Abstract

O neuroblastoma é o mais comum de câncer sólido cranial extra de infância. Apesar escalada de regimes de tratamento, uma minoria significativa de pacientes morrem de sua doença. Disialoganglioside (GD2) é constantemente expresso em altos níveis em tumores de neuroblastoma, que tenham sido orientadas com algum sucesso, utilizando anticorpos monoclonais terapêuticos. GD2 é também expressa numa variedade de outro tipo de cancro, mas com a excepção de alguns nervos periféricos é largamente ausente de tecidos não transformados. Quimérico Antigen Receptors (CARs) são proteínas do tipo I artificial que enxertam a especificidade de um anticorpo monoclonal para uma célula T. Os dados clínicos com modelos de automóveis primeiros dirigidos contra GD2 têm mostrado alguma promessa em Neuroblastoma. Aqui, descrevemos uma cassete CAR retroviral de metas GD2, que foi otimizado para a persistência de células T CAR, eficácia e segurança

Citation:. Thomas S, Straathof K, Himoudi N, Anderson J, Pule M ( 2016) Um Optimized GD2-Targeting retroviral Cassette for Safer Cellular Therapy mais potentes e de Neuroblastoma e outros cânceres. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10.1371 /journal.pone.0152196

editor: Sophia N. Karagiannis, do Kings College London, Reino Unido

Recebido: 27 Janeiro, 2016; Aceito: 10 de março de 2016; Publicação: 31 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Thomas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o estudo foi financiado pela Sociedade neuroblastoma agora re-rotulado de “neuroblastoma UK”. Este pequeno caridade concedeu uma subvenção de £ 133.000 em 2005 para um projeto intitulado “engenharia genética de células-T para Adoptive imunoterapia de Neuroblastoma”. Martin Pule é suportado pelo NIHR Centro Research UK Biomédica e do Wellcome Trust. John Anderson é suportado pelo Great Ormond Street Hospital, Centro de Investigação Biomédica e Caridade do Hospital Infantil do Great Ormond Street. Karin Straathof é suportado pelo Great Ormond Street Hospital, Centro de Investigação Biomédica e do Wellcome Trust. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. MP recebeu financiamento da investigação contrato de Cellectis. Ele é dono de estoque e recebe salário de contribuição de Autolus Ltd. Ele é um inventor em patentes depositadas pela UCLB e recebeu e pode receber royalties da mesma. Ele recebeu honorários da Roche e Amgen para falar. JA e ST possui estoque de Autolos Ltd. Eles são os inventores de patentes depositadas pela UCLB e pode receber royalties da mesma. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Neuroblastoma é responsável por aproximadamente 15% das mortes por câncer em crianças [1]. Apesar intensificação acentuada do tratamento, a menos de 40% de pacientes de alto risco são sobreviventes a longo prazo, com quimioterapia e radioterapia e resistência final recaídas sendo a indicação de falha do tratamento [2]. Disialoganglioside (GD2), um antigénio de superfície glicolípido que é ubíqua e abundante em células de neuroblastoma, bem como ter expressão específica do cancro em um número de adultos e pediátricos malignidades [3], é um alvo ideal para a imunoterapia [4]. Na verdade, os anticorpos monoclonais anti-GD2 actualmente formar parte de um tratamento padrão para alta neuroblastoma risco, e a sua eficácia e perfil de toxicidade é bem estabelecido [3,5].

Administração de células T específicas do tumor (adoptiva imunoterapia) provou ser um tratamento eficaz do cancro de Epstein Barr linfomas impulsionado-vírus [6] e melanoma [7] com respostas na doença resistentes volumoso. No entanto, não foi possível gerar neuroblastoma específica de células T, utilizando os métodos tradicionais de selecção e expansão. Quimérico Antigen Receptors (CAR) pode ser construído através da ligação da região variável de cadeia única (scFv) a partir de um anticorpo monoclonal para domínios de sinalização intracelular. GD2-alvo CARs, portanto, nos proporcionar um método alternativo de geração de neuroblastoma específica de células T por engenharia genética. terapia CAR GD2 podem resultar em respostas melhorado ao longo terapia mAb, devido a uma persistente e rejeição dinâmica de GD2-expressando tumor.

A fase I estudo clínico da CAR transduzidas células T anti-GD2 em pacientes de neuroblastoma de alto risco recaída relataram alguma eficácia [8]. Uma possível limitação do estudo foi o uso de um primeiro carro geração, fornecendo apenas sinais CD3ζ ITAM, que podem ter resultado em má persistência e expansão. Um crescente corpo de dados clínicos de CD19 carro em malignidades de células B, bem como um estudo duplo-marcação [9] sugerem que os carros que fornecem sinais adicionais de co-estimulação resultar no aumento da persistência e eficácia. Aqui, descrevemos os nossos esforços para construir uma cassete de metas GD2 mais potente, mas seguro para uso contra neuroblastoma, que utiliza uma previamente descrito endodomínio de terceira geração [10]. O foco deste trabalho é a otimização da arquitetura CAR restante e cassete de expressão para eficácia e segurança máxima.

O CAR investigado no estudo relatado por Pule et al usou um scFv derivado de 14-18, um mAb que em uma forma quimérica está atualmente em uso clínico regular. Temos, portanto, utilizado um domínio de direccionamento a partir de uma família de anti-GD2 mAb diferente para evitar anti-idiotipo rejeição /activação de células-T do CAR. Para reduzir a probabilidade de rejeição, uma versão humanizada do CAR foi testado e otimização iterativo da arquitetura CAR foi realizada. A terapia anti-GD2 mAb está associado com neurotoxicidade periférica. Enquanto o estudo inicial CAR GD2 não relatou esse [8], a preocupação permanece como carros cada vez mais potentes são introduzidos na clínica. Em antecipação a esta eventualidade, nós CAR com o gene iCasp9 suicídio [11] co-expressa e otimizado uma cassete retroviral bi-cistrónico para manter a co-expressão e de saída transgene consistente. A construção final foi testado in vivo. Nós têm gerado uma CAR GD2 segmentação cassete retroviral otimizado para eficácia e segurança.

Resultados

CAR com scFv humanizado dá expressão semelhante e aumento da liberação de citocinas e de células T expansão

KM8138 é um anticorpo completamente humanizado monoclonal anti-GD2 construído por enxerto o epitopo de ligação de regiões de determinação de complementaridade (CDR) de murino anti-GD2 anticorpo KM666 para compatível V humano

H e V

regiões G quadro [12]. A sequência scFv humano resultante difere do murino em 31 resíduos nas regiões estruturais fora das CDRs. anticorpo murino scFv utilizados nos automóveis GD2 anteriormente descritos pode ser um alvo para a rejeição imunológica, quer devido ao anti-idiotipo (uma vez que os mAbs terapêuticos em utilização clínica corrente são derivados a partir do mesmo clone), ou de anticorpos anti-ratinho 14,18-derivado. Nós, portanto, derivado de um carro baseado no anticorpo humanizado KM8138 [12]. Para determinar eventuais consequências da utilização de um scFv humanizado, também gerou uma CAR derivado do anticorpo de ratinho parental, assim, geramos um par de anti-GD2 carros idênticos, exceto para os seus scFvs, que foram derivadas de uma murina anti-GD2 mAb KM666, ou KM8138 sua contraparte humanizada [12]. Os carros tinham IgG1 espaçadores de Fc-charneira humanos, o domínio transmembranar CD28 e CD28 endodomínio-OX40-Zeta (Fig 1A). Inicialmente procurou-se comparar a expressão e função deste CAR humanizado (HuK666) com o seu homólogo murino (MuK666). Células T humanas dador normal foram transduzidas com títulos iguais de codificação de vector retroviral para cada receptor. A expressão de superfície de cada carro determinada por citometria de fluxo com um anticorpo policlonal anti-Fc foi idêntico (Figura 1B). Intensidade de fluorescência média (MFI) de células T transduzidas não diferiu entre os carros humanizados e murino. As células T transduzidas foram Em células T de 4 horas do ensaio de libertação de crómio com depleção de CD56 que expressam qualquer carro demonstrou morte comparáveis ​​da linha celular GD2-rolamento Lan-1 neuroblastoma e uma ausência equivalente de actividade contra a linha celular de osteossarcoma A204 que não expressa de GD2. Nem as células não transduzidas T (PD), nem as células T transduzidas com um carro irrelevante dirigido contra CD19 apresentado qualquer citotoxicidade para qualquer uma das linhas de células (Fig 1C) Ambos os receptores foram capazes de estimular a proliferação de células T transduzidas como poços como a secreção de IL2 e IFN-g em resposta a LAN1 mas não A204 (Figura 1D). Não houve diferença significativa entre huK666 e muK666 CARs para a proliferação (Fig 1D), liberação de interferon γ (Fig 1E) ou a interleucina (IL-2) Release 2 (Fig 1F) embora tenha havido uma tendência não significativa para todos os três para o melhoramento função do CAR huK666.

(a) comparação de sequências de aminoácidos de scFv muK666 huK666 e são comparados. As regiões determinantes de complementaridade são mostrados em vermelho. A sequência de ligação é mostrado em verde. Na direita, arquiteturas dos carros gerado para comparação inicial de huK666 com muK666. Ambos diferem apenas nos scFvs usado sendo tanto as sequências muK666 murino original ou a humanizado (CDR enxertadas) huK666. Caso contrário, os RAC compreendem de um IgG1 humano charneira-CH2-CH3 espaçador, um domínio TM derivado de CD28 e um composto compreendendo endodomínio de fusões entre endodomains de CD28, OX40 e CD3-Zeta. (B) Estabilidade do muK666 vs huK666 carros. As células T de 5 dadores foram transduzidas com títulos iguais de codificação sobrenadante retroviral para muK666 ou huK666 carros. CARRO expressão foi detectada por anticorpos policlonais anti-humano-Fc. IMF era idêntica em ambas as construções. Um exemplo representativo é mostrado com NT (verde), muK666 (azul) e huK666 (vermelho) histogramas sobrepostos. Estas células-T CAR foram desafiados com a LAN-1 (uma linha de células de neuroblastoma que expressam GD2) e A204 (uma linha de células de rabdomiossarcoma GD2 que é negativo). A citotoxicidade é mostrado em (c), a proliferação no dia 7 é mostrado em (d), o IFN-γ em (e), e de IL-2 de libertação em (f). Os dados apresentados como médias +/- SEM de 6 experiências independentes, com diferentes doadores.

Spacer composta de resultados de domínio IgG1 Fc em matar e liberação de citocinas ideal

função CAR pode ser influenciada por selecção de domínio espaçador [13-15]. Além do carro baseado-huK666 descrito acima, contendo o IgG1 domínio charneira-CH2-CH3 humanos, como espaçador, foram geradas variantes CAR huK666 adicionais em que a região espaçadora foi composta de charneira sozinha, a dobradiça ligado à haste de CD8a ou a CD8a perseguir sozinho (Fig 2A). A selecção destes espaçadores foi baseada no tamanho consideração, com IgG1-charneira sozinha estar a uma curta espaçador, CD8 haste intermédia e Fc de IgG1 sendo um longo espaçador. Nós também postulou que a haste de CD8 pode não permitir a articulação suficiente do scFv e, portanto, nós geramos um variante adicional com a charneira de IgG1 ligado à haste de CD8. Para permitir uma detecção fácil do carro, com a etiqueta do huK666 com uma tag de HA-amino-terminal, inserido entre o sinal e o péptido-VH. Além disso, para controlar a variação na expressão do vetor, que clonou o foot-and-mouth sequência de doença 2A TAV (2ATaV) no quadro com o carboxi-terminal da CAR, que por sua vez foi clonado no quadro para CD34 truncado (dCD34ngg). Portanto, poderíamos detectar a expressão CAR em relação ao vetor de expressão através da coloração para HA e anti-CD34.

Vários carros huK666 foram clonados em um formato idêntico em que o scFv foi marcado com um HA-tag, eo carro foi co -expressed com uma sequência de febre aftosa-2A truncada com CD34 truncada. A cassete de expressão é mostrada em (a) e animados de estes formatos são mostrados em (b). A co-expressão de CARRO (HA) e o gene marcador de CD34 a partir das diferentes cassetes. As quatro regiões de charneira foram comparados em termos de citotoxicidade (c) (alvo LAN1 = GD2 positiva e A204 = GD2 alvo negativo), a secreção de IFN-γ (d), a IL-2 (e) e proliferação especifica de alvo (F). Os dados apresentados como médias +/- SEM de 4 experiências independentes, com diferentes doadores.

células T humanas primárias foram transduzidas com igual sobrenadante de título entre essas construções e corados com anti-HA e anti-CD34. Uma análise de citometria de fluxo-representativo desta coloração é mostrado na Figura 2B. Dobradiça-CH2-CH3, dobradiça-Stalk e Stalk expressão CARs espaçadores eram idênticas, enquanto o carro espaçador dobradiça-alone resultou em redução HA coloração (Fig 2B). Isso pode ser devido a estabilidade reduzida, ou para a redução do acesso ao HA-tag neste formato. experiências funcionais foram realizados seguinte, e havia diferenças claras nas habilidades das variantes espaçadores para mediar a citotoxicidade, a liberação de citocinas e proliferação em resposta a células Lan-1. PBMC transduzidas com qualquer um dos carros variantes espaçador exibida citotoxicidade em relação às células LAN-1; no entanto, houve diferenças significativas entre eficácia dependendo espaçador. CAR expressando a CH2-CH3 espaçador foram significativamente mais eficaz do que a dobradiça /caule (P = 0,009) e da dobradiça (p = 0,0003), embora a tendência de matar melhorada em comparação com a haste não foi significativa. Nenhum dos carros variantes espaçador mediada qualquer morte de células A204 negativos GD2 (Fig 2C). As diferenças foram também observados na capacidade das outras variantes espaçador para estimular a produção de IFN-γ ou IL-2 a seguir a cultura com células LAN1. CH2CH3 espaçador induziu consistentemente ambas as citocinas, e foi significativamente melhor do que a dobradiça para a produção de IFN-γ (p 0,003, Figura 2D), e significativamente melhor do que a dobradiça /haste (p 0,03) e da dobradiça (p 0,006) para a IL produção -2 (Figura 2E). Com a excepção da variante da dobradiça todos os receptores pareciam comparáveis ​​em termos da sua capacidade para estimular a proliferação celular em resposta a GD2-rolamento LAN1 apesar variação substancial entre os dadores (Figura 2F). As células T que expressam a variante da dobradiça mostraram pouca proliferação detectável, o que é consistente com a capacidade reduzida deste receptor para mediar a libertação de IL-2. No geral a região de IgG Fc parecia ser o espaçador ideal para o carro GD2 e usamos este formato receptor em otimizações posteriores.

Avançado função CAR através da modificação da Spacer

A função normal do CH2 região CH3 da região Fc de imunoglobulinas é a ligação de receptores de Fc em células efectoras imunitárias. O espaçador IgG1 CH2-CH3 humano usado no carro GD2 é o ligando natural para alta afinidade Fc RI (CD64) expressa em efectores inatos, tais como macrófagos e monócitos. Por conseguinte, existe um risco teórico de acoplamento de CARRO expressando células T com as células mielóides por ligação de CD64, resultando em ambos fora toxicidade alvo de células mielóides, e o desvio das células T a partir de CAR a sua função efectora pretendida. De fato, esse fenômeno da CARs contendo espaçadores IgG1 CH2-CH3 foi previamente relatada [16,17]. Os aminoácidos críticos para o reconhecimento de IgG1 residem no domínio CH2 (PELLGG e motivos ISR [18]), e Hombach et ai demonstraram que a substituição destes aminoácidos chave com os aminoácidos correspondentes de IgG2 dentro do contexto do projeto do carro, não tem nenhuma efeito inibitório in vitro de uma segmentação CD30 carro, mas impede fora de lise de células-alvo que expressam CD64 THP1 [16]. Portanto, mutado o PELLGG e resíduos ISR conforme a abordagem de Hombach et al (Fig 3A) e expressão equivalente demonstrada em células T do carro que transportava o CAR mutado (abreviado para PVAA) (Fig 3B). O CAR PVAA mutado mantiveram a função efectora específica antígeno contra células SupT1 modificadas para expressar GD2 em níveis brilhantes (Fig 3C). Enquanto o CAR contendo PVAA lisadas GD2-expressando células LAN1 com eficácia equivalente à do tipo selvagem, o carro PVAA tinha reduzido significativamente off citólise alvo contra CD64 expressar THP1 células (p = 0,0005 Fig 3D). Da mesma forma, enquanto a co-cultura de células T-WT carro com células THP1 resultou em IL1β detectável significativo no sobrenadante de 886pg /mL, esta foi reduzida para valores que não estavam acima do fundo com PVAA contendo CARRO (Figura 3E). Por conseguinte, a incorporação de uma mutação para evitar a ligação de alta afinidade FcyR fora evita a toxicidade alvo pelo GD2-CAR.

(a) sequência de aminoácidos de tipo selvagem (em cima) e mutantes (PVAA) CH2 regiões responsáveis para FcyR vinculativo. (B) fluxo de coloração com anticorpo anti-Fc para mostrar nível comparável de expressão do receptor, com ou sem a mutação PVAA. Carros idênticos com e sem PVAA foram comparadas lado a lado, em termos de citotoxicidade contra GD2 engenharia SupT1 e GD2 tipo selvagem negativo SipT1 células (C), a citotoxicidade contra as células positivas LAN1 GD2 e as células THP-1 positivos FcRγ (d), e IL- libertação 1β em cultura com as células THP-1 (e). Os dados apresentados como médias +/- SEM de 4 experiências independentes, com diferentes doadores.

Optimização de co-expressão com o suicídio gene

Embora fornecendo um poderoso potencial tratamento para o câncer, CAR- as células T têm a capacidade para mediar eventos adversos potencialmente fatais. GD2 segmentação pode levar a-alvo sobre a toxicidade off-tumor causado pelo sistema nervoso central e periférico expressão GD2. Um meio para eliminar selectivamente células-T carro em face de toxicidade inaceitável é desejável. Para alcançar este objectivo, que co-expressa o gene suicida indutível Caspase 9 (iCasp9) [11]. Co-expressão de CAR e iCasp9 estava usando o auto-clivagem FMD-2A como sequência TAV

13. Isso resulta em obrigatório 1: co-expressão 1 de CAR com gene suicida. Como os resultados de expressão retrovirais em uma distribuição normal de intensidade de expressão, uma consideração é a fuga de baixo nível iCasp9 expressando células-T do CAR. Além disso, níveis elevados de iCasp9 basal pode ser tóxico. As células que expressam iCasp9 de baixo nível pode sobreviver ativação do gene suicida, portanto, procurado para alcançar expressão brilhante homogénea de CAR e iCasp9, apesar do fardo da transcrição adicional de que o 1,5 kb iCasp acrescenta ao vector, e para mostrar que iCasp9 não era basally tóxico no Os níveis de expressão alcançados. Nós modificada do vector e grelhas de leitura aberta como se segue: Vector a LTR 3 ‘U3 foi modificado para incluir a cromatina isolador de frango β-globina [19]. A região de ligação ao esqueleto do gene do interferão-β humano foi inserido no 3’UTR [20] (Figura 4A). Nós também gerou construções com ambas as modificações em conjunto, mas títulos foram demasiado baixos para ser útil e não foram testados adicionalmente (dados não mostrados). Além disso, toda a grelha de leitura aberta foi codões optimizados. Finalmente, para assegurar que iCasp9 não resultaram em toxicidade a níveis basais de elevada expressão que gerado um mutante não funcional com o local activo cisteína mutada para serina (Fig 4A). PBMC foram transduzidas com títulos iguais de sobrenadante retroviral para cada receptor, e a expressão foi monitorizada 72 horas pós-transdução por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência média de cada variante fundida com o iCasp9 não funcional é ligeiramente maior do que o correspondente não-optimizado do receptor ligado a uma iCasp9 funcional, sugerindo células que expressam fortemente podem ser perdidos devido a inadequado, a activação não específica do iCasp9 (Fig 4B e 4C)

(a) Nove cassetes de expressão diferentes foram comparadas:. Três diferentes vectores retrovirais foram gerados-SFG de tipo selvagem, com a região de andaime SFG-fixação (SAR) inserido no 3’UTR e SFG com CHS4 inseridos na região LTR 3 ‘U3. (Vetores retrovirais tanto com SAR e CHS4 foram gerados, mas produziu títulos muito baixo vetoriais e não foram comparados mais); Para esses vetores retrovirais de tipo selvagem iCasp9-2A-huK666 construções carro foram inseridos e iCasp9 foram inseridos em 3 formas; codão-optimizada, de tipo selvagem, e com o domínio catalítico mutado. (B) Histogrammes no dia 3 após a transdução (linhas azuis). As células T sobrepostas cultivadas em 20 nM CID são mostrados em vermelho. Bargraphs de IMF de células na ausência de CID no dia 3 (c) e dia (d) 7. Os dados apresentados como médias +/- SEM de 5 experiências independentes com diferentes dadores.

Para avaliar os efeitos das modificações sobre o vector mais períodos prolongados, as CMSPs transduzidas foram então cultivadas durante um total de 7 dias. Ao longo da duração deste período de cultura observou-se diminuição diferencial de níveis de expressão entre os 3 grupos: o não modificada (sem SAR /CHS) e receptores CHS mostrou uma diminuição substancial na MFI-se que vão 22,4-49,5% em comparação com o dia 3 MFI (Fig 4D em comparação com a Figura 4C). Esta diminuição na expressão era esperado e é provavelmente devido à capacidade de resposta do MoMLV LTR ao estado de activação das células T. Após 7 dias de cultura prolongada a MFI de vectores contendo SAR foi significativamente maior do que umodified. Esta diminuição na expressão foi significativamente menos acentuada para os receptores que contêm SAR-(p 0,02 para não codões optimizados; ver Fig 4D), sugerindo que a SAR está a funcionar para evitar a sub-regulação dos carros GD2. O fenómeno de MFI mais baixo no dia 7 em comparação com o Dia 3 se observar igualmente em vectores contendo ou não contendo a mutação C para S, sugerindo que a activação não específica do gene suicida não é responsável para este silenciamento.

Seguindo incubação com CID os níveis de expressão de PBMCs CARRO vivo foi avaliada por citometria de fluxo (Figura 4B). Como esperado os receptores mutantes C-a-S foram refratários ao tratamento CID. Nem códon-otimização, nem a inclusão da sequência influenciado resposta CID SAR, mas a sequência CHS4 parecia resultar em maiores níveis de células T transduzidas escapando tratamento CID (Fig 4B). Escape from ativação do gene suicida parecia ser observada predominantemente o carro-expressadores baixos e este foi consistente com a expressão global inferior observada para receptores CHS4. Embora um número muito pequeno de células T que expressam CAR residuais foram detectadas nos grupos não modificados e SAR seguinte tratamento CID, não é claro se as células retêm expressão CARRO suficiente para exibir actividade.

Por isso, em termos de expressão , a estabilidade e a resposta a CID, o SAR-receptor contendo codões optimizados (iCasp-HuK) tiveram o melhor desempenho e este receptor foi comparado com o CARRO HuK666 original para a sua capacidade para mediar a citotoxicidade e libertação de citoquinas em resposta a células LAN1 (Fig 5 ). PBMC transduzidas foram incubadas durante 72 horas na ausência ou presença de CID 10 nm e em seguida co-cultivadas com células de Lan-1 ou A204. Um exemplo da expressão destes carros na presença e ausência de CID é mostrado na figura 5A. Níveis de expressão HuK666-iCasp9 foram efetivamente eliminadas por indução do iCasp9 (Fig 5A).

A cassete SAR códon-otimizado foi tomada e ainda mais em comparação com a cassete original sem iCasp9. (A) A expressão do CAR não foi alterada. A exaustão é mostrada por FACS após adição de CID. A função de cassetes com e sem iCasp9 foram avaliadas por (b) libertação Killing (c) de IFN-γ e libertação (d) de IL-2. Os dados apresentados como médias +/- SEM de 4 experiências independentes, com diferentes doadores.

PBMC

HuK666-transduzidas apresentaram níveis comparáveis ​​de citotoxicidade e liberação de citocinas em resposta a células LAN1 independentemente da cultura anterior com CID. Na ausência de CID a construção HuK666-iCasp9 realizada, bem como o receptor a que falta o gene suicida. No entanto, um 72-hr de pré-tratamento com CID aboliu a liberação de citocinas por (Fig 5C e 5D) e a citotoxicidade de (Fig 5B) células T expressando HuK-iCasp9.

In vivo

função da cassete iCasp9-CAR

para confirmar que a eficácia e especificidade do gene CAR e suicídio otimizado co-expressa observado in vitro era provável que equivale a eficácia clínica foi avaliada a cassete iCasp9-CAR em um imunocompetentes modelo do rato. O antigénio é um gangliósido GD2 da estrutura química idêntica entre as espécies de modo que o ScFv huK666 ScFv liga GD2 igualmente em células de ratinho e humanas. Temos feito uso da linha celular do cancro do cólon CT26 fracamente imunogénico, que consistentemente faz tumores subcutaneamente em ratinhos Balb /c. células CT26 foram transduzidas com um Gammaretrovirus codificação GD2 e GD3 sintases, e um clone (número 7) com expressão brilhante GD2 foi selecionado para análise do GD2 segmentação pela GD2-CAR em um modelo imunocompetentes (S1 Fig). CT26-clone 7 células induzidas libertação específica de IL-2 e IFN-γ após co-cultura com os esplenócitos transduzidas com GD2-CAR (Fig S2). In vivo, clone 7 derivados de tumores CT26-GD2 foram eficientemente eliminado pelo carro transduzidas esplenócitos em contraste com células CT26 negativos GD2 que cresceram ao mesmo ritmo que os tumores nos ratos tratados com esplenócitos não transduzidas (Fig 6).

camundongos Balb-C foram innocultaed com 1×10

6 CT26 ou célula CT26-GD2 misturados em matrigel. 10 dias após a inoculação do tumor, os ratinhos foram sub-letalmente irradiados a injecção do tumor (200 rads) e, duas semanas pós, os ratinhos foram transplantadas por via intravenosa com um total de 1,5×10

6 esplenócitos transduzidas ou não transduzidas controlos por injecção na veia da cauda. tipo selvagem CT26 foram usados ​​como controles negativos de antígenos (a, c), enquanto que os tumores CT26 -GD2 tratados com células não transduzidas T (b) não regredir, enquanto tumores CT26-GD2 desafiados com células CAR T regrediram. Cada linha representa um mouse.

Discussão

de alto risco neuroblastoma representa um problema clínico sem solução. tumores de neuroblastoma expressam o diasialoganglioside GD2 abundantemente e ubiquamente. GD2 é um dos poucos antígenos de tumor sólido com relativamente pouca expressão em outros tecidos, especificamente a expressão de GD2-baixo nível em nervos periféricos, tornando GD2 um alvo atraente para a terapia CAR. Um estudo de células T início CAR GD2 foi realizado que comparou EBV-CTLs e células T de sangue periférico transduzidas com carros em um mesmo paciente. As respostas foram transitórios e somente a persistência de baixo nível de células T carro foi observada [8].

Uma possível limitação do estudo foi o uso de um receptor de primeira geração [21], que só transmite o sinal imunológica 1 em cima ligadura. Carros de segunda geração têm sido descritos, que também transmitem sinais de co-estimulação [22]. Uma comparação marcação dupla de CARs primeira e segunda geração sugere superioridade deste último [9]. Na verdade um crescente corpo de dados clínicos com os carros de segunda geração visam a terapia de células T CD19 CAR em malignidades de células B confirmou a superioridade de CARs de segunda geração [23,24]. Aqui, nós incorporamos uma endodomínio que transmite dois sinais co-estimuladores, um da superfamília Ig co-receptor da família (CD28) e da família co-receptor da família TNF (OX40).

O aumento da experiência clínica demonstrou que os carros incorporando domínios de ligação derivados a partir de anticorpos de murino pode provocar reações graves em pacientes, que podem contribuir com a depuração aumentada de células T transduzidas e activação CAR com uma toxicidade considerável [25,26]. Esta possibilidade é mais premente na Neuroblastoma: uma vez que a terapia anti-GD2 mAb agora é padrão de atendimento, muitos pacientes terão sido expostos à quimérico 14-18 mAb. Notavelmente estes anticorpos terapêuticos são derivados a partir do mesmo clone que o carro usado por Pule et ai. CARs contendo scFv baseado-14.18 foram recentemente demonstrado para levar a sinalização tónico suficiente para inibir a função de [27]. Assim, procurou-se abordar a possibilidade de ambos anti-idiotipo e anti-rato resposta estrutura pré-formada e induzida pelo CAR. Por conseguinte, utilizado um ligante família diferente, que foi humanizado.

A função do receptor e a selecção correcta do espaçador pode ser importante para a eficácia clínica [13,14,21,28]. Guest et ai têm investigado como a sequência da função de espaçador e CARRO parece estar relacionado com a distância do local de ligação do receptor do antigénio alvo a partir da membrana da célula alvo [13]. Os autores observaram que, no caso de MACN e 5T4, antígenos em que o epitopo CAR está localizado ao lado da membrana, seus carros cognatos necessária a presença de um Fc espaçador para a função ideal. A remoção deste espaçador resultou na diminuição da secreção de citotoxicidade e IFN-γ a partir de células T transduzidas em resposta a células de tumor que expressam os antigénios. O oposto verdadeiro apareceu no caso de CD19 e CEA, ambos os antigénios em que o local de ligação ao carro está mais longe da membrana. CARs dirigidos contra estes dois últimos antigénios exibida reduzida resposta de IFN-γ se que elas continham Fc espaçador, embora citotoxicidade não foi afectada. Hudecek et ai em modelos ROR-1 e CD19 têm sugerido que o comprimento e a flexibilidade de espaçador óptimo é também dependente da localização de um epitopo alvo em relação à superfície da célula [14,28].

Observamos que a alteração do espaçador em nosso carro GD2 resultou em alterações no potencial citotóxico e citocina secreção de PBMC transduzidas. Em geral, o Fc espaçador desde que a resposta óptima, enquanto ambas as variantes do receptor que contêm o talo T CD8 apareceu sub-óptima em termos de citotoxicidade e a libertação de IL-2, embora os PBMC talo-variante transduzidas foram consistentemente observada a secretar maiores níveis de IFN-γ sobre estimulação de PBMC transduzidas com a variante Fc. A falta de correlação entre a citotoxicidade, proliferação e secreção de citoquina para certas construções dos receptores tem sido observado anteriormente [13], [29,30]. níveis de transdução foram consistentemente iguais para todas as variantes do espaçador, a não parecem ser responsáveis ​​pelas diferenças observadas na função, excepto no caso da variante da dobradiça, o qual foi fracamente expresso na superfície celular das células transduzidas, e demonstrou pouca ou nenhuma reactividade contra o tumor células em qualquer um dos parâmetros medidos. Isto pode ser devido ao acesso limitado do anticorpo anti-HA a detecção do marcador de HA no receptor de charneira ou para uma estabilidade diminuída na superfície da célula, embora esta configuração do receptor tem sido observado para ser funcional em outros sistemas [13,21]. Incorporando a região de charneira para a variante talo apareceu negativamente para influenciar a função do receptor e secreção de citocinas melhorados em comparação com somente o talo. Tem sido postulado que a característica fundamental da região espaçadora para determinar a função é a flexibilidade, permitindo que o domínio de ligação para aceder ao antigénio alvo. Uma possibilidade é que a inclusão do segmento de charneira pode diminuir a flexibilidade do receptor e que este pode superar qualquer benefício derivado de um ligeiro aumento no comprimento do receptor.

Em última análise, que seleccionado a variante Fc-espaçador como sendo óptimo nas nossas mãos e levou isso adiante para mais investigação. No entanto, um problema que foi observado com os carros contendo a Fc de IgG é a ligação desta região a receptores Fcy (FcyR) em células do sistema imune inato resultando em inadequado para fora do alvo de activação das células T transduzidas [16,17]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.