Abstract

Durante a última década, evidências crescentes tem implicado o vírus neurotrópico humano JC vírus na patologia do cancro do cólon. No entanto, os mecanismos de JC oncogênese mediada por vírus ainda não são totalmente determinada. Um candidato para mediar estes efeitos é o produto da transcrição virai precoce antigénio T, o qual tem a capacidade para inactivar as proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como p53. Em meduloblastomas, antigénio T tem sido demonstrado que se ligam a proteínas Wnt via de sinalização β-catenina; No entanto, os efeitos desta interacção de proteínas reguladoras do ciclo celular a jusante permanecem desconhecidos. À luz destas observações, foi investigada a associação de T-Antigen e β-catenina nuclear em casos de câncer de cólon e os efeitos desse complexo na ativação dos reguladores de transcrição do ciclo celular e c-Myc e ciclina D1

in vitro

. A amplificação de genes demonstraram a presença de sequências virais em 82,4% dos casos e que detectada expressão de antigénio-T em 64,6% de casos por imuno-histoquímica. Além disso, verificou-se que o antigénio T e β-catenina co-localizado no núcleo das células tumorais e foi confirmada a ligação física entre estas duas proteínas

in vitro

. A presença nuclear do antigénio T e β-catenina resultou no aumento significativo de actividade do promotor TCF-dependente e a activação dos alvos a jusante β-catenina, c-Myc e de ciclina D1. Estas observações mostram evidências de um papel de JCV T-Antigen na desregulação da via de sinalização Wnt e na patogênese do câncer de cólon

Citation:. Ripple MJ, Parker Struckhoff A, Trillo-Tinoco J, Li G, Margolin DA, McGoey R, et al. (2014) A activação de c-Myc e Ciclina D1 por JCV antigénio-T e β-catenina no cancro do cólon. PLoS ONE 9 (9): e106257. doi: 10.1371 /journal.pone.0106257

editor: Shao-Jun Tang, da Universidade do Texas Medical Branch, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2014; Aceito: 30 de julho de 2014; Publicação: 17 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ripple et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi possível graças à instituição RR021970 P20 do National Institutes of Health, a LDV. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal (CRC) continua a ser um grave problema de saúde em todo o mundo, apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento. Ocupa o terceiro lugar em incidência global do cancro e é a segunda causa mais comum de mortalidade por câncer nos Estados Unidos, onde há uma estimativa de 140.000 novos casos e 50.000 mortes relacionadas com a CRC a cada ano [1]. O risco de desenvolver câncer de cólon esporádicos na população em geral é de 5%, mas esta incidência aumenta com a idade, devido à acumulação de alterações genéticas e epigenéticas [2]. Algumas destas alterações pode ser causada por factores ambientais, incluindo os vírus, os quais foram implicados em vários outros tipos de cancro. Vários estudos independentes demonstraram que aproximadamente 20% de todos os cancros são causadas por agentes infecciosos [3], [4]. Um desses agentes é o neurotrópico humano JC vírus (JCV), um membro da

Polyomaviridiae

família, que também inclui SV-40, o vírus BK (BKV) eo recém-descoberto celular Merkel Polyomavirus (MCPyV), encontrado para ser clonalmente integrado numa percentagem elevada de carcinomas de células de Merkel. JCV foi estabelecido como o agente causador da Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (LMP), uma doença desmielinizante que afeta pacientes com HIV [5] e, mais recentemente, em pacientes submetidos à terapia imunomoduladora [6]. Durante a última década, vários laboratórios têm demonstrado que JCV está associada com vários cancros humanos, incluindo tumores cerebrais [7], [8], o cancro do pulmão [9], e malignidades do trato digestivo superior e inferior [10] – [12 ].

JCV é um vírus ubíquo que infecta uma grande proporção da população em geral. De acordo com estudos soro-epidemiológicos, a infecção primária com JCV ocorre na primeira infância e ao longo de 70-90% dos indivíduos adultos são positivos para anticorpos anti-JCV [13], [14]. Embora a infecção primária é assintomático, a via de transmissão proposto é através do tracto respiratório, após o que JCV estabelece uma infecção latente no rim. Em aproximadamente 30% dos indivíduos seropositivos saudáveis, JCV é derramado na urina em condições normais [15], [16]. Como resultado, as partículas JCV intactas foram isolados a partir de amostras de águas residuais urbanas bruto de todo o mundo [17], [18], que em conjunto com a conclusão de ADN virai nas células epiteliais a partir da parte superior e inferior aparelhos digestivos [19], sugere um ponto adicional de entrada para o vírus através do trato GI através da exposição à água ou alimentos contaminados. Importante, Bofill-Mas,

et ai

mostrou que as partículas virais isoladas a partir de esgoto permaneceu intacta após tratamento a um pH de 1, durante 30 minutos, indicando que a ingestão de água contaminada ou de alimentos podem ser suficientes para a infecção do JCV tracto gastrointestinal [20]. Muitos estudos, uma vez, demonstraram a presença de sequências genómicas JCV e a expressão do antigénio T em tecidos de tumores gastrointestinais, incluindo carcinoma esofágico [11], carcinoma gástrico [12], [21], [22], os pólipos adenomatosos esporádicos [ ,,,0],23], e adenocarcinomas colorretais [10], [24] – [30]

o genoma JCV é de aproximadamente 5,2 kb em tamanho e pode ser dividido em três regiões:. início do região do genoma viral (EVGR), a região tardia virai genómico (LVGR), e a região de controlo não codificante (NCCR), que contém a origem de replicação, e está localizado entre precoces e tardios regiões genómicas. O EVGR codifica um poderoso proteína oncogénica, grande antigénio T, enquanto o LVGR codifica as proteínas da cápside viral VP1, VP2 e VP3, bem como a Agnoprotein, um pequeno produto acessório [31]. O modelo actual de oncogénese mediada por JCV envolve a integração das porções do genoma JCV, particularmente o gene antigénio T, o que é proposto para aumentar o risco de desenvolver cancro devido à expressão subsequente do antigénio-T. Em apoio a este modelo, Theodoropoulos

et ai mostraram que a carga viral JCV foi de 10 a 50- vezes superior em adenomas e adenocarcinomas do cólon em comparação com o tecido normal combinado [32]. Além disso, Coelho

et al

recentemente demonstrado que o tecido CRC tem uma frequência relativa significativamente maior de sequências genómicas JCV do que mucosa normal adjacente e mucosa normal distante [33].

As capacidades transformadoras de JCV T -Antigen

in vitro

são bem conhecidos [34].

In vivo

antigénio T faz com que uma variedade de tumores do sistema nervoso central, quando injectado no cérebro de roedores e primatas não-humanos, que vão desde a meduloblastomas tumores gliais [35] – [37]. ratinhos transgénicos que expressam JCV T-Antigen do NCCR desenvolver tumores de origem neuroectodermal, incluindo meduloblastoma, tumores da glia, e tumores da bainha dos nervos periféricos malignos [38] – [40]. Este processo de transformação ocorre através da interacção de t-antigénio com proteínas reguladoras do ciclo celular, incluindo p53 chave, Rb, e a molécula de sinalização central na via de sinalização Wnt, β-catenina [41] – [43].

β-catenina é frequentemente desregulado no câncer de cólon [44], [45]. Níveis de β-catenina são rigorosamente controlados por seu complexo de destruição, que consiste em as proteínas APC, axina, GSK3, e CK1, que marcam-lo para ubiquitinação. Mutações nos componentes do complexo de destruição pode resultar na localização nuclear aberrante de β-catenina, um mecanismo bem estabelecido de carcinogénese em cancro colorrectal [44], [46], que conduz à activação de Wnt genes alvo via na ausência de sinalização Wnt e resulta na proliferação celular não verificado [2]. Enquanto a via Wnt é activado por mutações genéticas em mais de 90% dos casos de cancro do cólon [47], expressão nuclear β-catenina é detectada apenas em aproximadamente 50% dos casos [48], sugerindo que existem factores adicionais que contribuem para o nuclear localização de β-catenina no cancro do cólon. Tem sido demonstrado que JCV antigénio-T tem a capacidade de se ligar β-catenina através de uma interacção com o terminal C de β-catenina [41], e que o T-antigénio pode estabilizar β-catenina em células de glioblastoma [49]. Além disso, o antigénio T tem um sinal de localização nuclear clássica (NLS) e é fortemente expresso principalmente nos núcleos das células neoplásicas [10], [42], [50]. Por isso, procurou-se determinar o efeito da JCV antigénio T na localização nuclear de β-catenina e a função deste complexo na activação de genes alvo β-catenina como um mecanismo para o desenvolvimento e progressão do cancro do cólon.

no estudo atual, podemos medir a prevalência de sequências genómicas T-Antigen e expressão da proteína em tecidos cancerígenas do cólon humano utilizando uma coleção de amostras de biópsia bem caracterizados. É importante notar, que demonstra a associação do antigénio-T e β-catenina nuclear em amostras de cancro de cólon humano e elaborado sobre esta associação por elucidar os efeitos moleculares desta interacção na desregulação da cascata de sinalização Wnt e a activação de alvos β-catenina usando linhas celulares de cancro do cólon.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

Um total de 113 amostras embebidos em parafina de-identificados de carcinoma colorectal e pré-neoplásicas pólipos foram coletadas de os arquivos de patologia das seguintes instituições: LSUHSC-New Orleans (34 amostras) e da Clínica Ochsner (79 amostras). Os tumores foram histologicamente classificados e imunohistoquímica caracterizados de acordo com a classificação da OMS de Tumores do Trato Gastrointestinal.

Extração de DNA e análise

A microtome dedicada foi usado para a secção dos blocos de parafina, a fim de evitar a contaminação. Além disso, o bloco de retenção de lâminas e foram periodicamente autoclavado, e uma lâmina nova, descartável foi usada para cada espécime. O DNA foi extraído a partir de cerca de 10 secções de 10 um de espessura de cada uma das amostras de tecido, utilizando o Kit de tecido QIAamp, de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). A amplificação por PCR do gene antigénio T foi realizada utilizando os iniciadores pep1 e PEP2 (nucleótidos 4255-4272 e 4408-4427, respectivamente), que amplificam sequências na região N-terminal de JCV antigénio-T (sequência pep1: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC; sequência PEP2 : AGGTGCCAACCTATGGAACA). Para a amplificação da região de controlo (RC), foram utilizados os iniciadores NCRR1 e NCRR2, correspondendo aos nucleótidos 4993-5004 e 258-279, respectivamente (sequência NCRR1: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG; NCRR2 sequência: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). A amplificação foi realizada em 250 ng de ADN molde com o sistema de PCR FailSafe (Epicentre) num volume total de 25 ul. PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, hibridação a 62 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s. Como um passo de terminação, o tempo de extensão do último ciclo foi aumentada para 7 min. As amostras amplificadas na ausência de ADN molde serviu como um controlo negativo, enquanto que o ADN extraído de células positivas BSB8 antigénio-T foi utilizado como um controlo positivo para cada procedimento. de mancha de Southern foi realizado através da resolução de 10 ul de cada reacção de PCR num gel de agarose a 2%. O gel foi então tratado durante 15 minutos cada com HCl 0,2 M por despurinação, NaCl 1,5 M /NaOH 0,5 M para a desnaturação, e NaCl 1,5 M /Tris-HCl 0,5 M (pH 7,4) para neutralização, seguindo-se a transferência dos fragmentos amplificados a partir do gel para membranas de nylon (Hybond-N; Amersham). As membranas foram então pré-hibridados durante 1 h em solução EasyHyb (Roche), seguido por hibridização na mesma solução contendo 2 ug de oligonucleótido marcada com DIG JCV específico para antigénio-T (nucleótidos 4304-4405) durante a noite. Os iniciadores utilizados para a síntese de DIG marcado sonda são PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) e PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). Para a sonda CR utilizamos iniciadores de nucleótidos 62-81. As sondas foram sintetizadas utilizando o ADN DIG Labeling Kit de Detecção e (Roche). As membranas foram hibridizadas durante a noite, lavou-se, e desenvolvidos utilizando o DIG Wash e bloco amortecedor Conjunto de acordo com as instruções do fabricante (Roche).

A sequenciação do ADN da região de controlo foi realizada utilizando ABI Prism 3730x /analisador de ADN. Para a amplificação de DNA a partir do gene de manutenção, GAPDH, foram utilizados os seguintes iniciadores:.

5 ‘TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3’ e 3 ‘GTA CAT ATT GGT CAC CAC CC 5’

análise histológica e imunohistoquímica

parafina-embedded previamente fixados em formalina a 10% tamponada foi seccionado com uma espessura de 4 mm e montado em lâminas carregadas. As secções foram colocadas num forno a 65 ° C para fundir a parafina e, em seguida, desparafinados em três mudas de xileno durante 30 minutos cada. As secções foram depois re-hidratadas através de uma série gradual de álcoois até água, e recuperação de antigénios não-enzimática foi realizada em citrato de sódio 0,01 M (pH 6,0) a 97 ° C num forno de vácuo durante 35 min. Depois de um período de arrefecimento de 25 min, as secções foram lavadas com PBS e a peroxidase endógena foi extinta por incubação das lâminas em metanol /3% H

2O

2 durante 30 min à temperatura ambiente. As secções foram bloqueadas em soro de cavalo a 2% e incubadas durante a noite com anticorpos primários à temperatura ambiente numa câmara humidificada. Os anticorpos utilizados para detecção das proteínas virais incluído um anticorpo monoclonal de ratinho contra T grande de SV40-antigénio que reage de forma cruzada com o antigénio T de JCV (clone pAb416, diluição 1:100; Calbiochem) e um anticorpo monoclonal de ratinho anti-β-catenina (E clone -5, diluição 1:100; Santa Cruz Biotechnology). Após lavagem as secções em PBS, as lâminas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com os anticorpos secundários anti-murganho biotinilados e, em seguida, foram lavadas em PBS. O tecido foi subsequentemente incubadas com complexos de avidina-biotina-peroxidase durante 1 hora a temperatura ambiente de acordo com as instruções do fabricante (Vector Laboratories), e, finalmente, as secções foram desenvolvidas com um substrato de 3,3′-diaminobenzidina (Sigma), contrastadas com hematoxilina e lamínulas com Permount (Fisher). Para avaliar a fracção de células imunomarcadas em amostras de cada paciente caso, o índice de marcação definida como a percentagem de células positivas de o número total de células tumorais foi determinada contadas.

duas vezes imunofluorescência

Para imunofluorescência e marcação dupla de secções embebidas em parafina, desparafinização, recuperação antigênica, têmpera peroxidase endógena e bloqueio foram realizadas como descrito acima. Por imunofluorescência dupla marcação de células HCT116 em cultura, as células foram lavadas com PBS, fixadas em acetona fria, e bloqueada em PBS contendo 5% de soro de cavalo e 0,1% de BSA durante 2 h. Secções ou células foram então incubadas com anti-ratinho T-antigénio de um anticorpo (clone pAb416, 1:100 diluição, Oncogene Science) e anticorpo anti-β-catenina de coelho (clone D13A1, 1:100 diluição Cell Signaling) durante 16 horas, seguido de lavagem em PBS e incubao em anticorpo anti-rato rodamina e anti-coelho de anticorpo de fluoresceina (1:200 diluição; Vector Laboratories). Finalmente, as secções foram lavadas em PBS e montadas em meio de montagem aquoso com DAPI (Vector Laboratories), e visualizadas num microscópio confocal (Olympus FV1000).

Transiente de Luciferase transfecção e constrói

células HCT116 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Hamid Boulares. As células foram transfectadas utilizando Xtreme Gene-HP (Roche). As seguintes construções foram usadas para ensaios de luciferase: M72 Super 16x TOPflash construção repórter: Addgene plasmídeo 17165; M51 Super 8x FOPflash: Addgene plasmídeo 12457; promotor de c-Myc: Addgene plasmídeo 16595; A ciclina D1 promotor: plasmídeo Addgene 32727. Estas construções foram transfectadas repórter sozinho ou em conjunto com pcDNA-antigénio-T e /ou pcDNA-β-catenina e ensaiadas quanto à actividade da luciferase utilizando um Sistema de Ensaio da Luciferase (Promega) a 24 horas pós-transfecção.

Extracção de proteínas, co-imunoprecipi tacão e Análise

citoplasmática e extractos de proteínas nucleares de células HCT116 foram recolhidas em tampão de lise utilizando citoplasmática e tampão de lise nuclear como descrito anteriormente [51]. Resumidamente, as células foram tripsinizadas, sedimentou-se a 2000 g durante 5 minutos, e re-suspendido em 500 ul de tampão de lise citoplásmico durante 10 minutos em gelo. Após a lise da membrana celular, os núcleos foram sedimentados a 14000 g durante 10 minutos. Os núcleos foram lavados uma vez em tampão de lise citoplasmática, sedimentadas e lisadas em tampão de lise nuclear de 250 ul durante 20 minutos a 4 ° C com agitação. 500 ug de extracto de proteína total foi incubado com 10 ug de anti-t-antigénio ou anticorpo anti-β-catenina durante a noite a 4 ° C com agitação. complexos antigénio-anticorpo foram então imunoprecipitadas com /G esferas de Proteína A magnéticos (Pierce), lavadas em tampão HNTG (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 10% glicerol, 0,1% de Triton X-100), desnaturadas e analisadas por SDS-PAGE .

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as diretrizes Institutional Review Board da Universidade Estadual de Louisiana e aprovação. Todas as 113 amostras humanos embebidos em parafina de carcinoma colorretal e pólipos pré-neoplásicas, que foram recolhidos a partir dos arquivos de patologia de LSUHSC New Orleans (34 amostras) e da Clínica Ochsner (79 amostras). A Universidade do Estado de Louisiana Institutional Review Board (IRB) dispensou a necessidade de consentimento por escrito, que as amostras são de arquivo, de-identificados e siga sob as diretrizes do NIH de isenção como tecidos que seriam descartados e não podem ser rastreados de volta para pacientes (Protocolo IRB # 8077).

resultados

A expressão de T-Antigen e β-catenina em amostras de câncer de cólon

O produto da transcrição precoce da JCV, T-Antigen, é um bem -conhecido proteína oncogénica potente, que tenha sido detectado numa variedade de tumores. A fim de estabelecer a presença de JCV T-Antigen, realizamos experimentos de imunohistoquímica, em um total de 113, embebidos em parafina casos fixados em formol de cancro do cólon de 2 das maiores instituições médicas New Orleans. A maioria destas amostras continham mucosa, pólipos pré-neoplásicas normais e ambos

em

situ e carcinoma invasivo. Encontrámos expressão do antigénio-T por imuno-histoquímica nos núcleos das células do tumor em 73 das amostras (64,6%). Curiosamente, o antigénio T também estava presente no núcleo das células epiteliais a partir de pólipos pré-neoplásicas, mas completamente ausente no epitélio do cólon normal, (Figura 1, painéis esquerdos).

A imuno-histoquímica em áreas do epitélio do cólon normal é negativo para antigénio-T, enquanto β-catenina é expressa no citoplasma e na membrana (painéis e B). expressão do antigênio T é encontrado no núcleo das células epiteliais em pólipos e células neoplásicas em áreas de tumor invasivo (Painéis C e E, respectivamente). secções consecutivas do mesmo casos mostram que β-catenina é agora localizado para o citoplasma e núcleo das células epiteliais e tumorais (Painéis D e F, respectivamente). Em antigénio T de casos negativos no entanto, β-catenina permanece no citoplasma (painéis G e H). A análise estatística revelou que 67,6% do antigénio T de casos de cancro do cólon positiva expressar nuclear β-catenina, enquanto que apenas 40,4% dos casos o t-Antigen negativas expressam β-catenina nuclear (L; p = 0,006) (Painel I). A percentagem relativa de núcleos positivos para β-catenina em uma secção foi pontuada numa escala de 0-4. casos positivos antigénio-T apresentou significativamente mais núcleos positivos para β-catenina que as amostras negativas antigénio-T (F; * p 0,05) (Painel J). Duplo imunofluorescência rotulagem demonstra a co-localização de antigénio-T (Rodamina) e β-catenina (Fluoresceína) nos núcleos das células neoplásicas num bolso de células neoplásicas debaixo de um revestimento epitelial de células negativas para o antigénio T, em que β-catenina permanece cytoplamic (Painel K). Ampliação original de todos os painéis de imuno-histoquímica é 600x, e de imunofluorescência é 1000x.

Anteriormente, nós demonstramos que em meduloblastomas, antigénio T é capaz de se ligar fisicamente e translocar β-catenina, a molécula central a via de sinalização Wnt, para dentro do núcleo [45], [52]. Para determinar se β-catenina está presente e está relacionado com o antigénio T de cancro do cólon, foi realizada imuno-histoquímica nas mesmas amostras de 113 e analisaram a expressão de β-catenina nuclear em grupos positivos e negativos antigénio-T. Verificou-se que o total de amostras de cancro de cólon positiva 71 antigénio-T, 48 apresentaram expressão nuclear de β-catenina (67,6%), enquanto que apenas 17/42 (40,5%) de amostras negativas para antigénio-T foram positivos para β-catenina nuclear (p≤0.005, Figura 1I). Em todos os casos o antigénio T negativas, β-catenina permaneceram no citoplasma. Curiosamente, as mesmas observações estavam presentes nos pólipos, onde nuclear β-catenina correlacionada com a expressão de antigénio-T. Na mucosa normal, β-catenina permaneceram localizados ao seu local comum no citoplasma e na membrana. β-catenina células positivas nucleares foram pontuados em uma escala de 0-4, com uma pontuação de 0 indica que ~ 5% ou menos células e uma pontuação de 4 indicando -75% ou mais células com β-catenina nuclear. amostras positivas T-Antigen teve uma pontuação média de 1.463 (SD 1.164) para a β-catenina nuclear, enquanto as amostras negativas T-Antigen teve uma pontuação média de 0,8182 (DP 0,9580; p ≤ 0,05, Figura 1J).

Finalmente, foi realizada imunof luorescência dupla rotulagem em um caso positivo, que continha as três áreas (cólon normal, pólipos e cancro) e descobriu que no cólon normal, em que o antigénio T é negativo, β-catenina é expressa no citoplasma; No entanto, nos pólipos e células neoplásicas, que expressam o antigénio T, β-catenina é co-localizar com o JCV oncoproteína no compartimento nuclear. A Figura 1, painel K mostra uma área que contém o epitélio normal na parte superior, com a ausência de expressão do antigénio-T e citoplasmático β-catenina, enquanto um bolso subjacente de células neoplásicas que de forma robusta expressa o antigénio T de mostrar a co-localização nuclear de β -catenina.

a detecção do vírus JC antigénio T de sequências genómicas em amostras de cancro colorectal

Para confirmar a presença do gene antigénio T, foi realizada a amplificação por PCR, seguida por mancha de Southern utilizando um altamente sonda específica e sensível para JCV T-antigénio num número seleccionado de 34 casos de cancro de cólon que continham ADN de alta qualidade. Uma representação esquemática do genoma JCV é mostrado, que contém o local de iniciadores para a amplificação de mancha de Southern e a síntese da sonda (Figura 2A). A região de reconhecimento de sonda no genoma JCV (pares de bases 4304-4405) é altamente variável entre JCV, BKV e SV40, com 20 descasamentos de nucleotídeos entre JCV e do vírus BK e 33 descasamentos de nucleotídeos entre JCV e SV40 na região. Enquanto os iniciadores pep1 e PEP2 amplificar tanto JCV e BKV antigénio-T a sonda de reconhecimento da região entre os iniciadores e pep1 Pep2 é altamente específico para JCV e não se liga a BKV ou SV40 [53].

Um esquema representação da Mad-1 estirpe da estrutura genômica JCV mostrando genes virais em transcrições vermelho, no início e final cinza, e os locais dos iniciadores utilizados para amplificação T-Antigen (pep1 e PEP2) e síntese sonda Southern blot (PEP INT1 e PEP INT2) (Painel A). sequências genómicas da região precoce viral, que codifica T-Antigen, foram detectados em 28 de 34 amostras selecionadas. Uma transferência Southern representativa é apresentado, com números de casos acima de cada pista. Os resultados negativos foram observados quando as mesmas hipóteses foram testadas com sondas para BKV e SV40. Os controlos negativos mostram os resultados de reacções contendo nenhum ADN de controlo positivo e representa a amplificação do gene utilizando pBJC, um plasmídeo contendo ADN como um molde JCV ou plasmídeos contendo BKV e T de SV40-antigénios. PCR para GAPDH e electroforese de agarose foi usada para confirmar a presença de ADN genómico intacto em todos os casos. (Painel B). Southern blots de plasmídeos contendo o antigénio T de JCV, BKV e SV40 foram testadas com sondas específicas para cada poliomavírus, demonstrando a especificidade das sondas (painel C). Uma transferência Southern representativa de amplificação por PCR da região reguladora de controlo é mostrado (Painel D, esquerda). A sequenciação revelou a presença de Mad-1 e 4-Mad estirpes com mutações pontuais nas diferentes amostras. Uma sequência representativa é mostrado em azul, por baixo da sequência conhecida da região CR o Mad-4 (preta); mutações pontuais são destacadas em vermelho (Painel D, à direita).

Nós amplificado sequências genómicas da região de codificação do T-Antigen em 28 amostras das 34 amostras (82,4%), dos quais 21 demonstraram T a expressão da proteína -Antigen por imuno-histoquímica. Em apenas seis casos encontramos a presença de DNA viral, mas não a expressão da proteína, e nenhum dos casos teve expressão T-Antigen na ausência de sequências genómicas virais. Testamos as sequências amplificadas com sondas específicas para BKV e SV40, resultando negativo em todos os casos. ADN genómico de alta qualidade foi confirmada em cada amostra por PCR para GAPDH. (Figura 2B). Finalmente, também testado nossas sondas com plasmídeos contendo o t-antigénios de JCV, BKV uma SV40, confirmando a especificidade dos nossos sondas, e sugerindo que a imuno-histoquímica revela o antigénio T de JCV e não a um do outro poliomavírus (Figura 2C ).

em seguida, realizamos experimentos de PCR com primers e sondas específicas para a região reguladora da JCV. Nós amplificado sequências virais em 14 dos 34 casos. A Figura 2D mostra uma mancha de Southern representativa contendo um destes casos, que também foi positiva para a região do antigénio-T. A sequenciação destes amplicons revelou que Mad-1 e Mad-4 foram as duas manchas detectadas de JCV. No entanto, todas estas sequências continha mutações pontuais individuais, diferentes umas das outras, o que sugere que estes são de facto único e afastando a possibilidade de contaminação laboratorial. Uma sequência representativa é mostrado em azul, por baixo da sequência de saber da Mad 4 estirpe de JCV em preto. As mutações pontuais são destacadas em vermelho (Figura 2D). Além disso, um resumo detalhado dos casos e os resultados da amplificação por PCR e sequenciação, bem como imuno-histoquímica é apresentado na Tabela 1.

T-antigénio e β-catenina co-localizam no núcleo em células de câncer de cólon e co-imunoprecipitado

in vitro

estudos anteriores sugerem que T-Antigen e β-catenina interagem alterando diretamente a localização subcelular citoplasmática normal da β-catenina. A fim de confirmar estes resultados

in vitro

e para determinar se o antigénio T e β-catenina estão presentes no mesmo compartimento celular em células do cancro do cólon, foi realizado imunofluorescência dupla rotulagem para estas duas proteínas no cólon HCT116 a linha celular de cancro transientemente transfectadas com antigénio T. Verificou-se que as células que expressam a oncoproteína mostram uma expressão nuclear forte de β-catenina (Figura 3D-E, setas), enquanto que em células que não se transfectadas e não expressam o antigénio T, β-catenina permanece no citoplasma (Figura 3D-e, pontas de seta).

imunocitoquímica dupla marcação para β-catenina (Painel B, de fluoresceina), e o antigénio T (Painel C, rodamina), realizada em células de cancro do cólon HTC116 transientemente transfectadas com o antigénio T de mostram a co-localização de ambas as proteínas no núcleo da maioria das células (painel E, setas), enquanto que em células em que não há expressão do antigénio T de não-transfectadas, β-catenina mantém-se exclusivamente no citoplasma (Painel e, pontas de seta).

Para definir ainda mais a localização subcelular da interação física entre T-Antigen e β-catenina, foi realizada uma co-immunoprecipiation de extractos nucleares e citoplasmáticos de células HCT116 transfectadas com um o antigénio T de vector de expressão ou vector vazio como controlo. Os lisados ​​nuclear e citoplasmática foram incubadas com um anticorpo anti-antigénio-T e os imunocomplexos foram analisados ​​por Western blot com anticorpos contra o antigénio T e β-catenina. imunoprecipitados antigénio-T a partir de co-precipitação núcleo e citoplasma mostra de β-catenina em ambos os compartimentos (Figura 4A). Nós confirmamos essa interação no experimento inverso (β-catenina IP, T-Antigen Ocidental blot- Figura 4B). A especificidade das fracções nucleares e citoplasmáticos foi confirmada por apalpação pistas de entrada para GRB-2 (citoplasmático) e lamina A /C (nuclear).

células HCT116 transfectadas com a T-antigénio ou vector vazio foram fraccionados para isolar nuclear e compartimentos citoplásmicos e imunoprecipitado com um anticorpo contra o antigénio-T (A) ou β-catenina (B). Antigénio T puxa para baixo β-catenina no citoplasma (painel superior, pista 6) e no núcleo (painel superior, pista 8). O experimento inverso (IP β-catenina) confirma a interacção entre T-Antigen e β-catenina no citoplasma (painel inferior, pista 6) e no núcleo (painel inferior, pista 8).

T -Antigen activa TCF-transcrição dependente

Após a confirmação de que o antigénio T e β-catenina co-localizados e interagir no núcleo, foi investigado o efeito desta interacção na activação de genes alvo β-catenina. Utilizamos a construção repórter TOPflash para medir alterações na β-catenina /transcrição TCF-mediada. A construção TOPflash contém 16 elementos de ligação TCF (TBE) dirigindo a expressão do gene da luciferase. As células HCT116 foram transfectadas com TOPflash e quer o antigénio T, β-catenina, ou ambos o antigénio T e β-catenina. A luminescência foi medida às 24 horas pós-transfecção. Todos os grupos foram transfectadas separadamente com FOPflash para medir a luminescência da linha de base. T-antigénio ou β-catenina sozinho activado significativamente TOPflash por duas vezes e cinco vezes ao longo de controlo com vector vazio, respectivamente. Surpreendentemente, as células que expressam o antigénio T e exógeno β-catenina demonstrou um aumento de 113 vezes na actividade TOPflash ao longo da linha de base (Figura 5A, p≤0.001). Estes dados demonstram a capacidade do antigénio-T e β-catenina para activar sinergisticamente os promotores de genes alvo β-catenina. Os valores são normalizados para células FOPflash-transfectadas.

células HCT116 foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter de Wnt via TOPflash construir e antigénio T, β-catenina, ou ambos. As células transfectadas com a T-antigénio ou β-catenina por si só aumentou a actividade TOPflash aproximadamente 2 a 5 vezes ao longo da linha de base. A co-transfecção com o antigénio T de ambos e β-catenina resultou em aumento de 113 vezes na actividade TOPflash. Os valores estão normalizados para FOPflash (linha de base) os grupos (Painel A). Para medir a activação de alvos específicos β-catenina, experiências semelhantes foram realizados usando construções de luciferase contendo a promotores de ciclina D1 (painel C) de c-Myc (Painel B) ou. Expressão do antigénio-T aumenta de forma significativa a actividade do promotor de c-Myc e de ciclina D1 em células HCT116.