Abstract

Scoparone, um composto natural isolado a partir de

Artemisia capillaris

, tem sido usado em chinês fitoterapia para tratar a icterícia neonatal. transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) contribui para o crescimento e sobrevivência de muitos tumores humanos. Este estudo foi realizado para investigar a actividade anti-tumoral de scoparone contra células de cancro da próstata DU145 e para determinar se os seus efeitos são mediados pela inibição da actividade de STAT3. Scoparone inibiu a proliferação de células DU145 via paragem do ciclo celular em G

1 fase. Os ensaios de transfecção transitória mostraram que scoparone reprimidas tanto actividade transcripcional constitutiva e induzida pela IL-6 da STAT3. As análises de transferência de Western e quantitativa PCR em tempo real demonstrou que scoparone suprimiu a transcrição de genes alvo, tais como STAT3 ciclina D

1, c-Myc, survivina, Bcl-2, e SOCS3. Consistente com isto, scoparone diminuiu a fosforilação e acumulação nuclear da STAT3, mas não reduziu a fosforilação da cinase Janus 2 (JAK2) ou Src, os principais quinases a montante responsáveis ​​pela activação da STAT3. Além disso, a actividade transcricional de um mutante constitutivamente activo de STAT3 (STAT3C) foi inibida por scoparone, mas não por AG490, um inibidor de JAK2. Além disso, o tratamento scoparone suprimiu o crescimento independente da ancoragem em ágar macio e o crescimento de tumores de xeno-enxertos em ratinhos nus DU145, concomitante com uma diminuição na fosforilação da STAT3. modelagem computacional sugeriu que scoparone pode vincular o domínio SH2 da STAT3. Os nossos resultados sugerem que induz uma scoparone efeito anti-tumor contra as células de cancro da próstata DU145 em parte através da inibição da actividade da STAT3.

Citation: Kim J-K, Kim J-Y, Kim H-J, Parque K-G, Harris RA, Cho W-J, et al. (2013) Scoparone Exerce Anti-Tumor atividades contra células DU145 do cancro da próstata através da inibição da STAT3 Atividade. PLoS ONE 8 (11): e80391. doi: 10.1371 /journal.pone.0080391

Autor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Alemanha |

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 02 de outubro de 2013; Publicação: 15 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Seu trabalho foi apoiada por doações da Fundação Nacional de Pesquisa [2012R1A2A2A01043867, 2012R1A2A1A03670452 e Programa de Pesquisa em Ciência básica, (2012-0.001.350)] financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento futuro e uma concessão do amp tecnologia Korea Saúde R D Project, Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia (A111345). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não há interesses concorrentes existem

Introdução

câncer

de próstata é o segundo câncer mais comum e a sexta maior causa de morte por câncer em homens em todo o mundo [1]. Embora o cancro da próstata metastático responde inicialmente a terapia de privação de androgénio, a maioria dos pacientes, eventualmente, progredir para um estado de cancro da próstata resistente à castração (CRPC) [2,3]. Mesmo com quimioterapia à base de docetaxel, o tratamento de pacientes com CRPC metastático continua sendo um grande desafio clínico. Neste contexto, o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) via de sinalização tenha sido validado como um alvo terapêutico promissor no cancro da próstata metastático: esta proteína é activada de forma aberrante em cancro da próstata e contribui para a promoção da progressão metastático [4,5 ].

STAT3, uma família de factores de transcrição STAT sete, funciona como um efector a jusante de várias citocinas, factores de crescimento e hormonas, incluindo a IL-6, factor de crescimento epidérmico (EGF), e leptina [6-9]. Em resposta a estímulos extracelulares, a STAT3 é activada através de fosforilação em Y705 e S727 por tirosina-quinases não receptoras, incluindo JAK2 e Src, e por proteínas quinases activadas por mitogénio (MAPK) [10-12]. As proteínas fosforiladas STAT3 formar dímeros que se translocam para o núcleo, onde regulam a transcrição de genes alvo a jusante. Apesar de sua fosforilação é transitória e bem regulado em células normais não transformadas, STAT3 é persistentemente ativada em uma variedade de tumores humanos, incluindo malignidades hematológicas (leucemia, mieloma múltiplo e linfoma) e tumores sólidos (cabeça e de células escamosas pescoço carcinoma [HNSCC] , cânceres melanoma, cólon, hepatoma, mama e próstata) [13-17]. Um grande número de estudos têm fornecido evidências convincentes para o papel oncogênico da STAT3 constitutivamente ativo [13-20]. activação persistente de STAT3 promove diversos processos tumorigénicas e metastáticos através da regulação da transcrição de vários genes envolvidos na proliferação celular (ciclina D

1, c-myc, e p21), sobrevivência (Bcl-2, Mcl-1, e Survivina), metástase (MMP-2 e MMP-9), e a angiogénese (VEGF). Portanto, STAT3 é agora considerado para representar um alvo molecular promissora para o desenvolvimento de terapias anti-câncer usando abordagens directas e indirectas [13,14,21].

Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), um dos principais constituinte da erva chinesa

Artemisia capillaris

(Yin queixo), tem sido utilizada para o tratamento da icterícia neonatal na Ásia [22,23]. O efeito protector de scoparone contra hiperbilirrubinemia é mediada pela activação constitutiva do receptor androstano (CAR), um receptor de hormona nuclear que actua como um factor de transcrição para regular a expressão de enzimas envolvidas na depuração da bilirrubina. Scoparone também possui várias outras propriedades biológicas, incluindo anti-coagulante, hipolipidémico, vaso-relaxante, anti-oxidante, e efeitos anti-inflamatórios [24-28]. A inibição da actividade de transcrição do factor nuclear-kappaB (NF-kB) parece responsável pela sua actividade anti-inflamatória [28]. No entanto, o potencial de actividade anti-tumoral de scoparone e as suas outras do que o carro e NF-kB alvos moleculares não foram extensivamente investigados. Neste estudo, avaliou-se a actividade anti-tumor contra as células de scoparone com cancro da próstata independente de androgénios DU145 e descobriram que os seus mecanismos moleculares de acção está associada com a inibição da actividade da STAT3.

Materiais e Métodos

Reagentes e construções de plasmídeos

Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), AG490 (um inibidor de JAK2), TNF-α, forscolina (FSK), e de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) eram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). IL-6 foi obtido a partir de BD Biosciences (San José, CA, EUA). A construção repórter M67-Luc e os vectores de expressão para o tipo selvagem STAT3 ou uma sua forma constitutivamente activa de STAT3 (STAT3C) [20] foram tipo presentes do Dr. James E. Darnell (The Rockefeller University, Nova Iorque, NY, EUA) . construções repórter (NF-kB-Luc, AP-1-Luc, CRE-Luc, e Egr-1-Luc) e vector de expressão de Egr-1 foram descritos anteriormente [29]. A construção repórter de luciferase pTOPFLASH [30] e o vector de expressão para o mutante dominante activa de β-catenina humana (ΔN-β-catenina) que contém uma deleção em enquadramento N-terminal de aminoácidos 29-48 [31] foram gentilmente doados pelo Dr. Hans Clevers (University Medical Center Utrecht, Utrecht, Holanda) e Dr. Frank McCormick (Universidade da Califórnia, San Francisco, CA, EUA), respectivamente. Para gerar o vxy Puro-Luc construir, o ADNc que codifica a luciferase de pirilampo foi amplificado por PCR e inserido no

Bam H1

/Xho 1

locais de plasmídeo vxy-Puro [12].

Ética declaração

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais apropriados para a pesquisa animal. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade Nacional Kyungpook (Permit Number: 2013-0015).

Cultura de células e ensaio de transfecção transiente

próstata humano linhas celulares de cancro (DU145 e PC-3), uma linha de células epiteliais da próstata humana imortalizada (RWPE-1), linhas celulares de cancro da mama humano ( linhas MCF-7 e MDA-MB-231), humanos carcinoma hepatocelular celulares (HepG2 e Hep3B), uma linha de células de câncer cervical (HeLa), e linhas celulares de cancro do cólon (HT-29, HCT-116 e HCT-15) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). DU145, PC-3, MDA-MB-231, HeLa, HT-29, HCT-116 e HCT-15 as células foram cultivadas em RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS ; Hyclone, Logan, UT, EUA) e antibióticos. As células MCF-7 e Hep3B foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen) suplementado com 10% FBS e antibióticos. células RWPE-1 foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos completa (K-SFM; Invitrogen) contendo 50 ug /mL de extracto de pituitária de bovino, 5 ng /ml de EGF humano recombinante, e antibióticos. As células HepG2 foram cultivadas em MEM (Invitrogen) suplementado com 10% FBS e antibióticos. Para os ensaios de transfecção transiente, HepG2 (8 × 10

4), DU145 (3 × 10

4), e PC-3 (3 × 10

4) As células foram semeadas em placas de 24 cavidades e foram transfectadas com a construção repórter M67-Luc (200 ng /cavidade), com ou sem vector de expressão (100 ng /poço) durante quer de tipo selvagem ou STAT3 mutante constitutivamente activo (STAT3C) usando o reagente de transfecção de trânsito de LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI, EUA). As células HepG2 foram também transfectadas com pTOPFLASH ou de Egr-1-Luc plasmídeos repórter (200 ng /poço), juntamente com ou sem plasmídeos de expressão (100 ng /poço) durante ΔN-β-catenina ou de Egr-1, respectivamente. pSV40-β-galactosidase do plasmídeo de expressão foi usado como um controlo interno. Ao fim de 24 h após a transfecção, as células foram estimuladas com IL-6 (10 ng /mL) durante 24 h, se necessário, e, em seguida, colhidas para ensaios de luciferase e β-galactosidase. A actividade de luciferase foi normalizada contra a actividade β-galactosidase.

proliferação celular ensaio

ensaios de proliferação celular foram realizadas utilizando o kit de ensaio de WST-8 proliferação celular, como descrito anteriormente [29]. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1,5 x 10

3 células /poço e privadas de soro durante 24 h. As células foram então estimuladas com SBF a 10% na presença de 0,1% de DMSO (veículo) ou 0,1, 1, 10, 50, 100, 200, 500 ou 1000 pmol /L de scoparone durante 72 h. As células foram então incubadas a 37 ° C durante mais 2 h em meio contendo o WST-8 (Dojindo Laboratories reagente, Kumamoto, Japão). A absorvância a 450 nm foi medida para determinar a proliferação celular.

análise citométrica de fluxo do ciclo celular

análise do ciclo celular por citometria de fluxo foi realizada como previamente descrito [29]. Resumidamente, as células DU145 (4 × 10

5 células /100 mm de prato de cultura) foram sincronizadas em L

0 /L

1 fase por privação de soro durante 24 h. Com base em um relatório anterior [32] mostrando que as células DU145 privadas de soro progrediu de L

1 para a fase S do ciclo celular após 27,5 horas de estimulação com soro, as células foram estimuladas com SBF a 10% na presença de 0,1% de DMSO ou scoparone (0,5 e 1 mmol /L) durante 28 h. As células foram recolhidas, e então analisadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Bioscience).

Western blot análise

análise de Western blot foi realizada como descrito anteriormente com pequenas alterações [12,29]. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para Immobilon-P-membrana (Millipore, Billerica, MA). Após o bloqueamento, a membrana foi incubada com anticorpos primários contra a ciclina D

1, fosfo-pRb (ppRb), JAK2, fosfo-JAK2 Tyr1007 /1008 (pJAK2), Src, família fosfo-Src Tyr416 (pSrc), STAT3, fosfo-STAT3 Tyr705 (pSTAT3 Y705), fosfo-STAT3 Ser727 (pSTAT3 S727), Survivina, c-Myc, SOCS3, e Bcl-2 (Cell Signaling, Beverly, MA, EUA); Ciclina E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), e β-actina (Sigma-Aldrich). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) – ou IRDye-conjugado (IRDye 800CW e IRDye 680LT, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) anticorpos secundários, e os sinais foram detectados utilizando o sistema de detecção de mancha de ECL Western (Amersham , Buckinghamshire, Reino Unido) ou Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA), respectivamente. β-actina foi utilizado como o controlo da carga de proteína. intensidades de sinal foram quantificadas por densitometria utilizando o software Image J. e normalizados contra os sinais de p-actina correspondentes.

PCR (qRT-PCR), análise

células DU145 quantitativo em tempo real foram incubadas com scoparone para 1, 3, 6, 12, ou 24 h. O RNA total foi extraído usando o reagente de lise QIAzol (Qiagen, Valencia, CA, EUA), e 1 mg de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com os fabricantes “instruções. Para qRT-PCR, 25-50 ng de ADNc foi utilizado para amplificação por PCR (temperatura de emparelhamento: 60 ° C) usando a energia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) com o VIIa ™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). P0 ácida fosfoproteína ribossomal (RPLP0; 36B4) foi usada como um controlo interno. condição de PCR e sequências iniciadoras estão listados na Tabela S1.

Análise por imunofluorescência

células DU145 foram semeadas em lamelas de vidro e deixadas a aderir durante 24 h. Com base nos nossos resultados de Western blot mostrando redução sustentada em STAT3 fosforilação 2-6 h após o tratamento scoparone, as células foram tratadas com scoparone (0,5 mmol /L) durante 4 h. As células foram fixadas com etanol a 95% durante 15 min a -20 ° C, e, em seguida, incubadas com anticorpos contra pSTAT3 (Y705) ou STAT3 seguido de incubação com Alexa Fluor 488- ou Alexa Fluor 568 anticorpos secundários marcados, respectivamente. os núcleos das células foram coradas com DAPI e imagens confocais foram obtidos e se fundiram.

Anchorage independente ensaio de crescimento

Os ensaios de colónia de formação de agar mole foram realizados conforme descrito anteriormente com pequenas alterações [12]. DU145 (1 × 10

4) células em 1,5 ml de meio de crescimento foram misturados com 1,5 mL de 0,5% de agarose num meio de crescimento aquecido contendo veículo (0,1% DMSO) ou de 50, 100, ou 200 nmol /L de scoparone e em camadas em agar de base de 0,5% em placas de cultura celular de 60 mm. O meio de cultura contendo scoparone foi adicionado apenas uma vez; posteriormente, meio sem scoparone foi adicionado a cada semana durante 21 dias, até grandes colónias eram evidentes. As células foram coradas com violeta de cristal para contagem de colônias.

A modelagem molecular e estudo de encaixe

O estudo de modelagem e encaixe molecular foi realizada utilizando Surflex-Dock em SYBYL versão 8.1.1 por Tripos Associates (St . Louis, MO, EUA), como previamente descrito [33]. A estrutura cristalina da STAT3 foi recuperado a partir do Protein Data Bank (PDB ID código 1BG1) e refinado para o processo de encaixe [34]. A estrutura de scoparone foi criada utilizando o pacote SYBYL com comprimentos de ligação e ângulos de padrão, e minimizado utilizando o método do gradiente conjugado até que o gradiente foi de 0,001 kcal /mol, com o campo de força Tripos. A carga Gasteiger-Hückel, com uma função dielétrica dependente da distância, foi aplicado para o processo de minimização. A imagem da interação previsto foi criado com o molecular MOLCAD programa gráfico. Depois de executar Surflex-Dock, o conformador com a melhor pontuação total foi selecionado e usado para prever os padrões de ligação detalhados na cavidade.

O estabelecimento de linhas celulares estáveis ​​expressando firefly luciferase

Para gerar retrovírus expressando luciferase do pirilampo, células Phoenix Um foram transfectadas com o vxy Puro-Luc construidas como descrito anteriormente [12]. células DU145 foram transduzidas com retrovírus que expressam a luciferase do pirilampo e seleccionadas com puromicina (1 jag /mL) durante 2 semanas. células DU145 seleccionado (DU145-Luc) foram verificados quanto à actividade de luciferase e para o efeito anti-proliferativo de scoparone (dados não publicados).

Xenoenxerto modelo de tumor e imuno-histoquímica

masculino atímicos seis semanas de idade BALB /c nu (nu /nu) ratos (Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japão) foram aclimatadas em condições controladas condições normais de uma semana antes do experimento acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do Instituto Nacional de Saúde. DU145-Luc (5 × 10

6) células em 100 ul de PBS foram injectadas subcutaneamente no flanco direito a área dorsal de ratinhos nus atímicos machos (Balb /c Slc-

nu /nu, 7 semanas

velho). O diâmetro do tumor foi medido com uma régua externamente pinça cada 2 dias, e o volume do tumor (mm

3) foi estimada. Após 7 dias, quando os tumores atingiram uma dimensão média de cerca de 20-25 mm

3, os ratinhos foram fotografadas no sistema de imagiologia IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA) 10 min após a injecção i.p. injecção de 100 uL XenoLight D-luciferina (30 mg /mL, calibre). Os animais foram então divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 8 /grupo), injecções de veículo ou scoparone (30 mg /kg) a cada 2-3 dias durante 18 dias dada por via intraperitoneal (i.p.). Os ratinhos foram anestesiados com pentobarbital de sódio (Entobar; Hanlim farmacêutica, Yong-In, Coreia) e fotografada no sistema de imagiologia IVIS. tumores de xenoenxertos foram excisados ​​para medição do volume e imuno-histoquímica. Para análise imuno-histoquímica, tecidos de tumor foram removidos, fixados em formol e incluídos em parafina. secções de tumor em série 4-um foram desparafinizadas em xileno, re-hidratadas através de descidas de etanol, e quer coradas com hematoxilina e eosina (H E) ou submetidos a análise imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra pSTAT3 (Y705) e survivina conforme previamente descrito [29] .

a análise estatística

Os dados são expressos como média ± SEM As análises estatísticas foram realizadas com o Student não pareado

t

-teste, e um valor de

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Scoparone provoca um efeito anti-proliferativa em células de câncer de próstata humana DU145 através da indução de paragem do ciclo celular em G

1 fase

Para avaliar o potencial anti-câncer do scoparone em células de câncer de próstata

in vitro

, foi realizado um ensaio de proliferação celular WST-8 em duas linhas independentes de andrógenos humanas de câncer de próstata celulares (DU145 e PC-3) e uma linha imortalizada de células epiteliais da próstata humana (RWPE-1). Scoparone tratamento durante 72 h, inibiram significativamente a proliferação de células DU145, com um IC

50 valor de 41,3 nmol /L. No entanto, o medicamento exerce pouco efeito inibidor do crescimento em PC-3 e as células RWPE-3 em que a concentração (Figura 1A). No entanto, ambas as linhas de células mostraram proliferação reduzida a concentrações mais elevadas da droga ( 100 umol /L), que também foi observado em várias outras linhas celulares derivadas de cancros da mama (MCF-7 e MDA-MB-231), carcinoma hepatocelular (HepG2 e Hep3B), cancro do colo do útero (HeLa), e os cancros do cólon (HCT-15, HCT-116 e HT-29) (Figura 1A e Figura S1), o que sugere que scoparone tem um efeito anti-proliferativo em células de cancro em geral.

A e B. Scoparone inibe a proliferação de linhas de células de cancro humano. células de cancro da próstata (DU145 e PC-3), RWPE-1 (uma linha de células epiteliais da próstata humana imortalizada), e células de cancro da mama (MCF-7 e MDA-MB-231) foram privadas de soro durante 24 h. As células foram em seguida incubadas em meio de crescimento suplementado com FBS a 10% na presença do veículo (0,1% DMSO) ou nas concentrações indicadas de scoparone durante 72 h, e a proliferação das células foi determinada por ensaio de WST-8. Os dados são expressos como percentagens do controlo do veículo (definida como 100%) e representam as médias ± S.E.M. de três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. B. Scoparone induz a paragem do ciclo celular em G

1 fase em células DU145. células DU145 privadas de soro foram estimuladas com SBF a 10% na presença de veículo ou scoparone (0,5 e 1 mmol /L) durante 28 h, e, em seguida, submetidas a análise citométrica de fluxo do ciclo celular. gráfico de barras indica a porcentagem de células em G

1 fase. Os dados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado.

*

P Art 0,001 vs. controlo do veículo;

#

P Art 0.005,

##

P Art 0,001 vs. estimulação do soro. C. representativas análise de Western blot de proteínas relacionadas com o ciclo celular. células DU145 foram tratados com scoparone (0,5 mmol /L) para os tempos indicados, e, em seguida, colhidas para análise de Western blot. D. Quantificação dos níveis da proteína relativos. intensidades de sinal foram quantificados por análise de densitometria e normalizado para o sinal de que β-actina correspondente. O nível de expressão de cada proteína foi expressa como uma proporção em relação ao nível do controlo ao tempo 0 h, o que foi definido como 1. Os dados representam as médias ± S.E.M de três experiências independentes.

*

P Art 0,05,

#

P Art 0,005 versus controlo de veículo em cada ponto de tempo.

Para determinar adicionalmente se o efeito anti-proliferativo de scoparone é devido à inibição da progressão do ciclo celular ou indução de apoptose, realizou-se uma citometria de fluxo a análise do ciclo celular em células DU14, que foram os mais sensíveis ao efeito inibidor do crescimento de scoparone. Consistente com um relatório anterior [32], a percentagem de células DU145 progredindo na fase S do ciclo celular foi significativamente aumentada após 28 horas de estimulação com soro. Na presença de scoparone, o aumento estimulado-soro na população de células da fase S foi reduzida, e o número de células em G

1 fase foi simultaneamente aumentados (Figura 1B). No entanto, o sub G

1 pico, indicativo de uma população celular por apoptose não foi aumentado em scoparone. Assim, em células DU145, scoparone induz a paragem do ciclo celular em G

uma fase sem indução de apoptose.

A L

paragem do ciclo celular 1 de fase induzida por scoparone foi ainda confirmada através da análise dos níveis celulares de proteínas reguladoras do ciclo celular que promovem o G

1 S-transição. As análises Western blot revelaram que scoparone aumentado os níveis de proteínas do inibidor do ciclo celular, tais como p21 e p27, que são inibidores da expressão da ciclina /CDK, complexo (Figura 1C e D). Por outro lado, reduziu significativamente os níveis de o-ciclo celular promovendo proteínas ciclina D

1 e pRb fosforilada (ppRb), embora tivesse pouco efeito na expressão de ciclina E. Estes resultados demonstram que induz scoparone L

paragem do ciclo celular de fase 1, alterando os níveis de proteínas que influenciam a progressão do ciclo celular.

Scoparone inibe constitutiva e IL-6 estimulada a actividade transcricional da STAT3

Para identificar os factores de transcrição que são alvo de scoparone, avaliou-se o seu efeito sobre a actividade de transcrição de vários factores de transcrição que desempenham papéis importantes na proliferação de células cancerosas. Curiosamente, scoparone suprimiu fortemente STAT3 IL-6 estimulada por actividade de transcrição (Figura 2A) e, como relatado, reprimido actividade transcricional de NF-kB-estimuladas TNF-α. Scoparone também inibiu ligeiramente induzido por PMA actividade de AP-1 e Egr-1 actividade, ao passo que exercida pouco efeito na transcrição tanto CREB- ou β-catenina-dependente (Figura S2).

A. O efeito de scoparone sobre as actividades dos factores de transcrição. As células HepG2 foram transientemente co-transfectadas com diferentes plasmídeos repórter luciferase dirigido por promotores sintéticos contendo sítios de ligação para factores de transcrição relevantes. Ao fim de 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com os estimuladores apropriadas a montante e scoparone durante 24 h, e, em seguida, colhidas para ensaios de luciferase e β-galactosidase. RLU, unidades de luminescência relativa. Os dados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado.

*

P Art 0,0005,

#

P Art 0,005 vs. sozinho repórter;

**

P Art 0.005,

***

P Art 0.001,

##

P Art 0,01 estimulação vs.. B. Scoparone inibe tanto constitutiva e IL-6 estimulada a actividade transcricional da STAT3. células DU145 foram transientemente transfectadas com M67-Luc, um promotor sintético contendo quatro cópias do local de ligação da STAT3. As células de PC-3 foram co-transfectadas com M67-Luc construir e o vector de expressão para o tipo selvagem STAT3. Ao fim de 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com IL-6 na presença de scoparone durante 24 h. Os dados são as médias ± S.E.M. de três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado.

*

P Art 0.005,

#

P Art 0,05,

##

P Art 0,01 vs. sozinho repórter;

**

P Art 0,01,

***

P Art 0,005 vs. IL-6 estimulação. C e D. qRT-PCR e Western blot análise de STAT3 genes alvo a jusante. células DU145 foram tratados com scoparone (0,5 mmol /L) para os tempos indicados, e, em seguida, colhidas para qRT-PCR (C) e Western blot (D) analisa. Os níveis de ARNm de genes alvo STAT3 foram determinados por análise de qRT-PCR (C) e normalizada em relação ao nível de RPLP0 /36B4. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado.

*

P Art 0,05,

#

P Art 0,005 vs controlo de veículo em cada ponto de tempo. Os níveis de expressão de proteína (D) foram quantificados por análise de densitometria e normalizados contra os níveis correspondentes de β-actina. Os dados são expressos como média ± S.E.M. de três experiências independentes.

*

P Art 0,05,

#

P Art 0,005 versus controlo de veículo em cada ponto de tempo.

Para validar o efeito inibitório de scoparone sobre a actividade de transcrição de STAT3, foram realizados ensaios de transfecção transiente utilizando células DU145 STAT3 que expressam constitutivamente activa e células PC-3 falta STAT3 [35]. Scoparone inibiu significativamente a constitutiva e IL-6-reforçada a actividade transcricional da STAT3 em células DU145 (Figura 2B, esquerda). Em células PC-3 STAT3-negativo, como esperado, a actividade luciferase basal foi extremamente baixa; Além disso, a IL-6, o tratamento não aumentou a actividade do gene repórter, o que não foi afectado por scoparone (Figura 2B, para a direita). No entanto, a sobre-expressão do tipo selvagem STAT3 levaram a um aumento na actividade da luciferase em resposta a IL-6, a estimulação de células PC-3. tratamento Scoparone reduzida consideravelmente a actividade STAT3 IL-6 estimulada. Estes resultados sugerem que scoparone inibe tanto a actividade de transcrição constitutiva e IL-6 estimulada de STAT3.

Para investigar se scoparone pode reprimir a transcrição de alvos a jusante da STAT3, nós realizada quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para análises de genes alvo, tais como STAT3 ciclina D

1, c-myc, survivina, Bcl-2, e SOCS3. As análises qRT-PCR demonstrou que scoparone diminuiu os níveis de genes alvo STAT3 (Figura 2C) de expressão de ARNm. De acordo com resultados de qRT-PCR, que também diminuíram significativamente os níveis de proteína dos genes (Figura 2D). Estes resultados demonstram que suprime scoparone de transcrição do gene alvo STAT3.

Scoparone inibe a fosforilação e acumulação nuclear da STAT3 independentemente da JAK2 e Src

Para delinear os mecanismos moleculares inibição subjacente da actividade STAT3 por scoparone, avaliou seu efeito sobre STAT3 fosforilação em células DU145. Scoparone reduziu significativamente os níveis de fosforilação da STAT3 em Tyr705 (pSTAT3 Y705) e Ser727 (pSTAT3 S727) em células DU145 2 h e 30 min após o tratamento, respectivamente (Figura 3A). É também diminuída de IL-6-fosforilação aumentada de STAT3 (Figura 3B). os níveis de proteína total da STAT3 não foram afectados pelo tratamento scoparone (Figura 3A e B, e A Figura S3). Consistente com estes resultados, coloração por imunofluorescência de pSTAT3 Y705 mostrou que as proteínas pSTAT3 foram predominantemente localizadas no núcleo de células DU145 (Figura 3C). O sinal pSTAT3 nuclear foi marcadamente reduzida nas células tratadas com scoparone. Estes resultados demonstram que a fosforilação constitutiva scoparone inibe a e IL-6 estimulada e acumulação nuclear de pSTAT3 em células DU145.

A e B. Scoparone inibe tanto constitutiva (A) e IL-6-fosforilação aumentada (B) da STAT3 na Tyr705 e Ser727. células DU145 foram tratados com veículo ou scoparone (A), ou durante 24 h seguido por tratamento scoparone (0,5 mmol /L) durante 4 h antes da estimulação com IL-6 (B) para os tempos indicados privadas de soro. As células foram recolhidas por transferência de Western utilizando anticorpos contra pSTAT3 (Y705), pSTAT3 (S727), e STAT3. Os níveis de proteína foram quantificadas por densitometria e normalizados contra os níveis correspondentes de β-actina. O nível de expressão de cada proteína ISS expressa como uma proporção em relação ao nível do controlo ao tempo 0 h (definida como 1). Os dados representam as médias ± S.E.M de três experiências independentes.

§

P Art 0,0005 e

§§

P Art 0,005 vs. controlo no momento 0;

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P Art 0,0005,

**

P Art 0.005,

#

P Art 0,01

##

P Art de controlo com veículo versus 0,05 a cada ponto de tempo. C. Scoparone reduz a acumulação nuclear da STAT3 fosforilado. células DU145 foram tratados com scoparone durante 4 h e processadas para coloração por imunofluorescência com anticorpos contra pSTAT3 (Y705) ou STAT3. os núcleos das células foram coradas com DAPI e imagens confocais foram obtidos e se fundiram. A barra de escala indica 10 um. D. Scoparone não inibiu a fosforilação de JAK2 e Src, dois grandes STAT3 cinases a montante. células DU145 foram tratados com scoparone durante os tempos indicados, e, em seguida, colhidas para análise de Western blot. intensidades de sinal foram quantificados por análise de densitometria e normalizados contra os sinais de p-actina correspondentes. O nível de expressão de cada proteína é expressa como uma proporção em relação ao nível do controlo ao tempo 0 h, o que foi definido como 1.

*

P

0,05 vs. controlo do veículo em cada ponto de tempo.

Para determinar se o efeito inibitório do scoparone em STAT3 fosforilação é devido à supressão de eventos de sinalização a montante, que avaliou o efeito do scoparone na fosforilação da JAK2 e Src, dois grandes quinases a montante responsáveis ​​pela ativação do STAT3. Scoparone não reduziu os níveis de proteína de JAK2 constitutivamente fosforilada (Figura 3D) e Src fosforilação não foi reduzida, mas sim ligeiramente elevada, por scoparone. Os níveis de proteína total e mRNA para JAK2 e Src não foram alteradas pelo tratamento scoparone (Figura 3D e Figura S4). Colectivamente, estas observações sugerem que scoparone inibe a fosforilação e acumulação nuclear da STAT3 independentemente das quinases a montante JAK2 ou Src.

Scoparone podem inibir a actividade de transcrição de STAT3 por ligação directa ao domínio SH2 da STAT3

Para confirmar ainda se scoparone pode regular a actividade de STAT3 independentemente da sinalização a montante, as células PC-3 foram transfectadas transitoriamente com STAT3C, um mutante constitutivamente activo da STAT3 que imita a acção da STAT3 fosforilado por substituição de dois resíduos de cisteína dentro do seu domínio SH2 e activa a transcrição do gene alvo sem estímulos a montante [20].