Abstract

Fundo

Circulação DNA tumoral (ctDNA) carrega informações sobre a carga tumoral. No entanto, o espectro de mutações é diferente entre os tumores. Este estudo foi projetado para examinar a utilidade de ctDNA para monitorar a carga tumoral baseado em um perfil de mutação individual.

Metodologia

O DNA foi extraído a partir de um total de 176 amostras, incluindo pré e pós plasma operacional, os tumores primários e células mononucleares de sangue periférico (PBMC), a partir de 44 indivíduos com tumor colo-rectal que foram submetidos a ressecção curativo de tumores colo-rectais, assim como nove indivíduos saudáveis. Usando um painel de 50 genes associados a cancro, mutações tumorais únicas foram identificadas comparando as variantes de um único nucleótido (SNVS) a partir de tumores e de PBMC com um sequenciador Ion PGM. Um grupo das mutações tumorais Exclusivos de tumores individuais foram designados como mutações marcadoras individuais (MMS) para rastrear a carga tumoral por ctDNA usando gotícula de PCR digital (ddPCR). A partir destas experiências, três objectivos principais foram avaliados: (a) as mutações tumor original; (B) Espectro de mutação de um tumor; e (c) mudanças na freqüência do alelo do MMS em ctDNA após a ressecção curativa do tumor.

Resultados

Um total de 128 mutações pontuais de genes foram identificados em 27 tumores colorretais. Vinte e seis genes foram mutados em pelo menos uma amostra, enquanto que 14 genes foram encontrados para ser mutado em uma única amostra, respectivamente. Uma média de 2,7 genes foram mutados por tumor. Posteriormente, 24 MMs foram selecionados a partir SNVS para monitoramento carga tumoral. Entre os MMs encontrados por ddPCR com 0,1% de frequência de alelos variantes no ADN de plasma, 100% (8 de 8) exibiu um decréscimo na pós-operação ctDNA, enquanto que nenhum dos 16 MMs encontrados por ddPCR com 0,1% freqüência do alelo variante no DNA no plasma mostraram uma diminuição.

Conclusões

Este painel de 50 genes de cancro associados parecia ser suficiente para identificar, tumor-única, alterado de marcadores individuais ctDNA no cancro pacientes. Os MMs mostrou a utilidade clínica no monitoramento de carga do tumor colorretal tratado com curativo se a freqüência do alelo de MMS no DNA plasma está acima de 0,1%

Citation:. Sato KA, Hachiya T, Iwaya T, Kume K, Matsuo T , K Kawasaki, et al. (2016) Individualizado detecção de mutações no DNA circulante Tumor de Monitoramento Colorectal Tumor Burden Usando um Painel de sequenciação genética Câncer-associados. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10.1371 /journal.pone.0146275

editor: Alvaro Galli, CNR, ITALY

Recebido: 11 de junho de 2015; Aceito: 15 de dezembro de 2015; Publicação: 04 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Sato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Keiryoukai Research Foundation No.125 da University Medical Iwate [KAS]; e do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão por MIAST (Medical Innovation pela Ciência Avançada e Tecnologia) projeto da subvenção-in-Aid para a Fundação Estratégico de pesquisa em universidades privadas [S1001001 para SSN]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a avaliação quantitativa de circulação de ADN de tumor (ctDNA) foi demonstrado ser útil para a monitorização carga tumoral em resposta ao tratamento [1, 2]. No entanto, os genes mutados em muitos tipos de cancros representam apenas uma pequena percentagem do número total de genes presentes, sugerindo que apenas um número limitado de genes estão associados com o desenvolvimento e progressão de cancro [3, 4]. Portanto, um conjunto de genes selectivos conhecidos por estarem associados com o cancro é fundamentalmente necessário para monitorar a carga tumoral. Na verdade, o acompanhamento da eficácia do tratamento por ctDNA foi realizada utilizando um conjunto de genes alvos bem estudados, incluindo

KRAS

,

BRAF

,

HER2

, e outros [5 -9]. Por outro lado, a informação sobre o peso da monitorização do tumor após a intervenção cirúrgica é limitada porque não se sabe quais os genes mutados-tumorais original deve ser monitorizado para cada paciente [10]. Na verdade, os dados implicaram que um número limitado de mutações de tumor único pode-suficientemente representam o volume e as características (por exemplo, resistência à droga) de tumores individuais [11]. Se uma pequena quantidade de mutações de tumor-exclusivo são identificados a partir de tumores primários, em seguida, eles poderiam ser usados ​​para detectar as mutações em ctDNA. Isto representa uma abordagem vantajosa e rentável para monitorar a carga tumoral após a intervenção cirúrgica.

A ideia de utilizar ctDNA de pacientes com câncer de monitorar a carga tumoral nos levou a projetar o estudo focado em pacientes com câncer colorretal que receberam curativos a remoção do tumor. Nossa estratégia era coletar amostras de tumores colorectal individuais através de tumor colorretal ressecção curativa endoscópica ou laparoscópica, bem como amostras de sangue. Em contraste com estudos anteriores usando tumores extremamente avançadas, incluindo casos com ressecção incompleta [1, 2, 7], os nossos resultados demonstram que mutações marcadores individuais (MMS) em ctDNA pode ser útil para o monitoramento pós-operatório, a carga tumoral colorectal resectable na base de diminuição da freqüência do alelo de ctDNA no plasma pós-operatório.

pacientes e Métodos

amostras Humanos e desenho do estudo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Iwate Institutional Review University Medical em conformidade com a declaração de Helsínquia (HG H24-22). Um consentimento por escrito indivíduo foi obtido de todos os participantes e todas as análises foram realizadas de forma anônima. Em princípio, os doentes eram elegíveis se sua ressecção cirúrgica ou endoscópica foi indicado para 0 a III tumores colorretais benignos ou palco, e não tinha história prévia de qualquer tratamento no momento do consentimento informado. Todos os casos foram analisáveis ​​necessário para fornecer os seguintes quatro tipos de materiais: Plasma pré e pós-operatório (pelo menos 24 h após a ressecção do tumor), tumor primário, e as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As amostras de sangue foram atraídos para o pré rotina e exames laboratoriais pós-operacionais. Ou oito ou 16 ml de sangue foi coletado em um tubo de coleta de sangue BD Vacutainer CPT (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ). Dentro de duas horas após a recolha, os tubos foram centrifugados a 1800

g

durante 20 min à temperatura ambiente para separar em camadas de plasma e PBMC. A fase superior de oito ml de sangue foi então transferida para um tubo cinco mL marcado com o número de identificação do doente, únicos. Os tubos foram imediatamente armazenados a -80 ° C até o isolamento do ADN. O ADN genómico total foi extraído utilizando o QIAamp Circulating Nucleic Kit de Ácido para o plasma e o Kit QIAamp DNA Mini para tumores primários e PBMC (Qiagen, Venlo, Países Baixos). A quantidade de DNA extraído foi medido usando o ensaio de elevada sensibilidade de dsDNA Qubit® 2,0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). No presente estudo, a nossa experiência preliminar confirmou que deixando 5-7mm de “tamponamento” camada de buffy coat após a centrífuga suficientemente impede que a camada de plasma a partir de contaminação do sangue e os restos celulares, e os rendimentos de ADN de qualidade aceitável [12, 13]. Relativa número de cópias do genoma de ADN de plasma também foi estimada por PCR quantitativa (qPCR) para o gene LINHA-1 utilizando o iniciador define previamente descrito [14].

extracção de ADN a partir de linha celular de cancro do cólon humano

a linha de células de cancro do cólon humano, HCT116, foi obtida em 2008 da Divisão de Tratamento do câncer and Repository Tumor Diagnóstico, National cancer Institute (NCI MTA # 1-2093-08). A linha celular foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% e o DNA genómico foi extraído utilizando um QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Venlo, Países Baixos) no prazo de três passagens após a descongelação.

Multiplex PCR e biblioteca construção usando CHPv2

O CHPv2 é um conjunto de primers de PCR que direcionar 207 amplicons para 2885 mutações em 50 genes associados ao câncer [15] (Life Technologies, Carlsbad, CA). A lista inteira de genes está disponível através do site do fornecedor (https://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Aproximadamente 10 ng de ADN por amostra foi utilizada para a produção de fragmento amplificado por PCR multiplex utilizando o Ion AmpliSeq CHPv2 e ião AmpliSeq Biblioteca Kit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). A PCR multiplex piscina reacção resultante foi utilizado para a preparação da biblioteca sequência alvo. As sequências dos iniciadores para a PCR em multiplex foi parcialmente digerido para ligar adaptadores de código de barras (ião P1 e Adaptador Ion XpressTM Bacode X, Life Technologies, Carlsbad, CA), seguido por um sistema de purificação de ácido nucleico baseadas em esferas (AMPure® XP Reagent, Life Technologies, Carlsbad , CA). Após a confirmação de que o tamanho final do fragmento biblioteca atingiu um máximo de 130 pb, os fragmentos da biblioteca foram amplificado por clonagem por PCR de emulsão (Ion PGM Molde OT2, Life Technologies, Carlsbad, CA). As partículas da emulsão contendo fragmentos de PCR amplificado por clonagem foram, então, aplicado sobre um chip semicondutor sequenciamento (Ion 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) para sequenciamento paralelo maciço de um seqüenciador Ion PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA).

alvo sequenciação profunda

Os dados de sequenciação foram salvos em formato BAM para análise a jusante. O alinhamento sequenciamento foi avaliada com Torrent Suíte V.3.6.2 Software (Life Technologies, Carlsbad, CA) para analisar código de barras lê e alinhar o lê para o genoma de referência (genoma humano build19; hg19). Para a detecção de variações na sequência de alvo, a extensão da cobertura de cada fragmento amplificado foi ajustado para se obter, pelo menos, a profundidade média de 1400 x de tumores primários e 700 x de ADN de plasma, onde o v3.6 Ion Torrent Variante chamador foi definida a uma frequência alélica superior a 0,1% para uma variante. Um Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) também foi usado para visualizar o alinhamento, o que permitiu-nos para inspecionar variações falsamente definidos pelo viés vertente e os erros de sequenciamento.

identificação e detecção de genes para MMS potenciais

MMS a partir do tumor primário foram designados para priorizar variantes de nucleotídeo único (SNVS) que eram susceptíveis de ser detectada em ctDNA. O sequenciamento direcionado a partir do painel de cancro identificado SNVS-tumorais original (isto é, mutações somáticas), comparando os resultados de sequenciação do tumor primário e as PBMCs (isto é, os polimorfismos da linha germinativa) correspondente. Em resumo, o algoritmo para a identificação de mutações de tumor-exclusivo é como se segue: (a) Filtro de curto lê ( 50 nt) utilizando ficheiro fastaq para ADN a partir do tumor, PBMC, e plasma; (B) Mapa filtrada fragmentos sobre hg19 usando Burrows-Wheeler alinhador de DNA do tumor, PBMCs e plasma; (C) Detectar SNVS usando GATK Unified Genotyper para o DNA do tumor ou PBMC; (D) Lista SNVS tumorais única comparando SNVS do tumor e PBMC; e (e) Identificar as mutações de tumor-exclusivo das SNVS tumorais única que foram mapeados na sequência alvo de CHPv2. Todo o processo de execução do algoritmo leva seis horas, utilizando um computador de mesa comum (processadores Intel Core 2 Duo com 3 GB de memória de acesso aleatória) para 1,5 GB de dados de sequenciamento. As mutações de tumor-exclusivo resultantes podem ser utilizados como marcadores ctDNA. Nosso algoritmo in-house identifica tumor primário fragmentos SNV que são diferencialmente detectados a partir de ADN PBMC. Ele permite a selecção dos fragmentos com elevada frequência de alelo, que possui uma alta probabilidade de detecção em ctDNA [11]. Das mutações resultando tumorais única em qualquer freqüências variantes do SNVS, MMS para cada tumor foram priorizados com base nos seguintes critérios: (a) cobertura de mais de 10 variante; (B) cobertura de mais de 5 variante se há mutações tinham mais de 10 cobertura variante; e (c) disponibilidade de QX200 validado

TM Gota Digital

TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) seqüências de primers e sondas (S1 tabela). A freqüência do alelo de MMs no plasma foi monitorado por ddPCR utilizando os conjuntos de iniciadores e de sondas específicas.

ddPCR

Cada mistura foi preparado com 20 tampão de reação ml, 2 x ddPCP SuperMix para sondas (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), e 10 ng de ADN molde. As misturas reaccionais de PCR foram separados em gotículas de emulsão de dimensão uniforme. As gotículas foram distribuídas para uma microplaca de 96 poços para utilização com um termociclador convencional. Uma reacção de PCR padrão foi utilizado como se segue: 40 ciclos de 94 ° C durante 30 s e 55 ° C durante 60 s; e uma extensão final a 98 ° C durante 10 minutos, dos quais a temperatura de emparelhamento foi sujeita a mudar, dependendo dos iniciadores. O produto foi armazenado a 4 ° C. O produto de PCR foi então colocado no leitor de QX200 gota (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e os resultados foram analisados ​​utilizando QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

A análise estatística

de qualquer JMP 10,0 (SAS Institute, Cary, NC) ou Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) foi usado para análise estatística. valores e freqüências clínico-patológicos e de sequenciação foram analisados ​​através do χ

2, teste exato de Fisher, e aluno

t

-teste, dependendo dos grupos de sujeitos.

Resultados

os pacientes

Entre maio de 2013 e agosto de 2014 37 pacientes com câncer colorretal avançado e 22 tumores colorretais endoscopia-ressecáveis ​​foram consentido para o estudo antes de um diagnóstico histopatológico final. A inscrição dos pacientes /indivíduos saudáveis ​​e visão geral do estudo são apresentados (Fig 1). No grupo da cirurgia, seis pacientes eram inelegíveis: cinco pacientes foram encontrados para ter a doença do estágio IV durante a cirurgia e um paciente teve várias lesões de câncer primário. Entre os pacientes elegíveis, o processo de aquisição espécime não em três casos. Portanto, 28 conjuntos de amostras total foram obtidos de 31 pacientes elegíveis. No grupo de endoscopia, um paciente recusou-se a participar do estudo, e um paciente tinha insuficiência renal após a admissão. Entre os pacientes elegíveis, quatro pacientes tinham tumores que eram demasiado pequeno para amostragem. Portanto, 16 conjuntos de amostras total foram obtidos de 20 pacientes elegíveis. Sangue de 10 indivíduos saudáveis ​​(isto é, pacientes com idade entre 22 e 68 anos, três mulheres e sete homens) também foram recolhidos usando o mesmo consentimento informado por escrito. Um voluntário foi encontrado para ser grávida depois de tomar uma amostra de sangue e, assim, descartada. Em geral, pelo menos um tipo de amostra foram obtidos a partir de 60 indivíduos e um total de 176 amostras do conjunto de quatro materiais de 44 pacientes foram obtidos (Figura 1). características clinicopatológicas dos pacientes (Tabela 1) e os níveis de marcadores tumorais (antígeno carcinoembrionário; CEA) estão resumidos (S1 Fig). No grupo da cirurgia, 30 dos 31 (96,8%) pacientes elegíveis foram observados durante pelo menos um ano. Quatro dos 30 (13,3%) pacientes recaíram e nenhum paciente morreu durante o período de observação (média: 14,3 meses). Nenhum paciente no grupo da endoscopia ainda não tinha visitado o nosso hospital após a ressecção do tumor a partir de fevereiro de 2015.

Todas as amostras foram coletadas prospectivamente. As amostras foram coletadas a partir dos três grupos seguintes; Cirurgia, Voluntários Endoscopy, e saudável. grupos de cirurgia e endoscopia conter Pré (plasma pré-operatório), PBMC, tumor, e Post (plasma pós-operatório) amostras. As amostras de pacientes que apresentam a doença em estágio IV, o tamanho da amostra insuficiente, ou a quantidade de DNA extraído insuficientes foram excluídos do estudo (informações detalhadas no texto). A cor de cada caixa indica quais os procedimentos foram utilizados para análise de cada tipo de amostra.

Avaliação da qualidade das extraído DNA

A mediana (intervalo) quantidade total de DNA a partir de tumores primários, de ADN de plasma e PBMC foi de 9,4 ug (1,4-12,0), 58,1 ng (15,4-915), e 4,7 ug (3,2-10,3), respectivamente. O rendimento do DNA no plasma foi suficiente para realizar ensaios a jusante, incluindo a construção da biblioteca sequência e ddPCR. A quantidade de DNA no plasma (intervalo; 83-5,435 ng /ml por plasma) exibiu muito alta correlação positiva (r = 0,9651, p 0,0001) com o número de cópias de

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