Abstract

desregulamentado Rho GTPases Rac1 e Cdc42 foram descobertos em vários tumores, incluindo próstata e a expressão da proteína Rac aumenta significativamente no cancro da próstata. As vias Rac e Cdc42 promover a proliferação descontrolada, invasão e propriedades metastáticas de células cancerosas humanas. Sintetizamos o novo composto AZA1 com base na informação estrutural do NSC23766 Rac1 inibidor conhecido. No presente estudo foram investigados os efeitos de inibição destas vias pelos AZA1 na tumorigenicidade da próstata através da realização de estudos pré-clínicos utilizando um modelo de murganho de xenoenxerto de cancro da próstata. Em células de cancro de próstata independente de androgénios, AZA1 inibida tanto Rac1 e Cdc42, mas não a actividade de GTPase RhoA de uma forma dependente da dose e bloqueou a migração e proliferação celular. A expressão da ciclina D1 diminuiu significativamente a inibição Rac1 /Cdc42 em células de câncer de próstata. tratamento AZA1 também PAK e atividade AKT em células de câncer de próstata, associados com a indução da função pró-apoptótica de BAD pela supressão da serina-112 fosforilação regulada para baixo. administração sistémica diária de AZA1 durante 2 semanas reduziu o crescimento de xenoenxertos de tumor da próstata 22Rv1 humanos em ratinhos e melhorou a sobrevivência de animais portadores de tumor significativamente. Estes dados sugerem um papel de AZA1 no bloqueio /progressão Rac1 Cdc42-dependente do ciclo celular, a migração de células de cancro e aumento da apoptose de células de cancro envolvendo a sub-regulação da via de sinalização de AKT e PAK em células de cancro da próstata. Propomos, portanto, que uma terapia com inibidor de pequena molécula alvo vias de sinalização Rac1 /Cdc42 Rho GTPase pode ser usado como um novo tratamento para pacientes com câncer de próstata avançado

Citation:. Zins K, Lucas T, Reichl P, Abraham D, Aharinejad S (2013) a Rac1 /Cdc42 GTPase-Specific pequena molécula inibidora suprime o crescimento da Primária Prostate Cancer Humano xenoenxertos e prolonga a sobrevivência em camundongos. PLoS ONE 8 (9): e74924. doi: 10.1371 /journal.pone.0074924

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 07 de agosto de 2013; Publicação: 11 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zins et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Projeto PRIZE number: Z080347; Áustria Wirtschaftsservice Ges.m.b.H (AWS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a principal causa de câncer e segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens [1]. Apesar de rastreio para o cancro da próstata melhorou, 10-20% dos pacientes serão diagnosticados com doença localmente avançado ou metastático, enquanto outros vão progredir apesar da terapêutica cirurgia, radioterapia e de privação de androgênio [2], [3]. Consequentemente, câncer de próstata avançado continua sendo um problema de saúde significativo e a identificação de novas terapias direcionadas com foco em vias de sinalização molecular são essenciais para melhorar a intervenção terapêutica

.

GTPases Rho, como Rac, Cdc42 e RhoA são proteínas sinalizadoras que regulam organização do citoesqueleto, a progressão do ciclo celular, sobrevivência celular e migração contribuir directamente para o crescimento tumoral e progressão [4]. Cdc42, adicionalmente, desempenha um papel importante no controle da migração celular [5]. GTPases Rho existem formas quer como inativos, ligada a GDP ou, formas GTP-bound ativos que determinam as funções celulares de GTPases Rho [6]. atividade GTPase Rho pode ser afetada pela ativação diferencial de Rho GTPase regulando vias de sinalização ou diferentes quantidades de moléculas reguladoras Rho GTPase tais como Rho GTPase-ativando fatores de câmbio nucleótido guanina (GEFs) [4]. Desregulada GTPases Rho foram descobertos em várias doenças malignas proliferativas, incluindo tumores da próstata [4] e a expressão da proteína Rac é significativamente aumentada no cancro da próstata [7].

GTPases Rho regulam o ciclo celular através da activação de c-Jun N -terminal quinase (JNK) e p38 mitogen-activated proteína quinase (MAPK), levando a sobre-regulação da ciclina D1 [8], [9], [10]. A via de sinalização Rac1 também desempenha um papel significativo na sobrevivência celular envolvendo v-akt timoma murino oncogene virai homólogo 1 (AKT) quinase [11]. AKT, por sua vez fosforila agonista associada ao BCL2 de morte celular (BAD) [12], um membro do pró-apoptótica da família Bcl-2, neutralizando os efeitos pró-apoptóticos de Bad [13]. proteína p21 (Cdc42 /Rac) -activated quinase 1 (PAK1) é uma outra importante efector a jusante de Cdc42 e Rac1 [14], [15] no controlo da morte celular programada [16].

Desde recente estudos têm implicado a actividade aberrante Rac1 e Cdc42 no cancro humano, estas GTPases Rho têm sido propostos como alvos anticancerígenos [17], [18]. Rac1 foi um dos primeiros alvos em abordagens racionais de concepção de drogas e um inibidor de molécula pequena (NSC23766) que interfere com a interacção de Rac1 com vários GEFs foi identificado que a actividade Cdc42 apenas minimamente afectada [19].

Nós interessados ​​em desenvolver mais potente, nova, modificada quimicamente pequenas moléculas para inibir a actividade de GTPase Rho para uma possível aplicação clínica no tratamento do cancro utilizando o inibidor Rac1 NSC23766 como uma estrutura principal para a concepção composto [19]. Nós agora relatam a actividade de AZA1, um novo composto inibidor duplo Rac1 e Cdc42 que retarda o crescimento do cancro da próstata de forma eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata humano e identificação biológica.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Humano células de cancro da próstata independente de androgénios 22Rv1 (CRL-2505), PC-3 (CRL-1435) e DU 145 (HTB-81) foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) e cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, PAA, Pasching, Austria) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS; PAA), M aminoácidos não essenciais 0,1, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As linhas celulares foram testadas quanto à autenticidade utilizando STR-PCR (PowerPlex 16 HS System, Promega, Madison, WI).

geração Composto

Com base na informação estrutural e funcional disponíveis no Rac1-GEF interacção do composto inibidor Rac1 NSC23766 [19] e utilizando uma estratégia de rastreio virtual utilizando a base de dados ZINCO [20], foram geradas 21 quimicamente diferentes potenciais fórmulas composto inibidor da Rac, a qual, em seguida, foram sintetizados por SPECS (Delft, Holanda). Posteriormente, todos os compostos sintetizados foram testados

in vitro

por exame solubilidade, ensaios de activação e ensaios de toxicidade mitocondrial como descrito abaixo.

Rac1, Cdc42 e RhoA ensaios de activação (WST-1)

células cancerosas da próstata foram semeadas em placas de 6 poços e fome durante 24 h. As células foram incubadas com AZA1 inibidor de molécula pequena de 20 uM durante 60 min e depois estimulados com 50 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF; R D systems, Minneapolis, MN) durante 90 seg e actividade Rac1, Cdc42 e RhoA foi então medida com G-LISA (formato colorimétrico, citoesqueleto, Denver, CO) de acordo com o protocolo do fabricante.

visualização da microscopia citoesqueleto de actina e fluorescência

22Rv1 Humano, DU 145 e células PC-3 foram cultivadas em lamela compartimentado em meio de cultura e foram incubadas com 50 ng /ml de EGF 5 e 10 AZA1 uM durante 24 h na ausência de soro. As células foram então fixadas, permeabilizadas, marcado com faloidina Atto 488 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato (DAPI, Invitrogen). A fluorescência foi observada com um Nikon Eclipse 80i (Tóquio, Japão) microscópio equipado com filtros de fluoresceína-isotiocianato (FITC) e DAPI de 1000X de ampliação e as imagens foram digitalmente adquirida.

proliferação celular ensaio

22Rv1 humano, DU 145 e células PC-3 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 células de meio /poço em cultura. As células foram deixados em jejum durante 24 h e em seguida incubadas com ou sem 50 ng /ml de EGF e 2, 5 ou 10 uM AZA1. A proliferação celular foi determinada às 24, 48 e 72 h após o tratamento utilizando o reagente WST-1 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) de acordo com o protocolo do fabricante [21]. Cada experiência foi repetida três vezes.

ensaio de migração

células de cancro da próstata (5 × 10

4 em 1 ml de DMEM com FCS a 10%) foram adicionados à parte superior de cada migração Boyden câmara (8 mícrons, de 12 poços formato de placa; BD Biosciences, Palo Alto, CA). As células foram deixados em jejum durante 24 h e em seguida incubadas com 50 ng /ml de EGF e 2, 5 e 10 uM de AZA1. Após 24 h, o meio foi removido e as membranas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células a partir do lado superior da membrana foram removidos com cotonetes de algodão. As membranas foram excisadas com um bisturi, invertida e transferidas para uma cultura de tecido cheio de PBS bem. As membranas foram então fixadas em metanol durante 10 min a -20 ° C. Após lavagem em PBS, as membranas foram coradas com 1 ug /ml de DAPI em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lavou-se de novo em PBS. As membranas foram então embebidas em Cityfluor (Cityfluor, Leicester, Reino Unido) em lâminas de vidro. setores representativos de células cancerosas da próstata migraram foram contadas sob um microscópio de fluorescência. Cada experiência foi realizada em triplicado.

análise FACS

As células de tumor foram semeadas em placas de 10 cm e deixadas a aderir, antes do tratamento com AZA1. Uma porção de células foi tratado com 10 uM AZA1 durante 24 h, tratadas com tripsina, lavadas com PBS, fixadas em etanol a 70% durante 1 h a 4 ° C, lavadas com PBS e coradas com iodeto de propídio (PI) tampão suplementado com 50 ug /ml DNase-livre com ARNase. foram então determinados diferentes fases do ciclo celular. O restante das células foi tratada com AZA1 10 uM durante 60 min antes da tripsinização e lavagem com PBS e em seguida fixadas com tampão de fixação Cytofix (BD Biosciences) durante 30 min a 37 ° C, lavadas e depois permeabilizadas com tampão de Perm III (BD Biosciences ) e corados com ciclina D1 (de ciclina D1 conjunto anticorpo anti-humano). 10

4 eventos foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) com um laser de árgon sintonizado 488 nm.

Medição de F /g Razão actina

células cancerosas da próstata foram semeadas em placas de 10 cm e fome de 24 h. As células foram incubadas com 50 ng /ml de EGF (R D systems) e 2, 5 ou 10 AZA1 uM durante 24 horas e os níveis de F-actina foram então medidos com o G-actina /F-actina em kit de ensaio in vivo de (citoesqueleto Inc., Denver, CO) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células aderentes foram raspadas e homogeneizado em tampão de lise e estabilização F-actina. as células não rompidas foram removidas por centrifugação a 350xg durante 5 min. F-actina foi então sedimentado por centrifugação a 100.000 xg durante 60 min a 37 ° C. F-actina no pelete e G-actina no sobrenadante foram analisadas por transferência de Western com anticorpo anti-actina. Western blot foram escaneados usando FUSION-FX7 (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, França) e quantificada pela Fusion-CAPT-Software 16,07 (Vilber Lourmat) e a F-actina para libertar G-actina rácio foi calculado. Cada experiência foi realizada em triplicado.

Western blotting

células cancerosas da próstata foram semeadas em placas de 10 cm, fome e tratou-se com 2, 5, e 10 AZA1 uM durante 24 h. Em seguida, as células foram estimuladas com 50 ng /EGF ml durante 90 segundos, foram preparados lisados ​​[22], [23] e 50 ug /pista separados por 12% SDS-PAGE antes da transferência electroforética para Hybond C Super (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire , Reino Unido). As manchas foram sondadas com anticorpos contra fosfo-PAK1 (pS144) /PAK2 (pS141) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfo-AKT (anti-fosfo-AKT pT308 da BD Biosciences) e fosfo-BAD (anti-fosfo -mau Ser112 da Cell Signaling Technology) antes da incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Amersham Pharmacia Biotech). As proteínas foram imunodetectadas por quimioluminescência (Supersignal-West- Femto, Pierce, Rockford, IL), digitalizados usando FUSION-FX7 (Vilber Lourmat) e quantificados por Fusion-CAPT-Software 16,07 (Vilber Lourmat).

modelos de tumor

as experiências realizadas neste estudo foram aprovados pelo Institutional animal Care e do Comitê Use na Universidade de Medicina de Viena (66,009 /0095-II /10b /2008). livre de patógenos, do sexo masculino, 5 semanas de idade atímicos

nu /nu

(nu) ratos (Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram pesados, codificados e divididos em grupos experimentais de forma aleatória. Os ratinhos foram anestesiados (cloridrato de cetamina /xilazina a 55 /7.5 mg /kg i.p.) e 15 × 10

6 22Rv1 células /100 ul de PBS foram injectadas s.c. no flanco esquerdo [23]. Os ratinhos portadores de xenoenxertos de células de cancro da próstata 22Rv1 então recebido diariamente i.p. injecções de 100 ug AZA1 composto em 100 ul de 30% de dimetilsulfóxido (DMSO) a partir de dez dias após a enxertia de células do cancro de duas semanas, os animais de controlo receberam 100 ul de 30% de DMSO (

N

= 10 para cada grupo) . Os volumes tumorais foram calculados por um paquímetro a cada dois dias, usando o x largura fórmula comprimento

2/2. Todos os animais foram sacrificados no dia 24.

Análise dos efeitos do composto AZA1

in vivo

No dia 24, os animais foram sacrificados e os tumores foram separados e pesados. Uma porção de tecido foi processado para inclusão em parafina. secções em série foram embebidos em parafina e re-hidratadas numa série gradual de álcoois e recuperação de antigénios realizadas num forno de microondas em citrato de sódio 0,01 M (pH 6,5). A seguir à incubação em 5% de H

2O

2 para bloquear a actividade da peroxidase endógena, as células em proliferação foram detectados com Ki-67 (antigénio Ki-67 relacionada com a proliferação; MKI67) ensaio de proliferação de anticorpo (de tumor; Dako, Glostrup, Dinamarca ) [22], [23]. Os anticorpos primários foram detectados por incubação sequencial com anticorpos apropriados secundário biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e estreptavidina conjugada com peroxidase (Dako), desenvolvido com 3, 3′-diaminobenzidina (Vector Laboratories), contrastadas com haemalum, desidratadas e montadas em DPX (Merck, Darmstadt, Alemanha) e imagens digitalizadas foram gerados.

Análise dos efeitos do composto sobre a sobrevivência AZA1

O estudo de sobrevivência foi fixada durante três meses. Os ratinhos portadores de xenoenxertos 22Rv1 foram tratados com o composto AZA1 durante 2 semanas (

N

= 10) ou 30% de DMSO (

N

= 10) como descrito acima. Os animais foram sacrificados quando eles estavam moribundos.

A análise estatística

Os dados foram testados para normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk. Os grupos foram comparados por análise não paramétrica de variância (teste de soma classificação ANOVA, Wilcoxon, teste de Kruskal-Wallis). Todos os testes estatísticos foram bilaterais. As curvas de sobrevida global após o tratamento foram analisados ​​pelo teste de sobrevivência de Kaplan-Meier. Os testes estatísticos foram realizados utilizando software SAS (versão 9.1.3) e Enterprise Guide (versão 4.1, SAS Institute Inc., Cary, NC). Os dados são expressos como média ± SD.

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

tratamento AZA1 inibe a atividade Rac1 e Cdc42 em células de câncer de próstata

O

rastreio in vitro

de inibidores de moléculas pequenas baseadas em modificações de NSC23766 dupla para identificar a actividade do composto inibidora identificou a estrutura N * 2 *, * N * 4 -bis- (2-metil-1H-indol-5-il ) -pirimidina-2,4-diamina (AZA1) (Figura 1) ter uma actividade inibidora forte (Texto S1, S1 Tabela, as Figuras S1 e S2). Inicialmente, a activação Rac1 em lisados ​​de células de próstata 22Rv1 após a estimulação com EGF foi examinada nas experiências de rastreio. A activação do receptor de EGF (EGF-R) desempenha um papel fundamental na proliferação e invasão de cancro da próstata e, por conseguinte, constitui um factor patologicamente relevantes para a análise do crescimento do cancro da próstata no modelo 22Rv1 [24]. A actividade de Rac1 foi regulado para cima ao longo do triplo após a estimulação de células de cancro da próstata 22Rv1 com EGF quando comparado com as células não tratadas. O inibidor mais eficaz Rac1 identificado foi AZA1 (Tabela S1). Tratamento de 22Rv1 células de cancro da próstata humano com 5, 10 ou 20 AZA1 uM durante 60 min dependente da dose, reduziu a actividade Rac1 significativamente em 45% (p 0,022), 70,4% (p 0,004) e 85,7% (p 0,002), respectivamente, em comparação com 20 pM NSC23766 (Figura 2A painel da esquerda). AZA1 (20 uM) também significativamente regulada negativamente a actividade Rac1 em DU 145 e PC-3 linhas de células de próstata por 86,8% (p 0,006) e 89,9% (p 0,001), respectivamente (Figura 2A painel da direita). Além disso, AZA1 tratamento de 22Rv1 aos 2, 5, 10 ou 20 uM suprimida actividade Cdc42 por 54%, (P 0,02), 65,4% (p 0,01), 81,6% (p 0,002) e 90,3% (p 0,001), respectivamente (Figura 2B painel da esquerda). AZA1 (20 uM) também significativamente regulada negativamente a actividade Cdc42 na DU 145 e PC-3 linhas de células de próstata por 71,1% (p 0,0015) e 86% (p 0,007), respectivamente (Figura 2B painel da direita). Em contraste, o tratamento AZA1 (20 uM) não causou supressão da actividade de RhoA (Figura 2C). Estes resultados indicam que AZA1 especificamente e significativamente sub-regula a actividade Rac1 e Cdc42 na 22Rv1, DU 145 e PC-3 linhas de células da próstata humana.

(N * 2 *, * N * 4 -bis- ( 2-metil-1H-indol-5-il) pirimidino-2,4-diamina).

a, B Rac1, Cdc42 e C, a activação em RhoA 22Rv1, DU145 e cancro da próstata PC3 células após incubação (60 min) com diferentes concentrações do composto AZA1 e estimulação com 50 ng /ml de EGF. Meio de três experimentos independentes são mostrados. *, Significativamente diferente do EGF.

blocos AZA1 a proliferação de células cancerosas humanas da próstata

Em seguida, analisamos os efeitos da AZA1 sobre a proliferação celular e apoptose em células alvo. O tratamento de células não estimuladas com 22Rv1 AZA1 dependente da dose, reduziu significativamente a proliferação celular após 72 horas de incubação com 2, 5 ou 10 ^ M (p 0,001) AZA1 comparação com células de controlo (Figura 3A, painel esquerdo). Para analisar se AZA1 também pode reduzir a proliferação celular em células estimuladas EGF, que trataram células de câncer de próstata EGF-estimulados com AZA1. O tratamento com 50 ng /ml de EGF aumentou 22Rv1 (p 0,05; Figura 3A, painel da direita), e ligeiramente aumentada DU 145 e PC-3 (Figura S3) proliferação celular. dependente da dose, o tratamento AZA1, significativamente reduziu a proliferação celular após 72 horas de incubação com 2, 5 ou 10 uM (P 0,001) AZA1 comparação com EGF estimuladas e não tratada 22Rv1 (Figura 3A, painel da direita), DU 145 e PC-3 células (Figura S3).

a, densidade relativa de células cancerosas até 72 h após o tratamento com 2, 5, e 10 uM composto em AZA1 não estimulada (painel da esquerda) ou estimulada por EGF (painel da direita) cancro células foi medido usando o ensaio de proliferação celular WST-1. AZA1 suprime a proliferação de células de cancro da próstata 22Rv1 em ambas as células de cancro não estimuladas e estimuladas por EGF de uma maneira dependente da dose. Meio de três experimentos independentes são mostrados. *, Significativamente diferente do controlo (painel esquerdo) e de controlo e células estimulada por EGF (painel da direita); +, Significativamente diferente do controlo (painel da direita) ;. B, o fluxo Representante citometria histogramas que mostram populações de células no sub-G

0 /G

1, G

0 /G

1, S e G

2 /

M fases. 22Rv1 células foram incubadas com 10 uM AZA1 durante 24 h. As células de controlo não recebeu nenhum tratamento. conteúdo em ADN celular foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. C, A expressão da ciclina D1. fluxo representativas citometria de análise e quantificação da intensidade de fluorescência em células tratadas com 22Rv1 AZA1 10 uM durante 60 min (histograma vermelho) em comparação com células não tratadas (linha a negrito) e controlos de isotipo (linha fina). Composto tratamento reduziu os níveis de ciclina D1. *, Significativamente diferente vs. controle.

Em seguida se analisar a distribuição do ciclo celular após o tratamento AZA1. 22Rv1 células foram separadas em sub G

0 /G

1, G

0 /G

1, S e G

2 /M fases. O sub G

0 /G

1 população foi utilizado para estimar a apoptose. A Figura 3B mostra um conjunto representativo de dados a partir de células não tratadas e 22Rv1 AZA1-tratados. 22Rv1 células tratadas com 10 AZA1 uM durante 24 horas mostraram um aumento na sub L

0 /L

1 de fase a partir de 1,47% a 26,9% (± 2,78; P 0,05) e uma diminuição no G

2 /H fases a partir de 32.25% a 20.30% (± 3,56; p 0,05) em células tratadas com 10 pM AZA1, sugerindo a inibição da proliferação celular e um aumento no número de eventos apoptóticos. Em seguida, testaram o efeito de AZA1 sobre a proteína de regulação do ciclo celular da ciclina D1. Em lisados ​​de células tratados com AZA1 10 uM durante 60 min, a ciclina D1 intensidade de fluorescência diminuiu significativamente em 22% ± 4,2% (p 0,001) em comparação com controlos não tratados representado esquematicamente na Figura 3C. Estes resultados indicam um papel para AZA1 no bloqueio Rac1 e Cdc42-dependentes eventos do ciclo celular em 22Rv1 células cancerosas da próstata e indução de apoptose.

AZA1 inibe a migração de células cancerosas

migração ativa de células tumorais é um pré-requisito para a progressão do tumor e metástases e relatórios mostram que a migração de células de cancro induzido pelo EGF pode ser inibida por supressão da Cdc42 /Rac1 vias de sinalização [25]. Assim, examinou-se o efeito de AZA1 sobre a migração de 22Rv1 EGF-estimuladas, DU 145 e PC-3 em células Transwell ensaios. EGF-estimulação aumentou significativamente a migração de células de cancro em 22Rv1 (Figura 4A), DU 145 e células PC-3 (Figura S4A) (p 0,001). O tratamento de células com AZA1 2 uM durante 24 horas reduziu significativamente a migração de células de cancro por 59,6 ± 12% (22Rv1 células; p 0,001; Figura 4A), 56,8 ± 18,8% (células DU 145; p 0,001; Figura S4A) e 57,3 ± 16,1% (3-pc células; p 0,001; Figura S4A). comparação com as células cancerosas estimulada por EGF

a, imagens representativas de células cancerosas da próstata migraram de um

in vitro

migração ensaio são mostrados. 22Rv1 células de cancro da próstata foram estimuladas com 50 ng /ml de EGF e tratou-se com 2, 5 ou 10 uM AZA1 durante 24 h e migrado células cancerosas subsequentemente quantificados em

In vitro

ensaios de migração. Os dados foram coletados a partir de cinco campos consecutivos de vista individuais (40x) de três câmaras de Boyden replicadas. *, Significativamente diferente do controle; +, Significativamente diferente do controlo e células estimulada por EGF. B, efeito do tratamento sobre a formação AZA1 lamelip�ios e filopodia. 22Rv1 células de cancro da próstata foram semeadas em câmaras de cultura de células, estimuladas com 50 ng /mL de EGF e foram incubadas com 5 e 10 um AZA1 durante 24 h. células fixas paraformaldeído foram coradas com Atto-488 phalloidin (F-actina, verde) para detectar citoesqueleto de actina polimerizada, filopódios e lamellipodia e contrastadas com DAPI (azul) e fotografadas (ampliação, x1000). Seta cabeça indica filopódios, seta indica lamellipodia. Os números de filopodia e lamelip�ios por célula foram calculados a partir de 25 células em cada grupo. AZA1 leva a alterações na morfologia celular e suprime a formação de filopódios e lamellipodia. * Significativamente diferente dos controlos; +, Significativamente diferente dos controlos e das células estimulada por EGF; ‡, significativamente diferentes das células estimulada por EGF. Co, de controlo. C, Efeito da AZA1 sobre a dinâmica de actina. As manifestações de actina F e G-actina em 22Rv1, DU 145 e PC-3 células analisadas por imunotransferência (razão de actina F /G-actina). As barras representam a actina F /G valor ± SD dizer. * Significativamente diferente dos controlos da respectiva linha de células; +, Significativamente diferente dos controlos e das células estimulado por EGF da linha de células respectiva.

O tratamento com 2 uM AZA1 também reduziu a migração de células de cancro em todas as três linhas de células, quando comparado com células de controlo sem EGF-estimulação de 40,2 ± 12,1% (22Rv1 células; p 0,01; Figura 4A), 20,2 ± 8,9% (DU 145 células; p 0,04; Figura S4A), e 24,9 ± 16,1% (3-PC células; p 0,05; Figura S4A), respectivamente, em comparação com células de cancro estimulado por EGF

O tratamento de células com 5 uM e 10 uM AZA1 ainda mais reduzida de migração por 72,1% e 79,1% (p . 0,001) em 22Rv1 células, por 72,4% e 91,4% (p 0,001) em 145 células de DU, e por 60,9% e 74,7% (p 0,001) em células PC-3, respectivamente, em comparação com as células estimuladas com EGF (Figuras 4A e Figura S4A). Estes resultados indicam um papel para AZA1 no bloqueio Rac1 e Cdc42-dependente migração de 22Rv1, DU 145 e PC-3 células cancerosas da próstata.

AZA1 reduz lamellipodia e formação de filopódios e diminui o rácio F /G-actina

Cdc42 e Rac1 também são cruciais para a formação de filopodia e lamelip�ios, que são importantes para a invasão de células cancerosas [26]. Por isso, investigamos o efeito da AZA1 na morfologia celular utilizando a coloração phalloidin de 22Rv1, DU 145 e PC-3 células que cora especificamente citoesqueleto de actina polimerizada. Morfologicamente, os números de 22Rv1 lamelip�ios e filopodia aumentou significativamente em EGF-estimulação (p 0,04; Figura 4B). O tratamento com AZA1 aos 5 e 10 uM resultou na lamelip�ios significativamente reduzida (p 0,01) e de filopios (p 0,01) a formação de células de cancro da próstata 22Rv1 após 24 h em comparação com as células estimuladas com EGF (Figura 4B)

Em 145 células DU, enquanto numerosos filopódios são observados que o aumento seguinte EGF-estimulação, quase nenhum lamellipodia são visíveis. Semelhante ao efeito sobre 22Rv1 células, o tratamento com AZA1 aos 5 e 10 mM resultou em reduzido drasticamente a formação filopódios em Du células cancerosas da próstata 145 após 24 h em comparação com células estimuladas por EGF (Figura S4B, superior três painéis). Em células PC-3, ambos lamelip�ios e formação de filopodia ocorreu em células de controlo e estimulada por EGF. A seguir ao tratamento com AZA1 (5 e 10 uM), lamelip�ios foram quase indetectáveis ​​e as células desenvolveram uma morfologia mais redonda. Filopódios ainda foram observados após o tratamento AZA1 5? M, embora foram reduzidos em 10 mM AZA1 (Figura S4B, três painéis inferiores).

Portanto, AZA1 inibida lamellipodia e formação de filopódios em células de câncer de próstata, exibindo diferentes graus de supressão dependendo do tipo de célula cancerosa. Estes dados indicam um efeito regulador directo da actividade Rac1 /Cdc42 na lamelip�ios e extensão filopios em todas as linhas celulares testadas que podem ser afectadas por tratamento AZA1. Juntos, estes dados indicam um papel específico para AZA1 na inibição da morfologia celular Rac1 /Cdc42-mediada.

Em seguida, examinou o conteúdo F- e G-actina em células cancerosas da próstata para determinar se AZA1 pode afetar rearranjo de actina dinâmica . AZA1 lamelip�ios reduzida e a formação de filopodia e migração de células de cancro reduzida. Desde Cdc42 e Rac são conhecidos por desempenhar papéis importantes na reorganização da actina, que é um pré-requisito nesses processos [28], que avaliou o efeito de inibição Rac1 /Cdc42 sobre a relação entre a atividade Rac1 e Cdc42 e reorganização dinâmica do esqueleto de actina. Imunotransferência análises das fracções de F- e G-actina demonstrou que o nível de expressão relativa de F-actina /G-actina foi significativamente maior em 22Rv1, DU 145 e células de cancro de PC-3 da próstata em comparação com células de controlo (p 0,05; Figura 4C). O tratamento com AZA1 aos 2, 5 e 10 uM reduziu significativamente o rácio de expressão relativa de F- a G-actina em todas as três linhas de células depois de 24 h comparadas com as células estimulada por EGF de cancro (p 0,01; Figura 4C) e células de controlo ( p 0,05;.. a Figura 4C)

Estes resultados indicam que lamelip�ios e formação de filopodia em células de cancro da próstata é associado com a reorganização dos filamentos de actina e que este processo é afectado pelo tratamento AZA1

AZA1 down-regula a via de sinalização PAK

quinases Grupo I p21-ativados (PAK) são efetores importantes das pequenas GTPases Rac e Cdc42, que regulam a migração celular, sobrevivência e proliferação [27], [29]. PAK também regulamenta extensão lamellipodia mediada por Rac, migração e invasão das células cancerosas [27]. Para analisar as vias de sinalização que podem mediar os efeitos de inibição Rac1 /Cdc42 AZA1 mediada, foi examinada a actividade de PAK do efector a jusante através da avaliação de fosforilação de PAK em células de cancro estimulado por EGF após o tratamento AZA1. Os dados mostram que PAK1 /2 fosforilação em serina 144/141, que mantém a actividade catalítica de PAKs [30], foi dependente da dose, significativamente reduzida em 46,9 ± 19,1% (2 uM), 55,5 ± 18,4% (5 uM) e 85 ± 14,3% (10 ^ M) (p 0,04) no tratamento AZA1 22Rv1 em células de células estimulada por EGF em comparação (Figura 5). Da mesma forma, PAK1 /2 fosforilação em serina 144/141 foi também dose-dependente e significativamente reduzida até 52,4 ± 15,1% (p 0,05) e 48,1 ± 11,5% (p 0,04), respectivamente, no tratamento AZA1 de EGF-estimuladas DU 145 e PC-3 (Figura células S5), o que indica que Rac1 /CDC42 blocos de inibição da via de sinalização de PAK1 nestas células de cancro da próstata. Os níveis de proteína PAK1 não foram afectados pelo tratamento AZA1 (dados não mostrados). Estes achados sugerem que AZA1 afeta a motilidade celular e reorganização da actina em células de câncer de próstata suprimindo a atividade Rac1 e Cdc42 via PAK1 2 fosforilação /.

Análise de PAK, AKT e maus-fosforilação em células de câncer de próstata 22Rv1 estimulada por EGF após o tratamento AZA1. imagens de Western blot representativos e quantificação de imunotransfer�cias corados com fosfo-PAK1 /2 (pPAK), fosfo-AKT (pAKT) e fosfo-BAD (pBAD) anticorpos antes e após o tratamento com 2, 5 e 10 AZA1 M para 24 h. Rac1 /Cdc42 bloqueio reduz a fosforilação de PAK1, AKT e BAD em células de câncer de próstata 22Rv1 em relação aos controles (médias de 3 experiências independentes). * Significativamente diferente dos controlos não estimulados e não tratadas; +, Significativamente diferente do controlo estimulado por EGF; ‡, significativamente diferente de não estimulados, controlo não tratado e de controlo estimulado por EGF. SP, proteína específica; LC, carregar controle.

AZA1 down-regula a via de sinalização AKT e reduz a fosforilação BAD

A fim de identificar novas Rac1 jusante /candidatos CDC42 afetadas pelo tratamento AZA1, analisamos AKT e actividade MAPK utilizando anticorpos específicos de fosfo. atividades AKT e ERK foram diminuídos pela redução da expressão PAK1 levando à diminuição da proliferação celular, migração /invasão e sobrevivência no cancro do cólon [28]. Além disso, a via de sinalização de AKT tem sido mostrado para ser envolvidos na progressão do cancro da próstata e a transição para a doença independente de androgénios [31].

Verificou-se que a inibição Rac1 /Cdc42 por AZA1 durante 24 h conduziu a uma significativa dependente da dose de inibição dos níveis de fosfo-AKT de 20,8% (2 uM), 39,3% (5 uM) e 62,5% (10 ^ M) (p 0,05) a seguir ao tratamento AZA1 de 22Rv1 células estimulada por EGF (Figura 5). Em contraste, o tratamento AZA1 não causou alterações na fosforilação do potencial Rac1 efectores de ERK, JNK ou p38 (dados não apresentados), indicando que a activação destas vias de MAPK não é afectada pela inibição Rac1 e Cdc42 na 22Rv1 células cancerosas da próstata.