Abstract

células do tumor progenitoras representam uma população de células resistentes aos medicamentos que podem sobreviver quimioterapia convencional e levar a reincidência do tumor. No entanto, pouco se sabe sobre o papel dos progenitores do tumor em metástases de cancro da próstata. Os estudos aqui relatados mostram que o eixo CXCR4 /CXCL12, um regulador chave da disseminação tumoral, desempenha um papel na manutenção de células estaminais de cancro da próstata semelhante. A via CXCL4 /CXCR12 está ativado na CD44 população progenitora

+ /CD133

+ próstata e afeta potencial de diferenciação, adesão celular, o crescimento clonal e tumorigenicidade. Além disso, estudos de xenoenxerto de tumor da próstata em ratos mostraram que a combinação do AMD3100 CXCR4 antagonista do receptor, o que tem como alvo de cancro da próstata células estaminais semelhante, e o fármaco quimioterapêutico convencional Taxotere, que tem como alvo o tumor grandes quantidades, é significativamente mais eficaz na erradicação de tumores, em comparação a monoterapia

Citation:. Dubrovska a, Elliott J, Salamone RJ, Telegeev GD, Stakhovsky AE, Schepotin IB, et al. (2012) Expressão CXCR4 em células de cancro da próstata progenitoras. PLoS ONE 7 (2): e31226. doi: 10.1371 /journal.pone.0031226

editor: Diane Renee Bielenberg, Hospital Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de agosto de 2011; Aceito: 04 de janeiro de 2012; Publicação: 16 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Dubrovska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Susan G. Komen for the Cure Grant PDF0707903 (a AD). Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa Novartis e do Instituto Skaggs para a biologia química. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancros da próstata são a segunda causa mais comum de morte por câncer em homens. A maioria dos cânceres de próstata são dependentes da hormona e responder à terapia de ablação do andrógeno. No entanto, a terapia de ablação não é curativa para o cancro da próstata metastático, porque estes tumores tornam-se, eventualmente, hormona refractário e crescer apesar ablação de androgénios, embora o tratamento inicial bem sucedido apareceu [1], [2]. regimes de quimioterapia que incluem a droga docetaxel (Taxotere) estender sobrevida média de dois a três meses em pacientes com câncer de próstata avançado que não é mais responsiva à terapia hormonal. No entanto, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos de 17% dos pacientes e um período de sobrevida média de 2-3 anos, o prognóstico para pacientes com câncer de próstata metastático continua pobre [3].

Tem sido argumentado que a progenitora tumor células desempenham um papel crucial no desenvolvimento do tumor e representam uma população de células resistentes a drogas que podem sobreviver e tratamento da doença causa recaída convencional [4]. Esta noção sugere que terapias que atingem progenitores tumor pode levar a tratamentos de câncer mais eficazes [5], [6]. populações de células que expressam os marcadores de superfície CD44 e CD133 foram identificados como populações de células estaminais putativas na glândula da próstata [5], [7], [8], [9]. Nós e outros demonstraram que CD133

+ /CD44

+ células de linhas de células de câncer de próstata estabelecida também são auto-renovação e multipotentes, e tem forte potencial tumorigénico

in vivo

[5], [ ,,,0],7], [10], [11], [12]. Enquanto as linhas de células de cancro da próstata em cultura sob condições de cultura em monocamada de longo prazo contêm menos de 2% progenitores de cancro da próstata, esta CD133

+ /CD44

+ população progenitora cancro pode ser expandido sob condições de fixação livre de soro independentes (esfera formando condições) [5], [11]. Esta população progenitora enriquecido mantém aumento da capacidade de auto-renovação e tumorigenicidade [5]. Análise da expressão de mRNA revelaram que o receptor de quimioquinas CXCR4 é altamente regulada positivamente nestas células em comparação com células cultivadas em condições de crescimento em monocamada [5]. Sabe-se que a activação da via de CXCR4 /CXCL12 altera a adesão, migração e invasão de células de cancro, incluindo o cancro da próstata [13], [14], [15]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel desta via na manutenção do tumor da próstata de iniciar as populações de células. Aqui relatamos estudos que sugerem que o eixo /CXCL12 CXCR4 é ativado em progenitores câncer de próstata e desempenha um papel na auto-renovação, potencial de diferenciação, adesão celular, e tumorigenicidade. Além disso, estudos do rato de xenotransplante sugerem que a inibição da via CXCR4 pode ser benéfico na segmentação de progenitores de câncer de próstata

in vivo

.

Resultados

O CXCL4 /CXCR12pathway é ativado no CD44

+ /CD133

+ população de células progenitoras da próstata

várias populações de células estaminais putativas foram identificadas na próstata e são caracterizadas pela presença de células CD44 marcadores de superfície celular, CD133, integrina e α2β1

alta [5], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. cancro da próstata células que expressam CD44 e CD133 marcadores da superfície celular pode ser enriquecida a partir de linhas celulares de cancro da próstata crescente por eles como esferas em condições de mídia progenitoras [5]. Nós e outros confirmaram que este CD133

+ /CD44

+ população de células torna-se um subconjunto de células de câncer de próstata que são auto-renovação, diferenciar-se em tumores heterogêneos, e são altamente tumorigénica em ratinhos imunodeficientes [5], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12]. Para identificar vias de sinalização ativadas seletivamente neste CD133

+ /CD44

+ população, foi realizada análise de microarray de expressão gênica em DU145 e células PC3 usando matrizes Affymetrix U133 [5]. A expressão de genes de perfis mostraram que o receptor de quimioquinas CXCR4 é altamente regulada positivamente em ambas as linhas de células cultivadas sob esfera formando em comparação com condições de crescimento em monocamada (um aumento de 13 vezes e aumento de 104,6 vezes para células PC3 e DU145, respectivamente) [5]. O elevado nível de expressão de CXCR4 observado em experiências microarray foi confirmada por RT-PCR quantitativa e análise de Western blot (Figura 1A).

(A) células crescidas sob condições de formação esfera mostrou um aumento do nível de expressão de CXCR4 como analisado por RT-PCR e análise de Western blot. Para a formação de esfera, células isoladas foram colocadas em placas a 500 células /ml em placas de 10 cm com uma superfície de fixação ultrabaixa e cultivadas em meio basal epitelial isento de soro durante 7 dias. (B) análise de citometria de fluxo mostrou enriquecimento significativo do CXCR4

+ população dentro CD44

+ /CD133

+ células em comparação com a população de células total para DU145 e PC3 células (p 0,001). As células foram triplo coradas e analisadas com um fluxo BD LSR II citômetro. (C) imagens fluorescentes representativos de CD133 e CD44 co-imunocoloração mostrando que as células

+ DU145 e PC3 CXCR4 têm uma proporção maior de CD44

+ /CD133

+ células em comparação com CXCR4

– células. As células que expressam alta de baixos níveis de CXCR4 foram FACS purificado, plaqueadas em placas de 384 poços pretas de fundo transparente a uma densidade de 100 células /poço em meio basal epitelial isento de soro. Após 18 horas, as células foram fixadas com formaldeído a 3,7% em PBS e coradas com anticorpo anti-CD133 e anti-CD44 anticorpos. As células em pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente de vista foram contados para cada condição. As setas mostram as células positivas triplos. As barras de escala indicam 15 um. * – Valor de p 0,05. (D) A imunocoloração de secções embebidas em parafina de tumores de xenoenxerto formadas por CD44 FACS purificado

+ /CD133

+ e CD44

– /CD133

– células mostrou que mais de 13% CXCR4

+ células em tumores derivados de CD44

+ /CD133

+ células em comparação com 2,2% CXCR4

+ células em tumores de xenoenxerto derivados de CD44

– /CD133

– células. Um total de 10

3 FACS-ordenadas DU145 CD133

+ /CD44

+ ou CD133

– s.c. células incorporados em BD Matrigel foram injectadas – /CD44

em ratinhos NOD /SCID. Os tumores foram deixados crescer durante 42 dias, até que os tumores produzidos por DU145 CD133

+ /CD44

+ atingiram um tamanho de 400 mm

3 e os tumores produzidos por DU145 CD133

– /CD44

– chegaram a um tamanho de 125 mm

3. As células em pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente de vista foram contados para cada condição. As barras de escala indicam a 30 um. (E) CXCR4 imunocoloração em secções embebidas em parafina de tumores de xenoenxerto produzido pelas células cultivadas sob esfera formando e condições de monocamada mostraram mais do que 6% CXCR4

+ células em tumores derivados de esfera em comparação com 1,4% de CXCR4

+ células em tumores de xenoenxerto derivado de monocamada. ** – P valor . 0.01.Scale barras indicam 30 mm

Um crescente corpo de evidências têm demonstrado que CXCR4 desempenha um papel importante na proliferação do câncer, disseminação, invasão e resistência aos medicamentos [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel da via de sinalização CXCR4 /CXCL12 na manutenção de células progenitoras de cancro da próstata. Para verificar se a expressão CXCR4 é regulada no tumor de próstata células iniciar, examinamos os níveis de CXCR4 em CD44

+ /CD133

+ células progenitoras câncer de próstata e populações de células totais no DU145 e linhas celulares PC3 por citometria de fluxo. Observamos um enriquecimento 10.3- e 2,3 vezes na percentagem de CXCR4

+ células na CD44

+ /CD133

+ população em comparação com a percentagem de CXCR4

+ células na população total de células DU145 e PC3, respectivamente (Figura 1B). Consistente com esta observação, FACS-purificado DU145 CXCR4

+ e PC3 CXCR4

populações + têm uma proporção consideravelmente mais elevada de CD133

+ /CD44

+ células, em comparação com CXCR4

– células ( um aumento de 5,8 vezes e 2,8 vezes para DU145 e PC3 células, respectivamente) (Figura 1C). Este aumento do nível de expressão CXCR4 na CD133

+ /CD44

+ população de células sugere um papel importante para CXCR4 sinalização na manutenção dos progenitores câncer de próstata.

Para determinar se existe a mesma correlação

in vivo

analisamos a expressão de CXCR4 em tumores de murganhos injectados com CD133

+ /CD44

+ células enriquecidas, bem como células cultivadas sob condições de formação esfera. Ambas as populações de células da próstata foram previamente demonstrado ter aumentado tumorigenicidade [5], [12]. A análise histológica de tumores xenoenxerto DU145 derivados de FACS-purificado CD44

+ /CD133

+ células revelaram uma CXCR4 significativamente maior população

+ celular do que em tumores formados por CD44

– /CD133

– células (Figura 1D). Da mesma forma, a análise de expressão de CXCR4 em tumores de xenoenxertos de ratinhos injectados com células DU145 cultivadas sob condições de esfera ou de monocamada mostrou que as células que expressam CXCR4 fazer-se 6,1% da população total de células em tumores derivados de esfera, ao passo que os tumores derivados de monocamada têm 1,4% de células positivas de CXCR4 (Figura 1E). Assim, uma maior percentagem de células que expressam CXCR4 também está associada com tumores derivados de ambos CD44

+ /CD133

+ ou células cultivadas sob condições de formação de esfera.

Em seguida, analisamos a relação entre expressão CXCR4 e da capacidade de auto-renovação e tumorigenicidade de células progenitoras câncer de próstata. Ambos os FACS classificadas DU145 e PC3 CXCR4

populações + mostrou um aumento na esfera e formadoras de colônia potencial ao longo CXCR4

– células (aumento de 2,3 vezes e aumento de 3,9 vezes, respectivamente) (Figura 2A, B). Da mesma forma, CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ células têm maior potencial spherogenic em comparação com CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– células (Figura 2C). Para avaliar a capacidade de auto-renovação da CXCR4

+ células, esferas secundárias foram gerados a partir de esferas primárias dissociadas derivados de PC3 CXCR4

+ e PC3 CXCR4

– células (Figura S1A). O número de esferas secundárias por 1000 ou 500 células foi maior com esferas derivadas de CXCR4

+ células do que a partir de CXCR4

– células (um aumento de 5,5 vezes e aumento de 3,2 vezes, respectivamente). Para determinar se a activação do eixo de CXCR4 /CXCL12 estimula a proliferação de progenitores de cancro da próstata, PC3 e DU145 células foram tratadas com CXCL12 a 10 e 100 ng /mL durante 5 dias em meio de crescimento isento de soro epitelial. Como se mostra na Figura 2D, a activação da via de sinalização /CXCL12 CXCR4 aumenta significativamente o CD44

+ /CD133

+ população para ambas as linhas de células de cancro PC3 e da próstata DU145 de uma forma dependente da dose (até 3,5 vezes e aumento de 2,6 vezes, respectivamente). Similarmente, a sobreexpressão mediada por adenovirus de CXCR4 nas células DU145 resultou num aumento de mais do que 2,5 vezes o número de CD44

+ /CD133

+ população (Figura 2E e Figura S1B), mas teve pouco efeito sobre o CD44

– /CD133

– e populações de células totais. Para caracterizar ainda mais o potencial de formação do tumor de CXCR4

+, 1000 células por FACS purificado CXCR4

+ e CXCR4

-DU145 células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID. CXCR4

+ células foram encontrados a ter tumorigenicidade significativamente mais elevado do que o CXCR4

– células (aumento de até 3,8 vezes no crescimento do tumor de xenoenxerto, Figura 2F, Figura S1C). Na verdade, a CD44

+ /CD133

+ e CXCR4

+ células exibiram um potencial tumorigénico semelhante

in vivo

. Estes resultados indicam que a expressão de CXCR4 contribui para o potencial tumorigénico de linhas celulares de androgénio refractários de cancro da próstata.

CXCR4

+ DU145 e PC3 células mostraram um aumento em (A) e clonogenicidade (B) esfera capacidade de formação ao longo CXCR4

– células. (C) CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ DU145 células mostraram um aumento na esfera capacidade de formação em comparação com CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– células. As células foram purificados por FACS e plaqueadas em 24 poços da placa de fixação baixo a uma densidade de 100 células /poço em meio basal epitelial isento de soro e cultivadas durante 10 dias. ** – P valor 0,01. (D) A citometria de fluxo mostrou que a análise CXCL12 estimula a proliferação de progenitores de cancro da próstata em DU145 e PC3 em linhas celulares de um modo dependente da dose. células DU145 e PC3 foram cultivadas em, meio EBM sem soro com suplementos e tratadas com as concentrações indicadas de CXCL12 reabastecido diariamente durante 5 dias. (E) A sobre-expressão de CXCR4 em células de cancro da próstata, resultou num aumento de 3 vezes de CD44

+ /CD133

+ população. células DU145 foram infectadas com adenovírus que codifica CXCR4 sob o controlo do sistema regulador Tet-off, e com adenovírus de controlo e analisados ​​4 dias após a infecção. expressão de CXCR4 foi validado por análise de citometria de fluxo. (F) CXCR4

+ células possuem propriedades superiores tumorigênicos comparação com CXCR4

– células. 10

3 CXCR4

+, CXCR4

-, CD44

+ /CD133

+ e CD44

– /CD133

– células DU145 recolhidos pela separação por FACS foram incluídos em BD Matrigel e injectado sc em ratinhos NOD /SCID. Cada grupo experimental continha, pelo menos, cinco ratinhos. As barras de erro representam SEM

Por fim, determinar se CXCR4

+ e CXCR4

-. células apresentam potencial de diferenciação distinta analisando estas populações de células para a expressão de marcadores de linhagem de próstata. Estudos anteriores demonstraram que o câncer de próstata pode ser proveniente de CK5

+ células basais com potencial multilinhagens diferenciação [23], [24]. células DU145 e PC3 foram ordenados para o CXCR4

+ e CXCR

– frações e cultivado em cultura de tecidos de plástico tratados em condições de diferenciação. Curiosamente, CXCR4

+ populações em DU145 e linhas celulares PC3 são mais heterogêneos em relação ao CXCR4

– células e incluem uma CK5

+ população de células epiteliais basais, a população intermediária de basal-like CK5

+ /CK18

+ células, e CK18

+ população de células epiteliais luminais. Em contraste, CXCR4

– as células se diferenciam para CK5

– /CK18

+ e CK5

+ /CK18

+ células, mas não dão origem a CK5

+ células epiteliais basais ( A Figura 3). Este resultado sugere que o CXCR4

+ população abriga células basais-like mais tumorigênicos, o que é consistente com os resultados recentes que as células epiteliais basais são uma célula de origem para câncer de próstata [25].

FACS CXCR4 purificado

+ e CXCR4

– células DU145 e PC3 foram cultivadas sob condições de diferenciação na presença de 10% FBS.CXCR4

+ células diferenciar toCK5

+ células epiteliais basais (10,7%), CK5

+ /CK18

+ células intermediárias (32,2%), e CK18

+ células epiteliais luminais (57,1%). Em contraste, CXCR4

– as células se diferenciam para CK18

+ células (91,9% da população total de células) e CK5

+ /CK18

+ células (8% da população total de células), mas epitelial não basal células. Barras de escala indicam 15 um.

CXCR4 via /CXCL12 regula células cancerosas da próstata através de uma PI3K /AKT /FOXO3a realimentação dependente circuito

Recentemente, nós mostramos que a ativação da via PI3K /AKT é importante para o cancro da próstata progenitoras auto-renovação e tumorigenicidade [5], [12]. Além disso, um estudo anterior demonstrou que a interacção /CXCL12 CXCR4 activa PI3K /AKT em células de cancro da próstata [26]. Assim CXCR4 pode contribuir para a manutenção de células progenitoras de cancro da próstata através da activação do eixo de PI3K /AKT. PI3K /AKT regula a transcrição através da família de factores de transcrição forkhead (FOXO) por fosforilação de serina /treonina conservadas. Transcricionalmente activos Foxos afectam uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a sobrevivência celular, a reparação do ADN, resposta ao stress oxidativo, e a longevidade [27]. Entre os membros da família FOXO, FOXO3a foi mostrado ser importante para a manutenção da neural, hematopoiética e células estaminais endoteliais [28], [29], [30], e as populações de células estaminais do tipo de cancro da próstata [5] , [12]. Consistente com experiências anteriores que mostraram que a expressão do gene dependente de FOXO3a é inibida na CD44

+ /CD133

+ progenitores câncer de próstata contra CD44

– /CD133

– células [5], descobrimos que o FACS purificado CXCR4

população + células PC3 mostrou diminuição dos níveis de expressão de genes responsivos FOXO3a tais como p21, GADD45, p130, BIM1 e CyclinG2 comparação com CXCR4

– células, sugerindo que o aumento da expressão de CXCR4 está associado a PI3K activação (Figura 4A). O tratamento de células de cancro da próstata com CXCL12 a uma concentração de 100 ng /ml de activação da via PI3K /AKT induzidas (até 1,5-2,0 vezes de aumento na fosforilação de AKT em células PC3 e DU145, respectivamente) (Figura 4B), para além aumentando o CD44

+ /CD133

+ populacional para ambas as células PC3 e DU145 (Figura 2D). Por outro lado, a inibição de PI3K aboliu completamente o efeito de CXCL12 sobre a proliferação de CD44

+ /CD133

+ progenitores (Figura 4C), e reduziu o nível de expressão de CXCR4 em ambos DU145 e células PC3

in vitro Comprar e

in vivo

(Figura 4D, e). células

(a) Isolado CXCR4

+ PC3 mostrou diminuição dos níveis de genes responsivos FOXO3a tais como p21, GADD45 expressão, p130, BIM1, CyclinG2 comparação com CXCR4

-PC3 células. Os níveis de ARNm foram determinados por RT-PCR quantitativa e normalizado para ARNm de GAPDH. (B) Tratamento das células de cancro da próstata com activação induzida CXCL12 da via PI3K /AKT. células DU145 e PC3 foram cultivadas em isento de soro, meio EBM com suplementos e tratadas com as concentrações indicadas de CXCL12 e NVP-BEZ235 durante 18 horas. (C) proliferativa efeito da CXCR4 de sinalização /CXCL12 em CD44

+ /CD133

+ progenitores poderia ser completamente abolida pela inibição de PI3K. células DU145 e PC3 foram cultivadas em isento de soro, meio EBM com suplementos e tratadas com as concentrações indicadas de CXCL12 e NVP-BEZ235 reabastecido diariamente durante 5 dias. (D) O tratamento de células DU145 e PC3 com inibidores de PI3K LY294002 e NVP-BEZ235 reduziu o nível de CXCR4. inibição (E) PI3K diminui expressão CXCR4

in vivo

. células DU145 foram injectadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID. Quando os tumores cresceram até um tamanho de 300 mm a

3, os ratinhos foram tratados com NVP-BEZ235 (12,5 mg /kg administrada diariamente por via oral) ou com veículo durante 5 semanas. A análise histológica de secções embebidas em parafina demonstra redução da expressão de CXCR4 em tumores de xenoenxertos tratados com o inibidor de PI3K. As barras de escala indicam 15 um. células DU145 (F) estavelmente transfectadas com GFP-FOXO3a diminuíram a expressão de CXCR4. A análise Western blot mostra endógeno e as proteínas de fusão FOXO3a sobre-expressos (setas). ensaio (L) ChIP demonstra que FOXO3a se liga ao promotor de CXCR4. células DU145 e PC3 foram estavelmente transfectadas com GFP ou FOXO3a-GFP, tal como descrito [17]. As células foram reticuladas com formaldeído e cromatina foi imunoprecipitada com anticorpo /anti-FKHRL1 FOXO3a. O promotor de ligações cruzadas CXCR4 genómico foi detectado por PCR. FOXO3a gene regulado eNOS foi usada como um controlo positivo. A quantidade de promotor FOXO3a-CXCR4 precipitado foi aumentada em células DU145 estavelmente transfectadas com a proteína FOXO3a-GFP.

Também observamos uma diminuição nos níveis de proteína CXCR4 em resposta a superexpressão FOXO3a em células DU145 (Figura 4F ) sugerindo que FOXO3a poderia regular os níveis de CXCR4 diretamente através de regulação da transcrição CXCR4 ou indirectamente através de um gene alvo FOXO3a diferente. Inspeção do promotor CXCR4 [31] revelou uma sequência putativa FOXO ligação GCAAACA [32] a partir de posições -187 a -181. A fim de confirmar que FOXO3a se liga ao promotor de CXCR4, foi realizado um ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A quantidade de promotor CXCR4 precipitado foi aumentada em células DU145 estavelmente transfectadas com a proteína FOXO3a-GFP (Figura 4G) que demonstre o FOXO3a se liga ao promotor CXCR4. Estes dados mostram uma relação entre a ativação PI3K /AKT sinalização, expressão CXCR4 e da capacidade de auto-renovação e tumorigenicidade de CD44

+ /CD133

+ células progenitoras câncer de próstata.

CXCR4 regula a adesão de células progenitoras tumor

o papel de CXCR4 na progressão do cancro tem geralmente sido analisados ​​no contexto de metástases de células de cancro [19], [20], [21], [22], [33]. Ao nível molecular, o CXCR4 é um mediador importante da interacção de células de tumor da próstata com proteínas da matriz extracelular tal como laminina, fibronectina, colagénio e que contribui para o processo metastático [14], [34], [35]. Apesar do facto de o CXCR4 não modula directamente a ligação de células, acoplamento do receptor CXCR4, por CXCL12 desempenha um papel essencial na gestão de adesão celular através da modulação da expressão de integrina, fosforilação de FAK e activação de p38 MAPK e cinases de pedra [34], [36]. Para examinar o papel de CXCR4 na adesão celular e migração de células de tumor da próstata iniciando, comparamos FACS classificadas CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ células com outras populações em ensaios de adesão celular. Descobrimos que CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ células têm significativamente maior adesão dependente de CXCL12 à fibronectina que CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– ou CD44

– /CD133

– /CXCR4

– populações de células (Figura 5A). A adesão induzida por CXCL12 de células de cancro da próstata para a matriz extracelular é mediado por integrinas. Curiosamente, os níveis de α2, α5 e β3 integrina subunidades de expressão são fortemente regulada em CD133

+ /CD44

+ DU145 comparação com CD133

– /CD44

– células DU145 (Figura 5B), consistente com estudos recentes que demonstram que a activação da via /CXCL12 CXCR4 nas células DU145 conduz à expressão aumentada de α5 e integrinas p3 [14]. Além disso, a inactivação da via PI3K com NVP-BEZ235 (200 nM) diminuiu significativamente a adesão dependente de CXCR4 de CD133

+ /CD44

+ DU145 células à fibronectina, e esta inibição poderia ser abolida na presença de 200 ng /mL CXCL12 (Figura 5C). Notavelmente, a adesão de CD133

– /CD44

– células DU145 não respondem ao tratamento CXCL12 ou inibição de PI3K sinalização (Figura 5C). Colectivamente, estes estudos sugerem que a expressão de CXCR4 poderia proporcionar uma vantagem selectiva para a interação com a matriz extracelular e facilitar a pré-invasiva ligação das células progenitoras tumor que permitam uma maior disseminação do tumor.

(A) DU145 CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ células têm significativamente maior adesão dependente de CXCL12 à fibronectina que CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– ou CD44

– /CD133

– /CXCR4

– células populações. As células foram separadas por FACS e plaqueadas em placas revestidas com fibronectina e deixadas aderir durante 1 h. As células foram contadas em três poços por condição usando um microscópio de contraste de fase * – Valor de p . 0.05. (B) O nível de α2, α5, e integrinas subunidades p3 expressão é fortemente regulada em CD133

+ /CD44

+ DU45 comparação com CD133

– /CD44

– células DU45. (C) A inactivação da via PI3K com NVP-BEZ235 diminui significativamente a adesão dependente de CXCR4 de CD133

+ /CD44

+ DU45 células à fibronectina. A adesão de CD133

+ /CD44

+ DU45 células poderiam ser restaurado na presença de CXCL12. A adesão de CD133

– /CD44

– DU45 não respondeu à modulação sinalização CXCR4 e PI3K, * Valor p . 0,05

A inibição da via CXCR4 leva a uma diminuição em populações progenitoras de cancro da próstata

para fornecer evidência adicional de que a sinalização /CXCL12 CXCR4 é importante para a manutenção de células estaminais do tipo e segmentação desta via podem conduzir à inibição do crescimento de células progenitoras do cancro da próstata, realizaram-se testes de inactivação o eixo /CXCL12 CXCR4 por um anticorpo neutralizante afeta progenitores câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

. células DU145 foram tratadas com /mL-CXCR4 anti 10 ug neutralizantes (IgG monoclonal de ratinho, clone 44716, R D Systems) ou anticorpo de controlo (rato controlo isotipo IgG, tempo de vida Bioscience Inc.) durante 5 dias em meio de crescimento epitelial isento de soro e capacidade de formação esfera foi medido. O tratamento com anticorpo anti-CXCR4 conduz a uma redução de 2,2 vezes na esfera capacidade de formação em células DU145 em comparação com as células tratadas com anticorpo de controlo (Figura 6A). Além disso, citometria de fluxo revelou uma diminuição de mais de 2 vezes na presença de células CD44

+ /CD133

+ população de células DU145 pré-tratados com anticorpo anti-CXCR4 (Figura 6B), bem como a inibição da sinalização da via PI3K /AKT1 via (Figura 6C). A pré-incubação de células DU145 com anti-CXCR4 de anticorpos antes da injecção subcutânea em ratinhos NOD /SCID retardou significativamente o crescimento do tumor (Figura 6d), em comparação com as células tratadas com anticorpo de controlo.

células DU145 (A) foram plaqueadas em placas de 96 bem placas de baixo de fixação em 100 células por poço (5 repetições) e as esferas foram cultivadas em isento de soro, meio EBM com suplementos. Os anticorpos foram reabastecidas diariamente. As células foram fotografadas com uma microplaca Acumen EX3 citômetro e esferas foram detectadas utilizando software de análise de imagem. O tamanho esfera foi medida pela intensidade de GFP. As esferas foram discriminadas a partir de detritos de células utilizando um filtro de Gauss. As esferas de interesse do estudo estão descritos no vermelho e indicado por setas. Os dados representativos a partir de uma de duas experiências independentes é mostrado; * – Valor de p 0,05. (B) citometria de fluxo revelou atenuação de CD44

+ /CD133

+ população de células DU145 tratadas com 10 ug /ml de neutralização CXCR4 anti- (IgG monoclonal de ratinho, clone 44716, R D Systems) ou 10 ug /ml de anticorpo de controlo (controlo do isotipo IgG de ratinho, tempo de vida Bioscience Inc.) durante 5 dias. A célula foram cultivadas em meio suplementado com 2% de FBS. O meio de cultura foi atualizado a cada segundo dia; * – Valor de p 0,05. (C) análise de transferência de Western de células DU145 tratadas com 10 ug /ml de anticorpo neutralizante anti-CXCR4, durante 5 dias a regulação negativa da activação da via PI3K /AKT em comparação com as células tratadas com 10 ug /ml de anticorpo de controlo demonstradas. A célula foram cultivadas em meio suplementado com 2% de FBS. O meio de cultura foi atualizado a cada segundo dia. (D) A pré-incubação de células de cancro da próstata com anticorpo neutralizante anti-CXCR4 atrasa significativamente o crescimento do tumor. 5 × 10

5 DU145 células pré-tratadas com anticorpos neutralizantes anti-CXCR4 ou controlo durante 5 dias foram incluídos em BD matrigel e injectado s.c. . Em camundongos NOD /SCID * – Valor de p . 0,01

Em seguida, testamos os efeitos da AMD3100 pequena molécula antagonista específico-CXCR4 sobre a sobrevivência da população progenitora (CD44

+ /CD133

+) dentro de linhas celulares de cancro da próstata. células PC3 foram tratadas com 0,5 uM AMD3100 ou com 75 uM do fármaco 5-fluorouracilo quimioterapêutico convencional durante 4 dias em meio de crescimento isento de soro epitelial. Análise de citometria de fluxo revelou uma redução de 2,2 vezes na presença de células CD44

+ /CD133

+ população com tratamento AMD3100 (Figura 7A e Figura S2A), ao passo que esta população foi aumentada até 2,1 vezes na resposta à terapia convencional. Em contraste, o CD44

– /CD133

– A população foi sensível à quimioterapia convencional, mostrando uma diminuição de 2,1 vezes, mas não respondeu ao tratamento AMD3100. Além disso, a combinação de AMD3100 eo quimioterápico resultou em uma diminuição simultânea de CD44

+ /CD133

+ e CD44

– /CD133

– populações de células (≥1.8 vezes diminuição e 1,7 fold diminuir respectivamente)

(a) o tratamento com CXCR4 antagonista AMD3100 diminui a CD133

+ /CD44

+ população, mas não afetou significativamente o CD133

-. /CD44

– população dentro de células cancerosas da próstata. A utilização de drogas citotóxicas resultados sozinho em uma diminuição na proliferação de células de tumor, mas que conduz a um aumento geral na população relativa de células tumorais iniciar. Combinatória tratamento de células PC3 com AMD3100 e o fármaco quimioterapêutico convencional 5-fluouracil diminui populações de células indiferenciadas e ambos diferenciadas. células PC3 foram cultivadas em isento de soro, meio EBM com suplementos e tratadas com as concentrações indicadas de AMD3100 e 5-fluouracil. No 5

° dia as células foram submetidas a análise de citometria de fluxo; * Valor p 0,05. (B) a terapia combinatória

in vivo

demonstra inibição significativa do crescimento do tumor em comparação com o tratamento medicamentoso único. Os ratinhos foram tratados com Taxotere (20 mg /kg, 1q.w., p.o.) como descrito (19). Alzet bombas foram usadas para fornecer AMD3100 a uma taxa constante de 0,25 ug /kg /hora. As bombas carregadas com AMD3100 ou solução salina foram implantados subcutaneamente. Os ratinhos foram observados durante 8 semanas para a aparência e o desenvolvimento de tumores. (C) CD133 e CD44 imunocoloração em secções congeladas de tumores de xenoenxertos tratados com combinatória ou mono-terapia a partir de (B) revelou que a inibição selectiva da CD133

+ /CD44

+ população pelo antagonista do CXCR4 AMD3100; * Valor p 0,05. (D) Análise de Western blot mostrou uma diminuição significativa da fosforilação da FOXO3a nos tumores tratados com AMD3100.

A terapia de combinação de segmentação células de tumor progenitoras e a granel conduz à regressão do tumor melhorada

Para determinar Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.