Abstract

cromossomos duplos hora são manifestações citogenéticos de amplificação do gene freqüentemente visto em células cancerosas. Genes amplificados nos cromossomos duplos hora incluem oncogenes e genes resistentes a múltiplas drogas. Estes genes codificam proteínas que contribuem para a formação de cancro, a progressão do cancro, e o desenvolvimento de resistência às drogas utilizadas no tratamento do cancro. Eliminação de cromossomos duplos hora, e, portanto, genes amplificados sobre eles, é uma maneira eficaz para diminuir o tumor maligno das células cancerosas. Investigou-se a eficácia de uma droga de cancro, gemcitabina, na perda dos cromossomas duplos hora a partir da linha celular de cancro do ovário UACC-1598. A gemcitabina é capaz de diminuir o número de cromossomas duplos hora em células a uma concentração inferior a 7500X a hidroxiureia cancro droga vulgarmente usada. genes amplificados presentes nos cromossomas duplos hora são diminuiu ao nível do DNA por tratamento gemcitabina. A gemcitabina, mesmo a uma baixa concentração nanomolar, é capaz de causar danos no ADN. A incorporação selectiva dos sinais duplos minutos de cromatina e γ-H2AX os micronúcleos fornece uma forte ligação entre danos ao DNA e a perda de cromossomos duplos hora de células gemcitabina tratada. As células tratadas com gencitabina também mostrou diminuição do crescimento celular, formação de colónia e invasão. Juntos, nossos resultados sugerem que a gemcitabina é eficaz na diminuição cromossomos dupla hora e isso afeta a biologia das células de cancro do ovário

Citation:. Yu L, Zhao Y, Quan C, Ji W, Zhu J, Huang Y, et ai. (2013) gemcitabina Elimina Cromossomos Minuto casal a partir de células do cancro do ovário humano. PLoS ONE 8 (8): e71988. doi: 10.1371 /journal.pone.0071988

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 17 Março, 2013; Aceito: 05 de julho de 2013; Publicação: 22 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Science Programa de Tecnologia de Cooperação da China (2013DFA31610 para SF), o Programa de Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa Inovativa em University (IRT1230 para YJ), o National Natural Science Foundation da China (31.000.626 e 31.271.347 para WS, 81.201.761 para LY), eo Novo Programa século Apoio à Excelente Scholar, Ministério da Educação da China (NCET-10-0149 para WS, NCET-11-0954 para YY). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Gene amplificação é uma forma de instabilidade genómica que é frequentemente visto em tipos de câncer, e pode manifestar regiões citogeneticamente tão homogeneamente coloração (RHS) ou cromossomos hora duplos (DMS) [1], [2], [3 ], [4]. DMS são de replicação autónoma, acêntrico, e ADN circular atelometric variando de centenas de quilobases a algumas megabases de tamanho em [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Na metáfase espalha marcadas com um corante de ligação ao ADN, DMs pode ser visto sob o microscópio como único ou combinado minutos cromatina muito menor do que os cromossomos.

Como um veículo extrachromosomal para as amplificações de sequências de ADN genómico, DMs contribuir para formação e progressão porque oncogenes e genes de resistência a múltiplos medicamentos são frequentemente presentes nas sequências amplificadas e as proteínas que eles codificam cancro estão frequentemente sobre-expressa [11]. Exemplos de genes amplificados em DMs incluem

MYCN

no neuroblastoma [12],

C-MYC

em células cancerígenas do cólon [13],

EGFR

em gliomas [14], e

eIF-5A2

em células de cancro do ovário [15], e os quais quando perdido através DMS contribui para a reversão do fenótipo do cancro [12], [13], [14], [16]. Eliminação de amplificações de oncogenes em DMS também foi mostrado para induzir a morte apoptótica de células, diferenciação celular, e senescência celular [13], [17], [18].

Muitos estudos têm contribuído para a nossa compreensão da mecanismo das perdas de DMS a partir de células cancerosas. A perda da DMS foi demonstrado em muitas linhas celulares de cancro [12], [13], [17], [19], [20], [21], [22]. Não letais baixas concentrações de hidroxiureia (HU) foi encontrado pela primeira vez para aumentar a perda de DMS a partir de células de ratinho contendo amplificado DHFR [23], e foi mais tarde encontrada para ter o mesmo efeito em células cancerosas de mamífero [13], [24] . A perda de DMS por baixas concentrações de HU pode aumentar a sensibilidade ao fármaco [24] e reduzir a tumorigenicidade de linhagens de células cancerosas [13]. Mais importante ainda, a perda de DMs foi contribuído ao seu aprisionamento em micronúcleos (MN) [13] e este aprisionamento também pode ser reforçada por baixas concentrações de HU [25], [26].

Existem dois modelos de formação de MN: brotamento /nucleação na interfase e formação de pós-mitótico [27]. existe evidência limitada para a contribuição de HU para a formação de MN por brotamento /nucleação [25]. Um estudo detalhado indica HU pode induzir a formação de MN através do modelo de pós-mitótico [28]. Neste modelo, HU induz a separação de DMS a partir de cromossomas mitóticos tais que os agregados de DMS são formados após a mitose na próxima fase G1 do ciclo celular. Após as células entram na fase S, os agregados DMS estão rodeados pela proteína lamina para produzir um MN citoplasmática replicável [28]. O mecanismo molecular de HU em formação MN foi investigado intensivamente em células cancerígenas do cólon contendo DMS [26]. Baixas concentrações de HU provoca danos no ADN no núcleo de células em fase S, detectável como γ-H2AX focos, mas os sinais não se sobreponham significativamente com DMS cromatina. Como o dano é reparado e células progredir através do ciclo celular, a maioria dos sinais de γ-H2AX são perdidos por metaphase enquanto qualquer sinal que permanecem sobreposição com DMs cromatina. DMS com sinal γ-H2AX foram encontrados para separar os cromossomas anafase e formar MN na próxima fase G1 [26].

HU é um inibidor que inibe especificamente a redutase do ribonucleotídeo (RNR). RNR é uma enzima importante necessário para a

de novo síntese de trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dNTP) em células por ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos convertendo [29], [30], [31]. ribonucleótido-redutase é codificada por dois genes

RRM1

e

RRM2, correspondente à grande R1 e R2 subunidade pequena da enzima, respectivamente. HU é um importante inibidor desta enzima, especificamente a inibição da subunidade R2. RNR é importante não só para a manutenção de suprimentos dNTP necessários para a replicação do DNA, mas também desempenha um papel importante na manutenção da integridade do genoma [32].

A gemcitabina (2 ‘, 2’-difluorodesoxicitidina, GEM) é uma droga anticâncer mais recente e que inibe a subunidade de R1 RNR. Ele tem duas propriedades funcionais. Uma delas é a interacção directa com a subunidade de R1 RNR que diminui a função RNR e, assim, diminui o nível de dNTP em células. Muitos estudos têm indicado que

RRM1

nível de expressão determina a sensibilidade GEM ou resistência [33], [34], [35], [36], [37]. Desde GEM é um análogo da desoxicitidina, a segunda propriedade de GEM é que ele pode ser modificado por enzimas celulares para produzir dFdCTP (2 ‘, 2′-difluorodesoxicitidina-5’-triphsophate) que pode ser incorporada no ADN recentemente replicado por terminação da cadeia [38]. GEM é usado para tratar vários tipos de câncer, como câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC), cancro do pâncreas, cancro da bexiga, cancro da mama e cancro do ovário [39], [40], [41], [42], [43] .

o câncer de ovário é uma das principais doenças malignas ginecológicas. Apesar dos recentes avanços no tratamento deste cancro, mais de metade dos pacientes com doença avançada desenvolvem resistência à terapia, a experiência recorrência da doença, e eventualmente morrem devido a estas propriedades [44]. O tratamento padrão da cirurgia do cancro do ovário é seguido por carboplatina mais a terapia de paclitaxel, no entanto, muitos pacientes desenvolvem a doença recorrente com resistência à terapia de platina [45]. Após a aprovação do uso de GEM no tratamento de cancros do ovário na Europa, EUA, e outros países nos últimos anos, GEM está se tornando uma nova droga promissora no tratamento de cancros do ovário. Recentemente GEM tem sido demonstrado ser eficaz no tratamento de cancros do ovário, especialmente na subclasse resistente a platina, quer utilizado sozinho ou em combinação com outras drogas [1], [40], [44], [45], [46].

dm verificou-se estar presente em amostras de carcinoma do ovário primárias e ascites de doentes com cancro do ovário, e em linhas celulares de cancro do ovário estabelecidas [15], [47], [48], [49], [50] . Um estudo mostrou que, em pacientes a frequência de carcinoma do ovário com DMS é tão elevada como 88% [51]. Um estudo mostrou que, para pacientes de cancro do ovário tratados com baixas concentrações de HU, o número de DMS diminuiu em células de cancro a partir destes pacientes [52]. Embora HU pode ser tomado por via oral ou injectada por via intravenosa, é um inibidor fraco da RNR com uma meia vida de apenas 3,4 horas antes de ser eliminada pelo rim [53]. Neste estudo, verificou-se se GEM pode diminuir seletivamente certas amplificações de genes via DMs, os mecanismos de DMs queda, e qual o valor que tem no tratamento de câncer de ovário. GEM poderia diminuir o número de DMS em células de cancro do ovário, bem como genes amplificados em DMS específicos a uma concentração inferior a 7500X HU. Com a adição de GEM, o número de MN aumentada, e genes transportados em DMS são selectivamente incorporados nestes MN. Mesmo baixas concentrações de GEM poderia provocar danos no ADN nas células, e estes ADN danificado também são incorporadas selectivamente em MN. Propomos que GEM pode causar danos no DNA em DMs, que quando não estiver reparado, são incorporadas seletivamente em MN e perdeu a partir de células. Este, por sua vez afecta a biologia das células de cancro, de tal modo que as células mostram um crescimento reduzido, uma diminuição na formação de colónias, e diminuição da invasão.

Materiais e Métodos

1. Linhas de células e condições de cultura

A linha de células de cancro do ovário UACC-1598 foi uma simpática oferta do Dr. Xin-Yuan Guan (University of Hong Kong) [15]. A linha celular de UACC-1598-4 foi um clone de UACC-1598 seleccionado para a manutenção estável de um elevado número de DMS. Foi feita pelo método de diluição em série. Todas as linhas celulares foram mantidas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) 1640 meios (GIBCO, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e passadas a cada 2 a 3 dias quando cresceram confluentes.

2. Tratamento de Drogas e Análise de Crescimento

HU e GEM foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, EUA) e Lilly France (França), respectivamente, e preparado de acordo com as recomendações do fabricante. A solução estoque HU foi feita em dimetil sulfóxido (DMSO) e a solução estoque GEM foi feito em NaCl a 0,9%. As concentrações de HU utilizados em experiências foram de 100 e 150 pM seguintes concentrações publicados [23], [24], [26]. As concentrações de GEM foram utilizados 10 e 20 nM, que eram diferentes diluições da sua concentração inibitória máxima metade (IC

50) nas linhas celulares utilizadas neste estudo. A concentração de gemcitabina utilizada neste estudo foi de 3-6 vezes menor do que o padrão

In vivo

dose dada a pacientes (Lilly France). As concentrações de 10 e 20 nM de GEM corresponde a 0,01 IC

50 e 0,02 IC

50 de GEM na linha de células UACC-1598-4. As mesmas concentrações correspondem a 0,032 e 0,064 IC

50 de GEM na linha de células UACC-1598. As células foram passadas a cada 2 a 3 dias e compostos frescos foram adicionados. O IC

50 de GEM foi calculada utilizando CellTiter 96 AQ

ueous Uma célula de solução Proliferação Assay Kit da Promega (Madison, WI, EUA), seguindo o protocolo do fabricante.

3. MTS, Formação de Colónias e invasão Ensaios

Resumidamente, os ensaios biológicos celulares foram realizados como se segue. Para o ensaio de MTS, 2000 células foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços. As células foram seja permitido crescer em meio sozinho ou meio contendo 150 mM HU ou 20 nM GEM. O OD de cada poço foi lida todos os dias após o CellTiter 96 AQ

ueous protocolos Uma Solução kit de Proliferação Celular Ensaio e plotados. Para a formação de colónias, 2000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços, quer na presença ou na ausência de compostos. As células foram deixadas a crescer durante 14 dias antes de ser lavada com solução salina de fosfato tamponada (PBS), etanol fixação e coloração de Giemsa. Fotos foram tiradas para cada poço e as colónias foram contadas manualmente com software ImageJ. Três repetições foram feitas para cada condição. Para a invasão de células, sessenta mil células foram semeadas em Matrigel BD BioCoat Invasão secções (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA), e deixou-se invadir através de uma membrana de matrigel. Após 72 horas, o número de células que invadiram através da membrana foi contado. Três repetições foram realizadas para cada condição composta.

4. Espalhe metáfase

As células foram tratadas com colcemida (Sigma) durante 1,5 h, tripsinizadas e lavadas em PBS antes de preparar metáfase. As células foram primeiro inchada em 9 ml de pré-aqueceu-se 0,075 M de KCl durante 14 min, a 37 ° C. Depois de inchamento, as células foram pré-fixado com 1 ml de solução fixadora acabado de fazer (mistura de metanol 3: 1 de ácido acético) e imediatamente centrifugado. As células foram subsequentemente fixadas e centrifugou-se duas vezes com 10 ml da solução fixadora. Os sedimentos de células da última centrifugação foram ressuspensas em 0,5 ml de fixador, e uma pequena quantidade foi feita em uma pipeta de Pasteur e deixado cair em lâminas de vidro limpas. cromossomos mitóticos foram observadas por coloração das lâminas com Giemsa e fotografado com a Olympus BX41 microscópio (Olympus America Inc., Melville, NY, EUA) ligado a uma câmara de vídeo a cores JVC TK-C75U (JVC, Japão) com aumento de 1000x. O número de DMS presente em cada célula foi contado manualmente. O número de células contadas varia de 60 a 100 para cada amostra.

5. Isolamento de ADN genómico e PCR em tempo real

As células foram sedimentadas e o DNA genómico foi preparado com o ADN do sangue QIAamp Mini Kit (Qiagen, Alemanha), como descrito pelo fabricante. PCR em tempo real foi realizado usando a mistura de SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotecnologia (Dalian) Co., Ltd., China) em 480 LightCycler (Roche Applied Science, Alemanha) sistema de detecção de PCR em Tempo Real. O nível de amplificação do

MYCN,

EIF5A2

, e

MCL1

foram detectados, e

ACTB

serviu como controle interno. As médias ± desvio padrão (DP) de três repetições foi representada graficamente para cada conjunto de comparações entre as células de tratamento e de controlo. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:

EIF5A2

, 5′-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3 ‘(F), 5′-CAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3’ (R);

MYCN

, 5′-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3 ‘(F), 5′-GCAACGGCATTCTCTCAG-3’ (R);

MCL1

, 5′-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3 ‘(F), 5′-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3’ (R);

ACTB

, 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3 ‘(F), 5′-AAGCAAATAGAACCTGCAGAG-3’ (R).

6. Fluorescente

In situ

fluorescente (FISH)

metáfase foram preparados pela primeira vez como descrito acima e, em seguida, de FISH foi realizada com o seguinte protocolo. Bacteriana cromossomo artificial (BAC) RP11-654K19 clone para

EIF5A2

, BAC RP11-355H10 clone para

MYCN

e RP11-54A4 clone BAC para

MCL1

foram selecionados para sondas FISH marcado com cianina 3 (Cy3), isotiocianato de fluoresceína (FITC), ou cianina 5 (Cy5). As lâminas foram então contrastadas com 4, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e as fotografias foram tiradas com um microscópio Leica DM5000B (Leica Microsystems, Alemanha) com aumento de 1000x. O número de células analisados ​​varia de 180 a 280 para cada amostra.

O sinal completo do núcleo da célula observamos é fixado em 100%. As células foram agrupadas em 3 categorias para a análise da distribuição de sinal: Grupo 1 inclui células com 30% do sinal, o grupo 2 inclui as células com o sinal de 30-60%, e o Grupo 3 inclui células com 60% do sinal. O grau de o sinal é quantificado usando o software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) para análise da área relativa do sinal para a região do núcleo da célula. Um micronúcleo (MN) é definida como qualquer região DAPI coradas com menos brilho do que o núcleo corado DAPI e com uma área de menos do que um terço do núcleo da célula. As células com dois ou mais micronúcleos não foram contadas para eliminar artefactos. As células também foram agrupadas com base no status MN: Grupo A inclui células sem MN, Grupo B inclui células com MN mas será que o MN não conter sinal e Grupo C inclui células com MN contendo sinal

7.. Imunofluorescência

As células foram semeadas em lamelas em placas de seis poços e tratadas com os diferentes compostos para os tempos indicados antes de realizar imunofluorescência. Resumidamente, as células em lamelas foram lavadas 3 × 10 minutos em PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos à temperatura ambiente, e re-hidratada 3 × 10 minutos com PBS. As células foram permeabilizadas e bloqueada em tampão KCM (KCl 120 mM, NaCl 20 mM, Tris-HCl a 10, 1 mM de EDTA, 0,1% de Triton X-100, 2% de albumina de soro de bovino, e 10% de leite desnatado em pó) para seis hora a 4 ° C e incubadas com (Ser139) anticorpo anti-H2AX-fosfo (JBW301 clone, Millipore, Billerica, MA, EUA) diluídos em tampão KCM (1:500) durante a noite a 4 ° C. As células foram então lavadas 3 × 10 minutos em PBS, incubadas com CF555 de cabra anti-IgG de ratinho (H + L) (Biotium, Hayward, CA, EUA) diluídos em tampão KCM (1:1000) durante 1,5 horas à temperatura ambiente, e lavou-se de novo por três vezes 10 minutos cada, com PBS. O ADN foi visualizado pela contra as células com DAPI e montadas em lâminas. As imagens foram obtidas utilizando um microscópio Leica DM5000B. Para analisar a extensão dos danos DNA dentro das células, as células foram agrupados de acordo com os seus sinais de γ-H2AX, independentemente do status MN. As células foram agrupadas em cinco categorias, incluindo Sem sinal, 30% de sinal, sinal de 30-60%, 60% de sinal e sinal completo por software Metamorph. Para a pontuação de MN em células libertadas a partir de compostos, as células foram agrupados em quatro categorias: Grupo 1 contém células sem MN, Grupo 2 contém células com manganês e o manganês não contém sinal, Grupo 3 inclui células com MN, Grupo 4 contendo sinal inclui células com 1 ou 2 pontos de sinal forte dentro do núcleo da célula perto da periferia do núcleo.

8. Análise Estatística

A significância estatística nos dados mestres e dados em tempo real PCR foram analisados ​​por meio de teste t não emparelhado com exceção de dados DMS em UACC-1598-4, que foram calculados com a análise de variância (

ANOVA

), seguido de teste de comparação de pós múltipla de Dunnett. A significância estatística do sinal de FISH, γ-H2AX vs. não há dados de sinal e dados MN foram analisados ​​com o

exata teste

de Fisher. Significado do MTS e formação de colônias de dados foi calculado com

ANOVA

. A significância estatística de invasão celular foi calculada com o teste

Qui-quadrado. A significância estatística de todos os dados são indicadas como se segue: * indica um

P

valor de 0,01 a 0,05, ** indica um

P

valor entre 0,001 e 0,01, e *** indica uma

P valor

de . 0.001

Resultados

1. GEM diminui o número de DMS no ovário Cancer Cell Linha UACC-1598 e o clone

UACC-1598-4

UACC-1598 é uma linha celular de cancro do ovário que consiste em a amplificação do gene na forma de DMS. UACC-1598-4 foi criado pelo método de diluição em série por sementeira e isolamento de células isoladas a partir da linha celular parental UACC-1598 e a preparação de metáfase se espalha para determinar o número de DMS um clone contém. Este clone foi encontrada para ter um aumento no número de DMS, quando comparado com a linha celular parental (Figura 1A). Enquanto a linha de células UACC-1598 continha uma média de 34,61 DMs por célula, UACC-1598-4 tinha uma média de 76.16 DMs por célula que é mais que o dobro do valor para a linha celular parental. foram encontrados a diferença entre o número de DMs em UACC-1598 e o clone UACC-1598-4 ser estatisticamente significativa com um

valor P

de . 0.001

A. imagens representativas de metaphase propagação do UACC-1598 e células UACC-1598-4. As setas indicam DMs. O número de DMS em cada célula da metafase foi contado e representados graficamente. *** Indica

P Art 0,001. B. Metaphase barrar foram preparados para células cultivadas na presença de concentrações baixas de um ou outro ou uma gema HU durante 1 semana ou 2 semanas. O número de DMS em cada célula da metafase foi contado. As linhas vermelhas representam a média e as linhas pretas representam o SEM. * Denota um

P valor

de 0,01 a 0,05 e ** denota um

P valor

entre 0,001 e 0,01.

Em primeiro lugar, testou se a diferença no número de DMs entre UACC-1598 e UACC-1598-4 afeta a sensibilidade à GEM. Nós utilizamos o método MTS para o cálculo do IC

50 de GEM nas duas linhas celulares e descobriu que havia uma diferença. O IC

50 de GEM foi de 310 nM em UACC-1598 e 970 nM em UACC1598-4 (dados agora apresentados), ea diferença é provavelmente devido a mais DMs a ser alvo e eliminado do UACC1598-4. Uma vez que o clone UACC1598-4 foi seleccionada pela sua geração e a manutenção de um grande número de DMS, que usado pela primeira vez esta linha de células para determinar se GEM podem causar uma perda da DMS porque a hipótese de que ele pode ser mais fácil de detectar uma diferença na número de DMs. As células foram deixadas a crescer em meios contendo 10 nM (0,01 × IC

50) da gema por duas semanas antes de se espalha em metafase foram preparados. A nossa experiência indicou que a adição de concentrações baixas de GEM pode diminuir o número de DMS em células de cancro do ovário UACC-1598-4, semelhante à adição de HU (Figura S1A). O número médio de DMs caiu 76,16-25,23 em 150 M de HU. Além disso, o número médio de DMS caiu para 48.99 em 10 nM de GEM.

, em seguida, determinar se GEM pode diminuir o número de DMS na linha celular parental UACC-1598. As células foram deixadas a crescer em meios contendo 10 nM (IC 0,032 ×

50) e 20 nM (IC 0,064 ×

50) de GEM antes barrar metafase foram preparados. Descobrimos que GEM a 10 nM não era eficaz nesta linha celular. Após a incubação de células UACC-1598 em 20 nM de GEM, observou-se uma diminuição estatisticamente significativa no número de DMS em ambos 1 semana e 2 semanas após as células foram continuamente cultivadas em meios contendo GEM (Figura 1B). O número médio de DMs diminuiu 37,00-24,83 depois de 1 de crescimento semana na presença de GEM, e diminuiu 31,84-21,59 após 2 semanas de crescimento na GEM. Desde HU foi dissolvido em DMSO, que eliminado o efeito de DMSO nas nossas experiências comparando HU células tratadas com DMSO células tratadas. O número médio de DMS diminuiu de 29,37 em células cultivadas em meio contendo DMSO a 20,77 em células cultivadas em meio contendo 150 uM HU durante 2 semanas. Também em relação a células de controlo tratadas células de DMSO e descobriram que a diferença entre os dois não foi estatisticamente significativo (dados não apresentados), indicando que o DMSO na concentração foi usado como o veículo para HU não afecta significativamente os nossos resultados experimentais. Além disso, também descobrimos que GEM é eficaz na redução de DMS a partir de outras linhas celulares, bem como (dados não mostrados). Por isso, utilizadas HU a uma concentração de 150 uM e GEM a uma concentração de 20 nM para todas as experiências seguintes.

2. GEM medeia a perda de genes DMs Amplified

EIF5A2

e

MCL1

Uma vez que descobrimos que GEM pode diminuir o número de DMs tanto UACC-1598 e UACC-1598- 4, a próxima pergunta que fizemos é se genes amplificados nas DMs são também diminuiu. Sabe-se que oncogenes

EIF5A2

e

MYCN Quais são dois genes amplificados em UACC-1598 [15], [16], e

MCL1

também foi encontrado para ser amplificado nesta linha de células (dados não publicados). Em primeiro lugar, verificou-se que estes três genes analisados ​​estão presentes no DMs com experimentos de peixe (Figura 2A). então nós células cultivadas em HU ou GEM separados em 3 grupos de acordo com o nível de

EIF5A2, MYCN,

e

MCL1

sinais (Figura 2B). O grupo 1 inclui células com sinal de 30%, o que corresponde a células com menos sinais de

EIF5A2

,

MYCN

, e

MCL1

, e é um indicador de células com menor número de DMs; o grupo 2 inclui as células com sinal de 30-60%; e o grupo 3 inclui células com 60% do sinal, que é um indicador de células com mais DMS. A percentagem de células em cada grupo foi representada graficamente. A percentagem de células no Grupo 3, que contém as células com maior do que 60% sinais, diminuiu na presença de qualquer HU (de 11% para 6%) ou GEM (a partir de 16% a 7%). Além disso, a percentagem de células no Grupo 2 diminuiu de 33% para 24% para células tratadas com HU e de 37% para 25% nas células tratadas GEM. Em contraste com a diminuição das percentagens de células no Grupo 2 e 3, a percentagem de células no grupo 1 aumentaram 14 a 21% em células tratadas com HU (de 56% a 70%) ou GEM (a partir de 47% a 68% ). O aumento da percentagem de células do grupo 1 no HU ou células GEM tratados indica células começaram a perder as suas DMs. Além disso, consolidamos os grupos 2 e 3 em um grupo grande, e análise estatística mostrou que as diferenças observadas entre DMSO e HU ou controle e células GEM tratada é estatisticamente significativa (Figura 2B). Estes resultados indicam que o sinal dos genes amplificados

MYCN,

EIF5A2

, e

MCL1

de DMS em células UACC-1598 diminuída na presença de ambos HU e GEM . Resultado semelhante foi observado para GEM ao analisar

MYCN

e

EIF5A2

em UACC-1598-4 células (Figura s1b).

A. Genes

EIF5A2

,

MYCN

, e

MCL1

estão presentes no DMs em células UACC-1598. Metaphase disseminação de células UACC-1598 detectados com a sonda de DNA para

EIF5A2

,

MYCN

, e

MCL1.

Para as imagens sobrepostas,

EIF5A2 Comprar e

MCL1

sinais são mostrados em vermelho, e

MYCN

sinal é mostrado em verde. Sobreposta

EIF5A2

/

MYCN

e

MCL1

/

MYCN

são mostrados em amarelo. imagens B. representativos de

EIF5A2

/

MYCN

e

MCL1

/

MYCN

sinais de FISH em células de UACC-1598 interfase e como as células individuais são separadas em diferentes grupos.

MYCN

sinal é mostrado em verde,

EIF5A2

e

MCL1

mostrado em vermelho, ea sobreposição é mostrado em amarelo. A porcentagem de células nos Grupos 1, 2 e 3 é baseado em

EIF5A2

/

MYCN Comprar e

MCL1

/

sinais de FISH MYCN

. A análise estatística mostrou as diferenças de células no Grupo 1 e Grupo 2/3 em comparação com as células de controlo. * Denota um

P valor

de 0,01 a 0,05 e ** denota um

P valor

entre 0,001 e 0,01.

Além disso, nós também confirmou nossos resultados, realizando-PCR em tempo real para analisar a amplificação de

EIF5A2, MYCN,

e

MCL1

em células cultivadas na presença de HU ou GEM (Figura 3). Nós vimos uma diminuição estatisticamente significativa na amplificação da

EIF5A2

e

MCL1

genes quando as células foram cultivadas na presença de qualquer HU ou GEM. Para as células tratadas com HU, uma diminuição no nível de amplificação de ADN relativa de 1,151 ± 0,658 ± para 0,213 0,092 foi observado para

EIF5A2

, e uma diminuição no nível de amplificação de 0,860 ± 0,422 ± para 0,122 0,106 foi observado para

MCL1

. Para as células tratadas com GEM, foi observada uma diminuição no nível de amplificação de 0.930 ± 0,094-0,383 ± 0,005 para

EIF5A2

, e uma diminuição no nível de amplificação de 1.242 ± 0,343-0,388 ± 0,048 foi observado para

MCL1

. No entanto, não detectamos uma diminuição estatisticamente significativa na amplificação da

MYCN

em qualquer HU ou células GEM tratada. Resultados semelhantes também foram adquiridas por células UACC-1598-4, embora com a mudança obscuro de

MCL1

(Figura S1C).

O nível de amplificação dos genes

EIF5A2

,

MCL1

, e

MYCN

foi analisada por PCR em tempo real. O nível de amplificação de cada um dos genes em células tratados com o composto é comparado com células de controlo (DMSO para tratada HU, e Ctrl. Para tratada GEM), e o nível de amplificação relativo médio ± DP é representada graficamente. * Denota um

P valor

de 0,01 a 0,05 e ** denota um

P valor

entre 0,001 e 0,01, *** denota

P

. 0,001

3. Aprisionamento de Genes DMs amplificado em micronúcleos

Uma maneira em que DMs são pensados ​​para ser eliminada a partir de células é através da incorporação de micronúcleos. Com genes amplificados como sondas, observaram-se algumas células com MN contendo sondas, enquanto outros não MN contendo as sondas (Figura 4). Foi determinada a percentagem de formação de MN em células tratadas com HU ou GEM, e também observar se esses micronúcleos continha

EIF5A2, MYCN

e

MCL1

sinais (Tabela 1). Veículo de DMSO células tratadas têm uma frequência de formação de MN 13,87 × 10

-2 enquanto HU células tratadas têm uma frequência de formação de 30.61 MN × 10

-2, indicando HU é eficaz em induzir a formação de MN. Além disso, GEM também é eficaz em induzir a formação de MN. As células tratadas com 20 nM GEM tem uma frequência formação de MN de 21,82 × 10

-2 em comparação com 13,98 × 10

-2 em células de controlo. Após examinar

EIF5A2, MYCN,

e

sinais MCL

no MN, também notamos um aumento na frequência de MN que contém

EIF5A2, MYCN,

e

sinais MCL

, designado MN (

EIF5A2

+

MYCN

+

MCL +

) ou MN (+) para breve, para as células do HU e tratamento GEM grupos. A 2,57 e 1,81 vezes de aumento na frequência MN (+) foi observada para HU e GEM células tratadas respectivamente. Juntos, nossos resultados sugerem que os genes PEIXES DMs amplificados

EIF5A2, MYCN,

e

MCL

são perdidos a partir de células tratadas com HU ou GEM por ser aprisionado seletivamente em MN. Resultados semelhantes foram obtidos com células UACC-1598-4 (Tabela S1).

Os dois painéis restantes são fotos representativas de células mostrando MN sem sinal eo direito dois painéis são imagens representativas de células mostrando MN com

EIF5A2

/

MYCN

ou

MCL1

/

sinal em MYCN

.

MYCN

sinal é mostrado em verde,

EIF5A2

e

MCL1

são mostrados em vermelho, ea sobreposição é mostrado em amarelo. As setas indicam MN.

4. Baixas concentrações de GEM provoca danos no DNA em células semelhantes a baixas concentrações de HU

Baixas concentrações de HU foram encontrados para causar danos no ADN detectável como focos γ-H2AX nas células. Nós determinado se GEM também pode causar danos ao DNA. Nós tratada células UACC-1598 com HU ou GEM por 24 horas e realizada imunofluorescência para determinar a quantidade de focos γ-H2AX nas células individuais.