Sumário

proteína de choque térmico 70 cognato (Hsc70) actua como uma chaperona molecular para a manutenção de proteínas intracelulares, o que permite que as células cancerosas para sobreviver sob stress proteotoxic. Nós tentou usar Hsc70 para identificar moléculas-chave na sobrevivência da célula cancerosa. Aqui, foi realizada a análise proteómica à base de espectrometria de massa utilizando purificação por afinidade com anticorpos anti-Hsc70; como resultado, 83 proteínas diferencialmente expressos foram identificados sob condições de estresse. Este resultado implica que houve uma mudança nas proteínas com as quais interagiram Hsc70 em resposta ao stress. Entre as proteínas identificadas sob ambas as condições tratadas com 5-f luorouracilo com depleção de soro e, Rab1A foi identificada como uma molécula essenciais para a sobrevivência de células de cancro. Hsc70 interagiu com Rab1A em uma maneira dependente da chaperona. Além disso, Hsc70 knockdown diminuiu o nível de Rab1A e aumentou o nível da sua ubiquitinação sob condições de stress, o que sugere que Hsc70 impediu a degradação de Rab1A desnaturado por exposição ao estresse. Nós também descobrimos que a morte celular induzida Rab1A knockdown por inibição da formação de autophagosome. Rab1A pode, portanto, contribuir para a superação insultos proteotoxic, que permite que as células cancerosas para sobreviver sob condições de estresse. Análise de interagentes hsc70 forneceram uma visão sobre alteração do estatuto intracelular. Esperamos que um estudo mais aprofundado do interactome Hsc70 para fornecer uma compreensão mais abrangente da fisiologia da célula cancerosa

Citation:. Tanaka M, Mun S, Harada A, Ohkawa Y, Inagaki A, Sano S, et al. (2014) Hsc70 Contribui para Cancer Cell Survival, impedindo Rab1A degradação sob condições de estresse. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10.1371 /journal.pone.0096785

editor: Ram Nagaraj, Case Western Reserve University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de outubro de 2013; Aceito: 11 de abril de 2014; Publicado em: 06 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tanaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada, no todo ou em parte, por JSPS KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) Números Grant 24.650.637 (Masayuki Shiota) e 23.650.617 (Hiroshi Iwao) e Grant-in- ajuda para jsps Fellows (24-2543 para Masako Tanaka). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína de choque térmico 70 família (Hsp70s) é um grupo bem conhecido de chaperones moleculares que suportam a síntese de proteínas

in vivo

, ajudar na dobragem de polipeptídeos nascentes, e evitar a formação de agregados, parando interacções não específicas [1], [2]. Na presença de proteínas desnaturadas e mal dobradas, Hsp70s também facilitar a sua re-enrolamento ou, no caso de proteínas deficientes irremediavelmente, a sua eliminação pela maquinaria de degradação de proteínas da célula [3] – [5]. Hsp70s são expressas a um nível elevado em células de cancro e desempenham um papel na manutenção da homeostase da proteína, o que promove o crescimento de células de cancro e sobrevivência [6], [7]. Hsp70s também são conhecidos por estar envolvidos no desenvolvimento do tumor, incluindo metástase, invasão e resistência às drogas [8] – [11]; Como tal, os vários inibidores de segmentação Hsp70s têm sido desenvolvidos como agentes anti-cancro [12] – [15]

Hsc70 é uma chaperona molecular constitutivamente expresso que pertence à família Hsp70.. Ele tem algumas semelhanças estruturais e funcionais a Hsp72. No entanto, Hsc70, o que não é induzida por choque térmico ou outros estresses, mantém a homeostase da proteína sob condições normais e de estresse, enquanto o stress-inducible Hsp72 é importante para permitir que as células a lidar com o estresse agudo. Hsc70 é referida como estando envolvida em uma multiplicidade de funções de manutenção chaperoning, incluindo a dobragem dos poliptidos nascentes, translocação de proteína através da membrana, autofagia mediada por chaperona, a prevenção da agregação de proteínas sob condições de stress, e a desmontagem de vesículas revestidas por clatrina [16 ]. Assim, camundongos knockout hsc70 não pode ser criado devido ao papel essencial desta proteína na célula de sobrevivência [17].

As células cancerosas experimentar múltiplas tensões microambiente, como hipoxia, privação de nutrientes e exposição a agentes quimioterapêuticos [18 ] – [21]. Além disso, as células malignas sofrem de tensões internas, tais como a acumulação de proteínas mutadas e incorrectamente dobradas e a actividade de vias de sinalização inadequado desregulada, que também ameaçam a sua sobrevivência [22]. Portanto, as células cancerosas precisam superar o estresse proteotoxic que surge pela acumulação intracelular de proteínas deformadas. Semelhante a Hsp72, a expressão de Hsc70 é maior em algumas linhas celulares de cancro do que em normais [23]. Embora Hsc70 é overexpressed em células cancerosas, pouco se sabe sobre como Hsc70 contribui para a sobrevivência de células cancerosas em comparação com Hsp72. Sob condições normais de crescimento, Hsc70 citoplasmático pode mover-se dentro e para fora do núcleo. No entanto, ela é concentrada no núcleo quando as células são expostas a stress, tais como choque térmico. Este Hsc70 nuclear, em seguida, muda-se para o citoplasma durante a recuperação [24], [25]. O calor também foi mostrado para induzir rápida Hsc70 ligação a estruturas citoplasmáticos insolúveis que são distintas do citoesqueleto e a membrana celular interna [26]. Hsc70, por conseguinte, actua rapidamente em resposta ao stress, mas é expresso constitutivamente. Há também uma alteração nas proteínas com as quais interage Hsc70 após a exposição ao stress. Sob condições proteotoxic, a função de Hsc70 em ajudar dobragem cotranslational é interrompida e esta molécula facilita em vez da reparação de proteínas deformadas [27]. Portanto, proteínas clientes hsc70 são importantes para a homeostase celular e são moléculas essenciais em respostas ao estresse. Desde Hsc70 é necessário para a dobra de proteínas clientes, suas proteínas clientes sob condições de estresse são moléculas potencialmente importantes para a sobrevivência de células cancerosas.

Neste estudo, foi realizada em massa de espectrometria de base a análise proteômica utilizando purificação por afinidade com anticorpos anti-hsc70 para hsc70 interactoma perfilamento da linha celular de cancro do cólon humano HT29. Ao comparar os perfis de proteínas clientes hsc70 entre condições normais e de estresse, identificamos moléculas que são potencialmente crítico para a sobrevivência da célula cancerosa.

Materiais e Métodos

Os anticorpos e produtos químicos primários

Anticorpos contra Rab1A, ubiquitina, Hsp72, e p62 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra todas as formas de poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) e formas clivadas da caspase-3 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra o anticorpo β-actina e LC3B foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). O anticorpo anti-Rab1B foi comprado de Abgen (San Diego, CA). anticorpos secundários conjugados com HRP foram adquiridos da GE Healthcare Bio-Science (Little Chalfont, Bucks, UK). Dois anticorpos anti-Hsc70 diferentes utilizados na purificação por afinidade foram produzidos no nosso laboratório [25] e o anticorpo anti-Hsc70 utilizado nas outras experiências foi comprado de Enzo (Farmingdale, NY). MG132 foi adquirido a partir de Sigma (St. Louis, MO). 5-fluorouracilo (5-FU), e brefeldina A (BFA) foram obtidos a partir de Wako (Osaka, Japão), diluídos em sulfóxido de dimetilo (DMSO), e armazenadas a -20 ° C.

Cultura de Células e Os tratamentos experimentais

A linha celular de adenocarcinoma do cólon humano HT29 foi adquirido a partir do DS Pharma biomédica (Osaka, Japão) e mantido em meio de McCoy 5A (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml penicilina, e 100 U /mL de estreptomicina, numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram passadas a cada sete dias quando se aproxima de confluência. As células foram tratadas com 3,2 uM (IC

50 às 48 h) 5-FU ou sem FBS (depleção de soro) durante seis horas. Para proteómica à base de massa, espectrometria, utilizou-se 10 uM de 5-FU. Todos os tratamentos foram realizados a uma concentração final de 0,1% de DMSO.

Immunoblotting e imunoprecipitação

As células foram lisadas em tampão RIPA, e as proteínas foram isoladas a partir de lisados ​​celulares por imunoprecipitação como descrito anteriormente [28] . Para imunotransferência, as proteínas foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida sob condições redutoras, seguido de transferência electroforética para membranas de PVDF conforme descrito anteriormente [29]. As membranas foram detectados com LAS 4000-sistema analisador Lumino-image (GE Healthcare Bio-Science) utilizando a técnica de quimioluminescência aumentada (Substrato Immobilon Ocidental HRP; Millipore).

Isolamento e Análise Proteômica de Proteínas Hsc70 cliente

para a análise de espectrometria de massa, as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 1% à temperatura ambiente durante 20 min, seguido de paragem com glicina 125 mM. As células fixadas foram lisadas em tampão RIPA que consiste em 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, glicerol a 10%, NaF 100 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, DTT 0,2 mM, e cocktail de inibidor de protease. Os lisados ​​celulares (1 mg de proteína) foram previamente limpas com grânulos inactivadas NHS-Sepharose (GE Healthcare Bio-Science) durante uma hora à temperatura ambiente e imunoprecipitados com dois tipos de anticorpo em casa específicos para Hsc70 imobilizada em NHS-Sepharose activada no quarto temperatura durante duas horas. Os imunoprecipitados foram então lavadas três vezes com tampão RIPA e sujeitas a dessalinização e concentração por SDS-PAGE num gel de gradiente de poliacrilamida 5-20% (Wako), seguido por coloração com CBB-rápida (Wako). O gel foi cortado em fatias com uma espessura de ~ 1 mm por pista. Os pedaços de gel foram descoradas em NH mM 25

4HCO

3 e 50% de acetonitrilo, seguido de descoloração adicional em NH 25 mM

4HCO

3, 30% de acetonitrilo, e a redução em NH 25 mM

4HCO

3 contendo DTT 10 mM a 56 ° C durante uma hora. Os resíduos de cisteína foram reduzidas subsequentemente alquilado em 55 mM de iodoacetamida em 25 mM NH

4HCO

3 e os pedaços de gel foram, em seguida, lavado em acetonitrilo e secou-se. Os pedaços de gel seco foram tratadas com 10 ug /ml de tripsina (tripsina ouro; Promega, Madison, WI) em NH 50 mM

4HCO

3 em gelo durante 30 min, o excesso foi removido, e a digestão completa foi deixada a ocorrer a 37 ° C durante 18 h em 50 mM NH

4HCO

3. As amostras foram dessalinizadas utilizando Zip Tip C18 (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. O ácido trifluoroacético foi então adicionado a uma concentração final de 0,1% e utilizado para análise de nano-líquido cromatografia em tandem com ionização por electrospray, espectrometria de massa (LC-ESI-MS /MS).

nanoelectrospray LC-MS /MS e Análise Identificação de proteínas

LC-MS /MS análises foram realizadas num sistema nano LC dina-AI (KYA Tecnologia, Tóquio, Japão), acoplado a um espectrômetro de massa híbrido Qstar Elite (AB Sciex, Concord, Ontário, Canadá) por meio de uma fonte de iões de nanospray (AB Sciex). Os detalhes desta análise são descritos noutro local [30]. A aquisição de dados foi realizada utilizando QS analista de software 2.0 (AB Sciex) no modo de ião positivo. Ambos os conjuntos de dados foram processados ​​por ProteinPilot usando o algoritmo de busca Paragon ™ (AB Sciex). dados MS /MS foram utilizados como uma consulta de pesquisa no banco de dados NCBI (RefSeq liberar 55, setembro de 2012, ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) usando um

Homo sapiens

Filtro de taxonomia. O limite mínimo para a identificação de proteínas foi fixada em uma pontuação de proteína de 0,47, o que corresponde a um nível de confiança maior que 66% e uma taxa de detecção falsa de 1%.

iTRAQ Etiquetagem e quantificação da expressão da proteína

As proteínas de controlo ou células silenciou-Rab1A foram extraídos como descrito para immunoblotting. Os lisados ​​celulares foram concentrados e o tampão de dissolução (mM de bicarbonato de trietil-amónio 100, pH 8,0) foi substituído com Microcon filtros centrífugos com uma membrana de limite de ultrafiltração de peso molecular 3 K nominal, seguida de digestão e marcação com reagentes 4-plex iTRAQ em conformidade com procedimentos padrão [31]. As amostras foram marcadas como se segue: 114, o controlo knockdown; e 115, Rab1A knockdown. Cada amostra continha 100 mg de proteína. As concentrações de proteína foram medidos por ensaio de proteína BCA.

RNA Interferência

Todos os siRNAs contra humanos

Hsc70

(

HSPA8

),

Rab1A

e

Ran

, e número de controlo negativo silenciador 1 siRNA (Control) foram obtidos de Invitrogen. Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) foi utilizado para reverter-transfectar siRNAs nas células (concentração final, 30 nm ou 10 nm) de acordo com as instruções do fabricante.

MTS Assays

células transfectadas com siRNA foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 ou 1 x 10

5 células por poço. Após 48 h de transfeco, as culas foram cultivadas com meio esvaziado de soro ou com 5-FU (3.2 uM) durante 24 h. A viabilidade foi determinada por ensaio com Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão). A absorvância foi medida a 450 nm com um leitor de microplacas.

Ensaio de Apoptose

células transfectadas com ARNsi foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células por poço . Após 48 h de transfeco, as culas foram sujeitas a depleção de soro ou tratamento com 5-FU durante 24 h. As células apoptóticas foram identificados através de coloração nuclear com Hoechst 33258 após a fixação com glutaraldeído a 0,5% durante cinco minutos à temperatura ambiente. As lamelas foram montadas com fluorescência Meio de Montagem (Dako, Glostrup, Dinamarca). As células coradas foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência. (Biozero; Keyence, Osaka, Japão), com um objectivo de 20 × seco

RNA Preparação e análise em tempo real polimerase-transcriptase reversa Chain Reaction

total O ARN foi isolado a partir de Hsc70- ou Rab1A-knockdown, ou células de controlo utilizando o reagente knockdown ISOGEN (Nippon Gene, Tóquio, Japão). A transcrição reversa foi então realizada utilizando 1 ug de ARN e um Master Mix ReverTra Ás qPCR RT com ADNg removedor (TOYOBO, Osaka, Japão). a análise por PCR em tempo real foi realizado utilizando um rápido em tempo real do sistema de PCR 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) com o kit LightCycler FastStart DNA-Mestre SYBR Green I (Roche, Penzberg, Alemanha). O nível de RNA foi normalizada utilizando

GAPDH

. Todos os dados foram analisados ​​por comparativo C

T usando Software 7500 ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

celular IncuCyte Crescimento Medição Ensaio

Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, um total de 5 × 10

4 HT29 células foram semeadas em placas de 24 poços. células não transfectadas foram tratadas com 5 ug /ml de BFA ou DMSO no início da medição. A placa foi incubada em um sistema de imagem cinética IncuCyte (Essen BioScience, Ann Arbor, MI) dentro de uma incubadora de cultura de células. As imagens foram capturadas em quatro campos por bem a cada três horas para monitorar a proliferação.

Análise Estatística

Todos os dados são apresentados como média ± S.D. As comparações entre grupos foram feitas por análise unidireccional da variância. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

p

. 0,05

Resultados

Hsc70 é fundamental para Cancer Cell Survival

Para investigar a contribuição de Hsc70 para a sobrevivência de células HT29, foi realizado o ensaio de MTS no células knockdown hsc70 (Fig. 1a). Em comparação com o controlo, Hsc70 knockdown diminuiu a viabilidade celular, que foi independente da intensidade de tensão. Embora as células HT29 eram particularmente resistentes ao soro fome, Hsc70 knockdown aumentou a sensibilidade ao soro fome e provocou a morte de células (Fig. 1B e a Fig. S1). Apesar da indução subsequente de Hsp72 como uma resposta ao estresse adaptativa (Fig. 1C), Hsp72 não impediu a morte celular induzida por Hsc70 knockdown. Portanto, Hsc70 é fundamental para a sobrevivência da célula e Hsp72 não poderia completamente compensar sua perda.

(A) Knockdown de Hsc70 diminuição da viabilidade da célula cancerosa. células HT29 foram transfectadas com siRNA para

Hsc70

ou controle de corrida. Às 48 horas após a transfecção de siRNA, as células foram sujeitas a inanição ou soro foram tratadas com 5-FU na concentração indicada durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. Os pontos de dados representam a média ± S.D. (N = 5). (B) Efeito do Hsc70 knockdown na morfologia celular. Hsc70 ou células de controlo knockdown foram tratados da mesma forma em

A

. imagens de contraste de fase de células sob condições alimentados com soro ou livres de soro 24 h após os tratamentos. barra de escala, de 200 mm. (C) Hsc70 knockdown induzida expressão compensatório da Hsp72. Às 48 horas após a transfecção de ARNip, controlo ou células knockdown Hsc70 foram sujeitas a depleção de soro durante 6, 12 ou 24 h. Após a lise celular, Hsc70 e Hsp72 foi detectada por imunotransferência. SD, a depleção de soro.

Análises de hsc70 interactianos identificados no soro-esgotado e tratado com 5-FU Células HT29

Como uma variedade de tensões induzir a acumulação intracelular de misfolded e desnaturado proteínas, Hsc70 liga-se a e redobra estas proteínas danificadas. Esta função de Hsc70 permite que as células para sobreviver sob tensões proteotoxic. Assim, buscou-se analisar interagentes hsc70 sob condições de estresse, a fim de identificar moléculas fundamentais para a sobrevivência da célula cancerosa. Um fluxograma da identificação de interactores Hsc70 é mostrado na Fig. 2A. células HT29 foram expostas a depleção de soro ou 5-FU, e também tratados com DMSO como um controlo de veículo, durante 6 h. Profiling de interactores Hsc70 em células cancerosas foi levada a cabo pelo isolamento de afinidade utilizando esferas de Hsc70, seguida por identificação com base em espectrometria de massa. Um total de 124 proteínas específicas foram identificadas em 95% de confiança (Fig. 2B e Tabela S1). Destes, 41 proteínas específicas para o controlo de veículo foram envolvidos nos processos homeostáticos normais. Gene Ontology (GO) análise revelou que essas proteínas estavam envolvidos na produção mitocondrial de energia, o citoesqueleto, ea síntese de proteínas. Entre as proteínas restantes, 30 proteínas específicas para a depleção do soro, particularmente envolvidos no transporte de proteínas, síntese de proteínas, e o ciclo de célula, ao passo que 29 proteínas únicas para o tratamento com 5-FU foram comumente associada com o metabolismo da glucose. Estes resultados indicam que houve uma mudança nas proteínas com as quais interagiram Hsc70 em resposta a diferentes tipos de stress. Portanto, a interactoma Hsc70 reflecte as alterações dependentes do estímulo na resposta ao stress e pode ser utilizado para monitorizar as alterações fisiológicas das células. A análise também identificado um número limitado de proteínas que eram comuns em ambas as condições de stress, que foram envolvidos na mitocôndria, o citosqueleto, e o transporte de proteínas. Destes, são focados em Rab1A na superfamília Ras, que é expresso a um nível elevado em células de cancro. Esta molécula regula processos celulares importantes, tais como a transdução de sinal, proliferação celular, e transporte vesicular (Fig. 2B e na Tabela S2).

(A), uma vista esquemática da identificação de interactores hsc70. As células foram expostas a depleção de soro (SD), 5-FU, ou DMSO durante 6 h. Hsc70 interactores foram isoladas com anticorpos anti-Hsc70 a partir do extracto celular, e foram identificados através de análise subsequente por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS). (B) Identificação e classificação funcional de interagentes hsc70 que foram associados com mudanças na resposta ao estresse. Um diagrama de Venn que descreve interagentes hsc70 que foram identificadas 95% pontuação de confiança (1,3 ProtScore) usando software ProteinPilot 2.0. gráficos de colunas indicam o número e funcionalidade das proteínas identificadas.

Rab1A Knockdown danos causados ​​pelo estresse exacerbado pelo Serum Exaustão e Tratamento 5-FU

Para estender nossos proteômica achados, próxima avaliou a contribuição de Rab1A para a sobrevivência de células de cancro. Comparado com transfecção controle, Hsc70 knockdown reduzida dimensão das colónias, sem qualquer alteração da morfologia celular (Fig. 3A). No entanto, Rab1A knockdown causada atenuação de adesão célula-célula e diminuiu marcadamente o número de células, que foi realçado por depleção de soro. Para quantificar os efeitos de Rab1A knockdown, foi realizado o ensaio MTS (Fig. 3B). As células foram semeadas a 1 x 10

5 por poço em placas de 96 poços a fim de eliminar a influência da proliferação celular. Ambos depleção de soro e tratamento com 5-FU teve pouco efeito sobre a viabilidade das células de controlo, indicando que estes tratamentos só constituído stress moderado para as células. Em comparação com células de controlo, Hsc70 knockdown diminuiu significativamente a viabilidade celular (

p Art 0,01), apesar da exposição ao estresse leve. Isso mostra que Hsc70 knockdown morte celular induzida sob condições de estresse, como também indicado nas Fig. 1A e B. No entanto, Rab1A knockdown diminuiu significativamente a viabilidade das células (

P

0,05), sem exposição ao estresse, indicando ainda que Rab1A knockdown morte celular induzida por si só em condições normais. Além disso, apesar da natureza suave dessas tensões, depleção de soro e tratamento com 5-FU diminuiu ainda mais a viabilidade das células Rab1A knockdown. Estes resultados indicam que Rab1A contribui para a sobrevivência celular e é muito importante sob condições de estresse que estão além da capacidade de Hsc70 para garantir a sobrevivência da célula.

HT29 células transfectadas com

Hsc70

,

Rab1A

, ou

controlo

siRNA foram sujeitas a depleção de soro, 5-FU, ou do tratamento com veículo, durante 24 h. (A) Efeitos da supressão de Hsc70 e seus interagentes na morfologia celular. imagens de contraste de fase representativos das células. barra de escala, 100 mm. (B) Rab1A knockdown diminuiu a viabilidade celular. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. Os asteriscos indicam significância estatística. **,

p Art 0,01, *,

p Art 0,05 vs. veículo;

†,

p Art 0,05 vs. controlo knockdown por two-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey-Kramer post hoc; Os valores são as médias ± S.D. (

n

= 7). Veh, veículo. SD, depleção de soro. FU, 5-fluorouracil.

Hsc70 Rab1A Impedido Degradação

Para investigar os efeitos da Hsc70 sobre Rab1A sob condições de estresse, temos focado na interação dessas duas moléculas. Verificou-se a interacção física de Hsc70 endógena e Rab1A por ensaios de co-imunoprecipitação com anticorpos comerciais (Fig. 4a). Isto confirmou os resultados da análise de espectrometria de massa que interagiram com Hsc70 Rab1A sob condições de depleção de soro. Nós também confirmado que interagiram com Hsc70 Rab1A em uma maneira dependente da chaperona porque Hsc70 e Rab1A foram dissociadas do outro por ATP. Nós também descobrimos que Hsc70 formado homodímeros, mas Rab1A não o fez. eluição secundário em tampão de amostra de SDS para as proteínas restantes ligadas a pérolas de agarose foi realizado para detectar as proteínas de isco pois o ATP não interfere com a interacção antigénio-anticorpo. Em seguida, avaliamos nível Rab1A quando Hsc70 foi suprimida; ele mostrou uma diminuição em condições de estresse, apesar de um aumento compensatório de Hsp72 nível (Fig. 4B). No entanto, Hsc70 knockdown teve nenhum efeito sobre o nível Rab1A sob as condições de controlo. Esta regulação negativa de Rab1A sob condições de tensão foi observada ao nível da proteína, mas não ao nível do mRNA (Fig. 4C). Hsc70 foi, portanto, mostrado não para regular a síntese Rab1A, pelo menos. A seguir descobriu que a supressão Hsc70 aumentou o nível de Rab1A ubiquitinadas sob condições de depleção de soro (FIG. 4D). Além disso, a degradação Rab1A que foi induzida por Hsc70 knockdown sob condições de stress foi inibida pelo inibidor de proteassoma MG132 (Fig. 4E). Colectivamente, estes resultados sugerem que Hsc70 previne a degradação da Rab1A que foi misfolded sob condições de stress.

(A) Hsc70-Rab1A interacção através da actividade acompanhante. células HT29 foram sujeitas a depleção de soro durante 24 h, e depois lisadas. Para verificar a interacção entre e Hsc70 Rab1A em uma maneira dependente da chaperona, imunoprecipitado anti-anti-Rab1A Hsc70 ou foi eluída com ATP, seguida por eluição com tampão de amostra de SDS e imunotransf erência, a fim de confirmar as proteínas de isco. (B) Hsc70 knockdown diminuiu o nível de proteína Rab1A sob condições de stress. células HT29 transfectadas com

Hsc70

ou

controlo

siRNA foram sujeitas a depleção de soro, 5-FU, ou do tratamento com veículo, durante 24 h. Immunoblotting para Rab1A endógeno e proteínas hsc70. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) Hsc70 knockdown não diminuiu

Rab1A

nível de mRNA. Depois de knockdown de Hsc70 e no controle,

Rab1A

níveis de mRNA foram determinadas por qPCR às 48 h pós-transfecção. (D) Hsc70 knockdown promoveu a ubiquitinação de Rab1A. Após as células de controlo ou knockdown Hsc70 foram lisadas, foi realizada imunoprecipi tacão (IP) com anti-Rab1A ou anticorpos anti-ubiquitina, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ubiquitina ou anti-Rab1A. (E) MG132 tratamento inibiu a degradação Rab1A. células knockdown Hsc70 foram sujeitas a depleção de soro ou tratamento com 5-FU, e, em seguida, MG132 (10 uM) ou veículo foi adicionado no último 8 h antes da recolha de amostras. SD, depleção de soro. FU, 5-fluorouracilo. Ub, ubiquitina, IgG LC, cadeia leve de imunoglobulina. Dados (exceto em C) são representativos de pelo menos duas experiências separadas produzindo resultados semelhantes.

Rab1A induzida Knockdown-morte celular não é de apoptose

Para investigar se a ausência de Rab1A induz a apoptose, examinamos a presença de células em apoptose por coloração nuclear com Hoechst 33258. Ran, um membro da superfamília Ras, interagiu com Hsc70 em todas as condições de acordo com a nossa análise proteômica (Tabela S2). Ran knockdown foi realizada como controlo positivo para a apoptose. Ran células knockdown exibiram fragmentação nuclear apoptótica independentemente de depleção de soro, enquanto que as células de knockdown Rab1A exibiu apenas à apoptose quando expostos a depleção de soro (Fig. 5A). Após a contagem das células a Hoechst-coradas e aqueles com fragmentação nuclear, Rab1A knockdown foi encontrada para reduzir o número de células na mesma medida como Ran knockdown (Fig. 5B). No entanto, a apoptose foi induzida por Ran marcadamente knockdown mas não por Rab1A knockdown (Fig. 5C). Uma vez que também não detectar típico de PARP-1 e a caspase-3 assinaturas apoptóticas mediante knockdown Rab1A (Fig. 5D), a morte celular exacerbada por knockdown Rab1A mostrou não ser responsável pela apoptose. Assim, estes resultados sugerem que Rab1A knockdown induzida por morte celular não é de apoptose.

HT29 células transfectadas com

Hsc70

,

Rab1A

,

Ran

, ou

controlo

siRNA foram sujeitas a depleção de soro, 5-FU, ou do tratamento com veículo, durante 24 h. (A) Rab1A knockdown teve pouco efeito sobre a indução de apoptose. A indução de apoptose foi analisada por coloração com Hoechst 33258. setas brancas indicam núcleos apoptóticos com cromatina condensada. Barra de escala, 50 mm. (B, C) A diminuição do número de células por Rab1A knockdown não foi devido a apoptose. Os números de células totais e de células apoptóticas foram quantificados por contagem das células e células Hoechst-coradas com condensação nuclear em (A), respectivamente. *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01 vs. controlo /veh;

†,

p Art 0,05,

††,

p Art 0,01 vs. controlo /SD;

##,

p Art 0,01 vs. Rab1A /SD por two-way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni /Dunn post hoc; Os valores são as médias ± S.D. (

n

= 3). supressão (D) Rab1A não induziu apoptose. A apoptose foi determinada por as clivagens de PARP-1 e a caspase-3, detectada por imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Veh, veículo. SD, depleção de soro. FU, 5-fluorouracilo. dados immunoblotting são representativos de pelo menos três experiências separadas produzindo resultados semelhantes.

Quantitative Proteomics diferencial em Rab1A Knockdown Cells

Para examinar porque a ausência de Rab1A morte celular induzida por não incluindo apoptose, realizamos quantitativa análise proteômica diferenciais de células Rab1A knockdown baseados na técnica iTRAQ. As proteínas marcadas com iTRAQ que tinha sido extraído de células Rab1A knockdown foram analisadas e comparadas com o proteoma de células de controlo. Como resultado, foram considerados 25 proteínas com uma alteração da expressão de ≥1.2 vezes ser regulada para cima, ao passo que 27 proteínas com uma mudança 0,8 vezes foram regulados negativamente (Tabela S3). Para avaliar as diferenças funcionais entre estes dois subconjuntos de proteínas, foi realizada a análise GO (Fig. 6A e B). As proteínas regulados positivamente foram classificados nas categorias de transporte de proteínas, mitocôndrias e proteassoma, enquanto que a classificação nos termos ribossomo e transcrição /tradução foi particularmente comum entre as proteínas reprimidos. Estes resultados sugeriram que Rab1A knockdown aumentou os níveis de outras proteínas envolvidas no retículo endoplasmático (ER) tráfico -Golgi, mas não levou a uma compensação da função Rab1A. A disfunção de Rab1A facilitada a degradação da proteína e pararam a síntese de proteínas, indicando que Rab1A knockdown em células induzidas a acumulação de proteínas mal enroladas. Assim, as células Rab1A knockdown pode ser exposto a proteotoxic stress, o que induz a morte celular subsequentemente.

HT29 células foram transfectadas com ARNsi de

Rab1A

controlo ou precipitação. identificação de proteínas em células Rab1A knockdown foi realizada através de proteômica quantitativos de rotulagem isótopo estável, usando iTRAQ. (A) proteínas regulado positivamente com iTRAQ relação ≥1.2. (B) subregulado proteínas com iTRAQ proporção. 0,8

A morte celular knockdown-induzida por Rab1A foi causada pela inibição da autofagia mas não ER-Golgi Tráfego

Desde Rab1A está envolvido no tráfego ER-Golgi, o próximo examinou se a interrupção desse tráfego induz a morte celular. Embora o tratamento com BFA, um inibidor de trânsito ER-Golgi, induzida morte celular, a morfologia das células a morrer foi muito diferente do que em cima Rab1A knockdown (Fig. 7A e B). Porque o BFA também é conhecido como um indutor de stress ER, tratamento com BFA está previsto para causar a acumulação intracelular de proteínas desnaturadas e mal dobradas. Portanto, o próximo investigada a indução de autofagia. Como esperado, tratamento com BFA induzida LC3B-II, enquanto Rab1A knockdown não o fez. Rab1A knockdown, além disso, conduziu à acumulação de p62, que pode ligar-se LC3, servindo assim como um substrato selectivo de autofagia (Fig. 7C). Quando Rab1A foi suprimida, o nível de ARNm de Rab1B aumentou duas vezes, enquanto o seu nível de proteína tendem a aumentar ligeiramente (Fig. S2A e B). Rab1A, por conseguinte, pode ter uma função desconhecida única que carece Rab1B ou os níveis totais de Rab1A e Rab1B pode diminuir abaixo do limiar necessário para a sobrevivência das células quando Rab1A foi suprimida. Além disso, uma vez induzida Hsc70 knockdown LC3B-II que permitiu LC3B para se tornar associado com vesículas autofágicos, que não afectou a formação de autofagossomas, em contraste com Rab1A knockdown (Fig. 7D). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. 2B.