3/7 verde Citometria de Fluxo Assay Kit (Molecular Probes, Waltham, MA). A concentração de péptido DEVD foi ajustado a 4 uM. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, EUA). Como um segundo Método As células foram recolhidas, centrifugadas, coradas com corante Hoechst (Invitrogen, Waltham, MA), e fragmentação nuclear foi avaliada. O observador (KL) desconhecia o tratamento, pelo menos 500 células por amostra foram avaliados.

Ensaios de proliferação

As células transfectadas foram replated em placas de 6 poços a 1×10

5 células /poço em meio de cultura contendo 1% de FCS. Após os pontos temporais indicados, as células foram tripsinizadas e os números de células totais foram medidos com CASY

® contador de células (Sistema Schärfe, Reutlingen, Alemanha) em duplicados. Para a avaliação da mitose, as células foram incubadas em meio de cultura contendo 1% de FCS. Após 48 horas EDU (5-etinil-2′-desoxiuridina, um análogo de nucleósido de timidina) foi adicionado ao meio durante mais 1,5 horas. Após a colheita, as células foram analisados ​​com o kit Clickit EdU (Invitrogen) por citometria de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences).

In silico

análise de expressão

mRNA abundância de membros da

SLC5

família de transportadores e de

SLC38A1

e

SLC38A2

foi avaliada em um conjunto de dados de expressão gênica publicamente disponível em amostras de adenocarcinoma de pulmão e pulmões normais (GDS3257) [ ,,,0],11], publicado em Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Detalhes sobre o processamento de microarray e características dos pacientes são relatados na GEO e em [11].

A análise estatística

Os dados foram compilados e analisados ​​com o pacote de software SPSS, versão 21.0 (Chicago, IL) ou com o GraphPad Prism, versão 5.03 (La Jolla, CA). diferenças entre os grupos foram calculados com

t

-teste ou dois sentidos t

-teste, de Student para uma amostra da não pareado ou emparelhado de Student ANOVA com Bonferroni análise post-hoc, conforme apropriado.

P

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

TASK-1 é expressa em um subconjunto de linhas de células NSCLC e tecidos NSCLC

Em primeiro lugar, nós investigamos tASK-1 e proteína tASK-3 e mRNA em oito linhagens de células NSCLC humanas. TASK-1 foi consistentemente proteína detectável por imunotransferência em quatro das oito linhas de células (A549, H358, H460, e MOR), a expressão mais forte, sendo encontrado em células A549, H460, e MOR (Fig 1A). Além disso, a fraca expressão da proteína TASK-1 foi encontrada em A427, H441 e SK-MES células, enquanto a expressão de H23 em células era negligenciável. Em células A549 também os níveis de ARNm de TASK-1 eram elevados enquanto que em todas as outras linhas celulares nenhuma correlação clara entre TASK-1 e os níveis de ARNm de proteína foi observada (Fig 1A). No entanto níveis TASK-1 de proteína não são apenas regulamentada pela expressão do gene, mas importante também por endocitose e degradação [12,13]. Isso pode explicar as discrepâncias entre TASK-1 proteína e níveis de mRNA. Curiosamente, com a tarefa-1 iniciadores comercialmente disponíveis não TASK-1 mRNA transcrito foi encontrado em células H441. TASK-3, que foi descrito para ser amplificado no pulmão e cancro da mama [14], foi expresso em todas as oito linhas celulares de NSCLC com a menor expressão, sendo encontrado em células A549 (Figura 1B). TASK-1, uma proteína glicosilada [15], apareceu com um peso molecular de 52 kDa em imunotransferência (Fig 1C). A faixa adicional fraco no 46 kDa pode representar a não glicosilada TASK-1 forma (Fig 1C). O sinal foi revogada através da utilização de um péptido de bloqueio específico para o anticorpo foi reduzida e após transfecção com disponível comercialmente siRNA alvejando TASK-1 (Fig 1C-1E), confirmando assim a sua especificidade.

(A) TAREFA -1 expressão em oito linhas celulares de NSCLC diferentes. A immunoblot representativa e valores médios de densitometria são mostrados. As células A549, presente em todos os imunotransfer�cias, serviu de referência para a normalização. Parte inferior: Níveis de TASK-1 de ARNm foram avaliados por RT-PCR quantitativo. Beta-actina (ACTB) foi usado como um gene de referência. (B) proteína TASK-3 e níveis de ARNm em oito linhas celulares de NSCLC diferentes. (A, B) Os resultados são média +/- SEM de três a quatro amostras independentes. comparações entre os grupos foram calculados com t-teste de um grupo de Student. As células A549 (C, D) foram transfectadas com ARNsi não silenciamento (c), TASK-1 siRNA (T) ou deixada sem tratamento (U). (C) representativas de imunotransferência utilizando um anticorpo TASK-1 na presença ou na ausência de um péptido de bloqueio específico é mostrado. TASK-1 parece com um peso molecular de 52 kDa, a banda desmaiada adicional a 46 kDa pode representar a forma unglycolsylated. níveis (D) TASK-1 mRNA de 48 horas após a transfecção com o TASK-1 siRNA avaliada por RT-PCR quantitativo. (E) imunoblots representativos de TASK-1 em células A549 e células H358 em diferentes intervalos de tempo após a transfecção. Os dados são apresentados como a média +/- SEM de n = 3 experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Tarefa- 1 é funcional e contribui para definir o potencial de membrana em células A549

a fim de provar que as formas tASK-1 canais funcionais em células de câncer de pulmão, K

correntes + foram analisados ​​em células A549. Depois de aplicar um potencial de manutenção de 0 mV, o que inactiva a tensão gated K

+ canais, um “não-inactivação” K

+ corrente (I

KN) foi detectada em células A549 (Figura 2). A corrente foi modulado por desvios de pH, que mostra um decréscimo significativo a pH baixo e um aumento significativo no pH elevado (Fig 2A). O inibidor selectivo de anandamida TASK-1 [16] (10 uM) reduziu significativamente o K não inactivação

+ corrente em células A549 (Figura 2B). Por conseguinte, a inibição de TASK-1 por anandamida corrente (10 uM) levou à despolarização significativa da membrana da célula para valores menos negativos (Fig 2B). Quando o não-inactivadora K

+ corrente foi analisada em células A549 transf ectadas com o TASK-1 ou ARNsi de controlo, as células transfectadas com o TASK-1 siRNA apresentaram significativamente reduzida não-inactivadora K

+ corrente (Fig 2C) . Estes dados mostram claramente que funcionais canais TASK-1 estão presentes em células A549 e que uma parte significativa do K não inactivação

+ corrente é realizada por canais TASK-1. A corrente não-inativação também foi reduzida pela TASK-3 rutênio inibidor vermelho [17] (Fig 2D). Os efeitos da anandamida e vermelho de rutênio foram aditivos (Fig 2D).

(A) Registos representativos de um não-inativação K

+ corrente (I

KN) em células A549 usando toda a célula técnica de patch-clamp em condições ácidas e básicas, e gráficos que resumem a corrente média de 0 mV. I /I

0 é a corrente na presença de baixo (6,3) ou alto (8,3), pH expressa como uma fracção da corrente antes do tratamento. A corrente não-inativação é reduzido sob ácida e aumentou sob condições básicas. (B) Registos representativos e um gráfico sumarizando o K não inactivação

+ corrente (I

KN) e o potencial de repouso da membrana (

E

M) na presença e ausência de o inibidor da anandamida tASK-1 (Ana, 10 uM) a pH 7,3 em células A549. I /I

0 é a corrente na presença de anandamida expressa como uma fracção da corrente antes do tratamento anandamida. A anandamida reduzida a não-inactivadora K

+ actual e levou a despolarização da membrana da célula no sentido de valores mais positivos. (C) Registos representativos da não-inativação K

+ corrente (I

KN) e gráfico de barras que resume a atual média de 0 mV em células A549 transfectadas com TASK-1 ou ARNsi de controlo com pH 7.3. (D) Registos representativos da K não inativação

+ corrente (I

KN) ea média atual normalizada a 0 mV em células A549 em tratamento com o TASK-3 bloqueador vermelho de rutênio (RR, 10 mM) ou ruténio vermelho junto com anandamida (10 uM) a pH 7,3. Os dados são a média +/- SEM. **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001 comparado com o controle. Ana, anandamida; RR, vermelho de rutênio.

TASK-1 mediada K

+ corrente é inibida por hipóxia

TASK-1 é conhecido por ser inibida sob hipóxia aguda por mecanismos pós-traducionais [10]. Nós cultivaram células A549 em condições de hipoxia, a fim de avaliar se o TASK-1 mediada K

+ atual é sensível à hipoxia em células de câncer de pulmão. Em células hipóxicas, um K não inactivação

+ corrente era detectável (Fig 3A), No entanto, a corrente foi menor do que sob condições de normóxia e carecia de sensibilidade ao inibidor de anandamida TASK-1 (Fig 3A). O K não inactivação

+ densidade de corrente nas células cultivadas em condições de hipoxia foi significativamente menor do que em células cultivadas sob normoxia (Fig 3B). Correspondentemente, o potencial de membrana em repouso (

E

M) foi significativamente mais positivo (despolarizada) em células hipóxicas do que em células normóxicas (Fig 3B). O pH do meio de cultura de células cultivadas sob diferentes concentrações de oxigénio no densidade utilizada para as experiências de patch-clamp foi medida a fim de clarificar se uma diferença de pH pode explicar a redução observada da K não inactivação

+ atual sob hipóxia. O pH médio no meio de cultura celular foi 7,57 (+/- 0,11) sob normoxia e 7,85 (+/- 0,05) sob hipóxia (

P

= 0,02). O ligeiramente mais elevado pH em hipóxia, possivelmente devido à taxa de crescimento reduzida de células A549 em condições de hipoxia [18], preferem melhorar do que reduzir o TASK-1 K

+ atual, portanto, uma diferença de pH não foi responsável por hipóxia induziu a inibição da corrente.

(a) Esquerda, registos representativos da não-inactivadora K

+ corrente (I

KN) em células A549 cultivadas em condições de hipoxia (1% de oxigénio) durante três dias. A corrente detectável carece de sensibilidade ao inibidor de anandamida TASK-1 (Ana, 10 uM). Direita, o gráfico que resume a atual média de 0 mV. (B) não-inativação K

+ densidade de corrente (I

KN Densidade; à esquerda) e a membrana potencial de repouso (

E

m; à direita) em células A549 cultivadas sob hipoxia ou normoxia. (C) relativa abundância de TASK-1 mRNA em células A549 cultivadas em condições de hipoxia (1% de oxigénio) durante intervalos de tempo diferentes medidos por PCR quantitativa. GLUT-1 e hexoquinase 2 (HK2) foram avaliadas como marcadores de hipóxia. (D) Immunoblot e abundância relativa de TASK-1 proteína em células A549 cultivadas em condições de hipoxia (1% de oxigênio) medidos para diferentes intervalos de tempo. Os dados são a média +/- SEM. *

P Art 0,05, ***

P Art 0,001, n.s., não significativo. Ana, anandamida; HK2, hexoquinase 2; GLUT1, família portadora de soluto 2 (transportador de glicose facilitada), membro 1.

A redução sensível ao anandamida K

+ corrente em hipóxia não era atribuível a uma diminuição da TASK-1 expressão, uma vez que os níveis de ARNm não foram inferiores, mas mesmo ligeiramente superior em hipoxia, embora a diferença não era significativa (Figura 3C). Curiosamente, níveis de ARNm de TASK-1 aumentou gradualmente ao longo do tempo em células A549 plaqueadas em placas de cultura e recolhidos a cada 24 horas, ambos, em hipoxia e normoxia (Fig 3C). Não se sabe se um aumento da densidade celular, uma possível ligeira mudança de pH, ou uma depleção de nutrientes é a causa subjacente. Expressão de GLUT-1 (

SLC2A1

, família portadora de soluto 2 (transportador facilitada de glicose), membro 1) e hexoquinase 2 (

HK2

), genes induzidos por hipoxia conhecidos, foi elevada sob hipóxica tratamento (Fig 3C). Da mesma forma, TASK-1 níveis de proteína em células A549 não foram afetados pela hipóxia (Fig 3D).

TASK-1 knockdown aumenta a apoptose em células A549

Nós silenciados TASK-1 em A549 e células H358 usando siRNA. Quando a cisplatina fármaco citotóxico, que é conhecido por induzir a apoptose em células de cancro do pulmão, foi administrado a células A549, um aumento significativo na apoptose induzida por cisplatina foi encontrado em células transfectadas TASK-1 siRNA em comparação com células de controlo transfectadas siRNA (Fig 4A e 4C, S1 figura). Este efeito não foi observado em células H358 (Figura 4B, Fig S2). Da mesma forma, quando a apoptose foi induzida por privação de glucose, TASK-1 silenciamento conduziu a um aumento significativo da apoptose em células A549, mas não em células H358 (Fig 4A e 4B, Figs S1 e S2). As células foram re-plaqueadas após a transfecção, a fim de evitar densidades celulares elevadas, especialmente em células não tratadas, durante o decurso da experiência. No entanto, se re-plaqueamento foi omitido, foi observado o mesmo efeito de promover a apoptose de TASK-1 siRNA em células A549 (Figura 4D). A eficácia de TASK-1 knockdown por siARN foi mais baixa em células H358 do que em células A549 depois de 48 horas, mas atingiram níveis semelhantes após 72 horas (Figura 1E). Assim, as diferenças de sensibilidade ao TASK-1 siRNA não pode ser explicada por níveis diferentes de knockdown.

(A, B) As células foram transfectadas com o TASK-1 siRNA ou não-silenciamento siARN (siARN controlo). 48 horas após a transfecção, as células foram plaqueadas de novo, depois de 24 horas adicionais as células foram tratadas com diferentes estímulos durante 72 horas e a apoptose foi avaliada por detecção de células com actividade de caspase 3 por análise de FACS. Para a indução da apoptose, as células foram tratadas com cisplatina ou a diferentes concentrações com meio DMEM contendo soro dializado e 10 mM ou 0 mM de D-glicose (em relação com metabolicamente inerte L-glicose). As células A549 (C) foram transfectadas e tratado com diferentes concentrações de cisplatina na mesma maneira como no painel A. A apoptose foi avaliada por coloração das células flutuantes e aderentes com corante Hoechst. Taxas de fragmentação nuclear foram determinados de forma cega. As células A549 (D) foram transfectados do mesmo modo como no painel A e tratadas com diferentes concentrações de cisplatina sem replating anterior. (A, B, D) A apoptose foi avaliada por detecção de células com actividade de caspase 3 por análise de FACS. Os resultados são a média +/- SEM de n = 3 experiências independentes. comparações entre os grupos foram realizadas com Two-way ANOVA seguido por análise de Bonferroni post-hoc. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001. ns, não significativo.

TASK-1 knockdown reduz a proliferação de células A549

Quando avaliamos o papel da TASK-1 na proliferação de células do cancro do pulmão em condições reduzidas de soro, nós descobriram que knockdown de tASK-1 siRNA reduziu significativamente o aumento do número de células em células A549, mas não em células H358 (Fig 5A). A taxa de mitose, medido por incorporação EdU, foi também significativamente reduzida em células A549 tratadas com o TASK-1 siRNA em comparação com ARNsi de controlo (Figura 5B).

(A) células foram transfectadas com o TASK-1 siRNA ou não -silencing siARN (siARN de controlo). 48 horas após a transfecção as células foram plaqueadas de novo em meio com teor de soro reduzido (1%), de modo a evitar a sobre-estimulação das células. número total de células foram contadas a cada dia consecutivo em duplicatas com a análise da área pulso eletrônico (CASY

®). Os resultados são a média +/- SEM de n = 3 experiências independentes. comparações entre os grupos foram realizadas com Two-way ANOVA seguido por análise de Bonferroni post-hoc. (B) As células foram transfectadas tal como descrito e cultivados em meio de soro reduzido (1%) durante 48 horas. Mitose foi avaliada utilizando um ensaio de absorção EdU. Os resultados são a média +/- SEM de n = 4 experiências independentes. **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, NS, não significativo

Expressão da TASK-1 e putativos efectores a jusante. de tASK-1, na

+ – juntamente transportadores, em NSCLC humana e pulmões normais

Quando analisamos tASK-1 expressão em nível de proteína em amostras de NSCLC humanas e tecido pulmonar normal correspondente a partir de doze pacientes que encontraram níveis variáveis ​​de expressão, ambos, pulmões e tumores (Fig 6a). Em geral, os níveis de expressão não foi alterada em comparação com NSCLC pulmão normal (Figura 6A). Na

+ – juntamente transportadores de nutrientes são efectores a jusante putativos de TASK-1 desde a sua ação depende Na

gradientes + que só podem ser estabelecidas se K

+ importação por Na

+ /K

+ – ATPase é equilibrado por K

+ – exportação via K

+ canais. Nós avaliamos a expressão de Na

+ – soluto co-transportadores, os membros da

SLC5

família ea Na

+ – transportadores de glutamina impulsionado

SLC38A

1 e

SLC38A2

, em NSCLC (adenocarcinoma) amostras humanas em comparação com tecido pulmonar normal, utilizando um conjunto de dados grande, pública publicada pelo GEO (GDS3257) [11]. Nós encontramos o Na

+ – simportadores glicose

SLC5A1

(SGLT1) e

SLC5A2

(SGLT2) devem ser expressas em NSCLC em um nível semelhante como no pulmão normal, onde SGLT- transporte mediado de glicose através da camada epitelial alveolar desempenha um importante papel na re-captação de glucose [19]. No entanto, encontramos aumentou significativamente a expressão do Na

+ /mio-inositol co-transportador de

SLC5A3

, o Na

+ – transporter multivitamínico dependente

SLC5A6

, e do transporter glutamina

SLC38A1

em tumores contra pulmão normal (Fig 6B e 6C).

SLC38A

2 não foi expresso diferencialmente (dados não mostrados).

(A) TASK-1 de proteína foi avaliada em tecido de pulmão NSCLC e correspondente não envolvidos de doze pacientes utilizando Western blot. Direita: valores da densitometria para TASK-1 em NSCLC e os pulmões foram normalizados para a p-actina. (B, C) os níveis de mRNA de membros da

SLC5

família de Na

+ – transportadores acoplados e do Na

+ – impulsionado transportador de glutamina

SLC38A1

foram avaliadas em um conjunto de dados disponível publicamente GEO (GDS3257) [11], publicado em Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) em amostras de adenocarcinoma de pulmão (n = 58) e pulmões normais (n = 49). A medida expressão (Multichip média Robust) RMA para mRNA abundância é na escala log. ***

P Art 0,001, *

P

. 0,05

Discussão

A importância da K

+ canais durante a mitose foi proposto tão cedo quanto em 1960, mas apenas muito recentemente K

+ canais têm sido estudadas em cancros [3]. Em nosso estudo, mostramos que TASK-1 é expressa em um subconjunto de NSCLC e que TASK-1 é funcional, promove a proliferação e inibe a apoptose em células de cancro do pulmão altamente TASK-1 expressando.

expressão aberrante de K

+ canais é frequentemente observada em cancros, no entanto, a compreensão da sua regulação e função durante a progressão e crescimento do câncer é incompleta. [14].