Abstract

Os dados Acumulando sugeriu que a expressão funcional de receptores Toll-like (TLR ) em células tumorais foi envolvido em progressão tumoral. O nosso estudo anterior demonstrou que TLR9 sinalização poderia melhorar a progressão do tumor de células de cancro do pulmão humanas in vitro e in vivo. Nós ainda mostraram que miR-574-5p foi a sua maioria sobre-regulada miRNA em células de câncer de pulmão humanos sob TLR9 sinalização por análise de matriz miRNA. Aqui nós caracterizamos o papel potencial do miRNA-574-5p na progressão tumoral aumentada induzida por TLR9 sinalização no cancro do pulmão humano. Nós confirmou que TLR9 sinalização efetivamente elevou a expressão de miR-574-5p em células de câncer de pulmão humano. Notavelmente, verificou-se que a sub-regulação de miARN-574-5p usando inibidor de miR-574-5p in vitro ou miR-574-5p esponja in vivo revogada significativamente a progressão do tumor melhorada induzida por sinalização TLR9. Outros estudos mostraram que miR-574-5p era um jogador importante associado com a progressão do tumor aumentada de células de câncer de pulmão humanos. Notavelmente, identificamos supressor checkpoint 1 (Ches1) como alvo direto dominante para miRNA-574-5p para conferir a TLR9 sinalização progressão do tumor reforçada. Nós revelou que a sobre-expressão de Ches1 inibiu significativamente a entrada do ciclo celular de células de cancro do pulmão humano. Por fim, revelou que a expressão de miR-574-5p foi positivamente correlacionada com TLR9 e inversamente correlacionada com Ches1 em pacientes com câncer de pulmão. Nossas descobertas não só facilitou a compreensão adicional da interferência entre miRNAs e TLRs na biologia do tumor, mas também forneceu novos candidatos potenciais para o tratamento do cancro

Citation:. Li Q, Li X, Guo Z, Xu F, Xia J, Liu Z, et al. (2012) MicroRNA-574-5p foi fundamental para TLR9 Sinalização reforçada a progressão do tumor através de Down-Regulação Checkpoint supressor 1 em Câncer de Pulmão Humano. PLoS ONE 7 (11): e48278. doi: 10.1371 /journal.pone.0048278

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2012; Aceito: 21 de setembro de 2012; Publicação: 02 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Ciência e Tecnologia Departamento de Pudong New Area (PKJ2011-Y33), National Natural Science Foundation da China (81.071.744), Shanghai Pudong New Area líder acadêmico em Sistema Único de Saúde (PWRd2010-01), Programa de Pesquisa básica apoiado pela Comitê de Xangai da Ciência e Tecnologia (11JC1410900) e Qianjiang Projeto Talento da Ciência e Tecnologia Departamento da Província de Zhejiang (2010R10080). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a descoberta de uma série de inatas receptores específicos imunes ativadas por padrões moleculares associados a patógenos levou a uma nova compreensão dos mecanismos da imunidade inata. Entre os receptores específicos de imunidade inata, os são os receptores melhor caracterizadas semelhantes a Toll (TLRs) que reconhecem uma variedade de padrões moleculares associados a agentes patogénicos, são expressos principalmente nas células do sistema imunológico e desempenham um papel importante na inata e adaptativa imunidade [ ,,,0],1] – [3]. Curiosamente, um corpo crescente de literatura demonstraram que TLR funcionais foram também amplamente expressos numa variedade de células tumorais, incluindo da mama, cérebro, gástrico e células de cancro do pulmão [4]. Acumulando dados mostraram que TLRs agonista poderia promover a invasão e aumentar o potencial metastático de células tumorais, indicando que a activação dos TLRs sinalização nas células tumorais estava envolvido no progresso do tumor [5] – [8]. O nosso estudo anterior demonstrou que oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODNs), que estavam sob investigação como adjuvante na terapia contra infecções e cancros, de forma eficaz pode activar a via de sinalização de TLR9 em células de cancro de pulmão humano e, assim, promover a progressão de tumor tanto in vitro como in vivo [ ,,,0],3], [4], [9] – [11]. Nós adicional mostrou que a sobre-regulação de quinase dependente de ciclina 2 (CDK2) foi crítico para TLR9 sinalização para estimular a proliferação e a entrada do ciclo celular de células de cancro do pulmão humano [4]. No entanto, os mecanismos precisos de como a sinalização TLR9 estava envolvido na progressão tumoral do câncer de pulmão humano ainda eram muito menos clara.

Os microRNAs (miRNAs) surgiram como uma grande classe de reguladores de expressão gênica, pós-transcricional gene que regula expressão através de emparelhamento de base a parcialmente locais complementares para evitar a acumulação de proteínas através da repressão de tradução ou por indução de degradação do mRNA, ligada à maioria das funções biológicas, incluindo a biologia do tumor [12], [13]. Dados acumulando sugeriu que miRNAs foram biomarcadores eficazes e inovadoras para diagnóstico de câncer de pulmão, previsão e tratamento [14], [15]. Enquanto isso, miARNs também foram implicados na regulação dos efeitos biológicos dos TLRs sinalização [16] – [18]. Para investigar o papel potencial de miARNs na progressão do tumor aumentou de células de cancro do pulmão humano por estimulação agonista TLR9, foi realizada miARN ensaio microarrays para detectar o perfil de miARN expressão em 95D células com ou sem tratamento de CpG ODN, e descobriram que CpG ODN estimulação alternado o perfil de expressão de miARN no 95D células e a diferença de expressões de 23 miARNs entre o grupo tratado com CpG ODN e grupo não tratado foi de, pelo menos, duas vezes, entre os quais miARN-574-5p foi principalmente a sobre-regulada em miARN CpG ODN 95D células estimuladas em comparação com o que o grupo não tratado [19]. No entanto, o possível efeito de miRNA-574-5p na progressão do tumor reforçada induzida pela sinalização TLR9 ainda continua a ser elucidado.

Para resolver esse problema, aqui nós caracterizado o efeito de miRNA-574-5p que foi -regulada sob TLR9 de sinalização em células de câncer de pulmão humano. Descobrimos que miRNA-574-5p foi fundamental para TLR9 sinalização para aumentar a progressão do tumor de células de câncer de pulmão humano. Outros estudos mostraram que o supressor de checkpoint 1 (Ches1) era um alvo direto dominante para miRNA-574-5p para conferir a TLR9 sinalização progressão do tumor reforçada. Estes resultados estendida estudos anteriores e proporciona um novo discernimento na compreensão de miARNs na expressão funcional de TLR9 em células tumorais.

95D células (A) foram tratadas com 10 ug /ml de ODN de CpG ou controlo CpG ODN durante o tempo indicado e detectada durante a sua proliferação. (B) grupos de oito ratos nus foram desafiados com 2 x 10

6 de 95D células. Cinco dias mais tarde, o tumor foram injectados ratinhos portadores in situ com 100 ug de CpG ODN em intervalos de 7 dias. O grupo controle recebeu igual dose de controle CpG ODN ou o volume igual de meio. Determinou-se o tamanho do tumor. Cada barra representa a média (± DP) de oito ratinhos nus em cada grupo. (C) 95D células foram tratadas com a dose indicada de CpG ODN durante 72 h e depois ensaiadas quanto à sua expressão de miR-574-5p. (D) 95D células foram tratadas com 10 ug /ml de ODN CpG durante o tempo indicado e ensaiadas quanto à sua expressão de miR-574-5p. 95D células (E) foram tratadas com 10 ug /ml de ODN de CpG na presença da dose indicada de cloroquina durante 72 h e depois ensaiadas quanto à sua expressão de miR-574-5p. (F) 95D células foram tratadas com 10 ug /ml de ODN de CpG, na presença de a dose indicada de péptido MyD88 inibidora (Pepinh-MyD88) ou o péptido de controlo (Pepinh-controlo) durante 72 h e depois ensaiadas quanto à sua expressão de miR -574-5p. As barras de erro indicam o desvio padrão das medições em triplicado a partir de três experimentos independentes.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os pacientes deste estudo foram dados consentimento informado por escrito, eo estudo humano foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Tongji (número de autorização: 20090128). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Medicina Animais de Laboratório e com a aprovação ética de Shanghai Medical Laboratory Animal Care e do Comitê Use, bem como o Comitê de Ética da Universidade de Tongji (Permit número: 20110016).

95D células (a) foram transfectadas com o inibidor de miR-574-5p durante 48 h e depois ensaiadas quanto à sua expressão de miR-574-5p. (B) 95D células foram transfectadas com o inibidor de miR-574-5p ou o controlo, respectivamente, e em seguida estimuladas com 10 ng /ml de ODN CpG durante o tempo indicado. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado formar três experiências independentes. (C) aumento da atividade de repórter miR-574-5p regulamentado foi alcançado por infecção de células 95D com a esponja miR-574-5p. Grupos de oito ratinhos nus (D e E) foram desafiados com 2 × 10

6 95D de células que foram estavelmente transfectadas com o vector de esponja de miR-574-5p ou o vector de controlo. Cinco dias mais tarde, o tumor foram injectados ratinhos portadores in situ com 100 ug de CpG ODN em intervalos de 7 dias. Determinou-se o tamanho do tumor e o tempo de sobrevivência de ratinhos portadores de tumor. Cada barra representa a média (± DP) de oito ratinhos nus em cada grupo. * P . 0,05

Os pacientes

Entre junho de 2009 e março de 2012, foram coletadas amostras de tumores de pacientes com câncer de pulmão no Hospital Leste, Xangai, China. O grupo de estudo (n = 23) de quimioterapia composta e radioterapia doentes não tratados previamente com câncer de pulmão. Revisão de relatórios de patologia confirmou o diagnóstico. Os indivíduos com doenças auto-imunes (por exemplo artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico), infecções crónicas (por exemplo, infecção por vírus da imunodeficiência humana, tuberculose), o envolvimento da medula óssea, anticoagulante e antitrombótico usando, ou os que receberam terapia imunossupressora foram excluídos. As informações sobre as características patológicas clínicas de pacientes foi resumido na Tabela 1.

95D células (A) foram transfectadas com imita o miR-574-5p ou o controlo, respectivamente, e, em seguida, ensaiadas para a sua proliferação na hora indicada. (B) 95D células foram transfectadas com o inibidor de miR-574-5p ou o controlo, respectivamente, e, em seguida, ensaiadas para a sua proliferação na hora indicada. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado formar três experiências independentes. (C-M) Grupos de oito ratinhos nus foram desafiados com 2 × 10

6 95D de células que foram estavelmente transfectadas com o miR-574-5p vector de expressão ou vector de esponja de miR-574-5p respectivamente, e, em seguida, ensaiadas para a sua a progressão do tumor em ratinhos nus na hora indicada. Determinou-se também o tempo de sobrevivência de ratinhos portadores de tumor. Cada barra representa a média (± SD) de oito ratinhos nus em cada grupo.

Ratos

fêmea BALB /c ratinhos nus entre 6 e 8 semanas de idade foram adquiridos a partir da centro de Animais experimentais da Universidade de Tongji. Todos os ratinhos foram alojados numa colónia de rato isento de agentes patogénicos na instituição.

95D células (A) foram transfectadas com o inibidor de miR-574-5p durante 48 h e, em seguida, ensaiadas para a expressão dos genes indicados usando o Real PCR em tempo. (B) 95D células foram transfectadas com o inibidor de miR-574-5p durante 48 h e depois ensaiadas quanto à sua expressão de Ches1 utilizando Western blot. A intensidade relativa do nível de proteína Ches1 a partir de três experiências independentes foi mostrado. (C) 95D células foram co-transfectadas com imita o miR-574-5p e um repórter da luciferase contendo ‘UTR ou mutado Ches1 3’ do tipo largo Ches1 3 UTR. (D) 95D células foram trasnfected com Ches1 vector de expressão durante 48 h e, em seguida, ensaiadas para a expressão do nível de proteína Ches1. (E) 95D células foram co-transfectadas com imita o miR-574-5p e vector de expressão Ches1, e, em seguida, ensaiadas para a sua proliferação. (F) grupos de oito ratos nus foram desafiados com 2 x 10

6 de 95D células que foram estavelmente transfectadas com vector de expressão de miR-574-5p além de vector de expressão de Ches1 ou seu controle, e depois testadas para a sua progressão do tumor na tempo indicado. (G) 95D células foram transfectadas com o vector de expressão Ches1, e em seguida estimuladas com 10 ug /ml de ODN CpG durante o tempo indicado. (H) grupos de oito ratos nus foram desafiados com 2 x 10

6 de 95D células que foram estavelmente transfectadas com vector de expressão de Ches1 ou o vector de controlo. Cinco dias mais tarde, o tumor foram injectados ratinhos portadores in situ com 100 ug de CpG ODN em intervalos de 7 dias. O tamanho do tumor foi determinado no tempo indicado. Cada barra representa a média (± SD) de oito ratinhos nus em cada grupo.

Reagentes e Linha celular

CpG ODN2216, controlar CpG ODN, cloroquina e do peptídeo inibidor contra MyD88 foram adquiridos a partir de Invivogen. imita miR-574-5p e inibidor de miR-574-5p foram adquiridos de Ribobio (Guangzhou, China). kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC foi comprado de eBioscience. ciclo celular kit determinação fase foi comprado de Cayman. O kit de Nucleofector foi comprado de Amaxa. A linha celular humana do cancro do pulmão 95D células foi obtida a partir de ATCC e mantidas a 37 ° C sob 5% de CO

2 em completa meio RPMI 1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal inactivado por calor suplementado com glutamina 2 mM, 100 UI /ml de penicilina e 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina.

(a) 95D células foram transfectadas com o vector de expressão Ches1 e ensaiadas para a sua proliferação na hora indicada. (B) grupos de oito ratos nus foram desafiados com 2 x 10

6 de 95D células que foram estavelmente transfectadas com vector de expressão de Ches1 ou o vector de controlo. O tamanho do tumor foi determinado no tempo indicado. Cada barra representa a média (± DP) de oito ratinhos nus em cada grupo. (C e D) 95D células que foram transfectadas estavelmente com Ches1 vector de expressão foram sincronizadas primeiro na fase G0 através da substituição do meio de cultura com meio isento de soro durante 24 horas, e detectada pela sua apoptose utilizando anexina V coloração e do ciclo celular utilizando o ciclo celular kit determinação fase por citometria de fluxo. 95D células (E) foram transfectadas com vector de expressão Ches1 e ensaiadas para o seu nível de proteína CDK2 48 h mais tarde. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado a partir de três experiências independentes * p .. 0,05

Ensaio MTT

95D células foram semeadas a 3 x 10

3 células de cada poço e incubadas na presença ou ausência de ODN CpG (10 ug /ml) em placas de 96 poços durante 72 h. A avaliação da proliferação celular foi medida utilizando o kit de proliferação de células comercialmente MTT (Cayman) de acordo com as instruções do fabricante.

(A) TLR9 Relativa, miR-574-5p e expressão Ches1 foram determinadas por PCR em tempo real em 23 NSCLC amostras de câncer de pulmão. Cada barra representa a proporção relativa destes genes em tecido de cancro do pulmão contra o tecido adjacente. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado formar três experiências independentes. (B-D) As análises de correlação entre a expressão de TLR9 e miR-574-5p, miR-574 e Ches1, bem como TLR9 e Ches1, foram realizados. Cada ponto representado os resultados de um paciente.

-PCR em tempo real

quantitativo em tempo real de RT-PCR foi realizada como previamente descrito [20]. Todos os iniciadores e sondas foram obtidos de Applied Biosystems. O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol. Sintetizou-se ADNc com o kit de reagentes PrimeScript RT (Takara). RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) Foram realizadas análises para detectar a expressão de mRNA utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara), e β-actina foi utilizado como um controlo interno. ensaios TaqMan micro-RNA (Applied Biosystems) foram usadas para quantitativa dos níveis de maturidade miR-574-5p expressão e RNA nuclear pequeno U6 foi usada como um controlo interno.

Western Blot

As células foram lisadas com M-PER de Proteína Reagente de Extracção (Pierce), suplementado com um cocktail inibidor de protease. Citoplasmática e extractos nucleares foram preparados utilizando NE-PER Citoplasmáticas de extracção Reagentes (Pierce) e Nucleares. Após centrifugação a 13000 g com menos de 4 ° C durante 15 minutos, os sobrenadantes foram recolhidos, e a concentração de proteína dos extractos foi medido pelo BCA Protein Assay (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte microgramas de proteína foram carregadas em géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos durante 90 minutos a 100 V para membranas de fluoreto de polivinilideno, utilizando um sistema de transferência húmida. As membranas foram lavadas em leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com fosfato mais 0,05% de Tween 20 (PBST), durante 2 h, de modo a bloquear locais de ligação de proteína não específica na membrana. A imunotransferência foi realizada utilizando anticorpos monoclonais para Ches1 e CDK2 (Sigma e celular tecnologia de sinalização) a uma diluição de leite magro 1:1000 em tampão Tris. A membrana foi então lavada em PBST, sondadas com um anticorpo anti-coelho secundário conjugado com peroxidase de rábano (Amersham Life Sciences) a uma diluição de 1:5000, desenvolvida utilizando um estojo ECL Western Blotting (Pierce), e expostos a raios-X filme (Kodak)

Construção do plasmídeo

a sobre-expressão ou a inibição de miR-miR-574-5p Retrovirus-mediada foi gerado com base na pMX vector (Invitrogen) como descrito anteriormente [21] -. [ ,,,0],23]. Resumidamente, o vector de expressão de miR-574-5p foi construído por ligação de fragmentos EcoRI /Xhol de reacção em cadeia da polimerase (PCR) com o vector retroviral pMX-puro. Retroviral miR-574-5p vector “esponja” foi construído utilizando ligação de duas cópias de oligos complementares miR-574-5p e vector PMX-puro. Sequência que codifica mutante miR-574-5p foi clonado no mesmo vector e utilizadas como o vector de controlo. O vírus foi produzido e células alvo foram infectadas de acordo com o manual do utilizador. Geração de Ches1 plasmídeo de comprimento completo foi realizada como previamente descrito [24].

Luciferase Reporter Assay e mutagénese

O repórter luciferase e ensaio de mutagénese foram realizados como previamente descrito [20]. imita miR-574-5p ou o seu controlo foi co-transfectado em células 95D com um único plasmídeo relatório (PMIR-Reportar plasmídeo; Ambion) contendo ou o de tipo selvagem ou mutados UTR 3 ‘de Ches1 que foi gerado usando Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Após 48 horas da transfecção, as actividades da luciferase de pirilampo e Renilla foram determinados utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega).

A avaliação do crescimento do tumor in vivo

A avaliação do crescimento do tumor foi realizado tal como descrito anteriormente com pequenas modificações [3]. Resumidamente, ratinhos BALB /c nu /nu ratinhos (6-8 semanas de idade) foram injectados por via subcutânea com 0,2 ml de uma suspensão de uma única célula contendo 2 × 10

6 células tumorais e mantidos em câmaras de fluxo laminar em condições específicas isentas de patogénios . Os tumores foram medidos a cada 5 dias após a inoculação do tumor utilizando paquímetros. Os volumes dos tumores foram obtidos multiplicando o comprimento medido pela largura medida pela média calculada destes valores medidos e foram apresentados como a média ± SEM.

Análises Estatísticas

análises

estatística dos dados eram realizada com o auxílio de programas de análise de software SPSS12.0. A avaliação estatística foi realizada através de análise de duas vias de variância (ANOVA, p 0,05). utilizando o programa Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA)

Resultados

TLR9 sinalização Up-regulou a expressão de miR-574-5p no pulmão células cancerosas humanas

em primeiro lugar, confirmou a progressão do tumor melhorada do cancro do pulmão humano induzida por sinalização de TLR9, e descobriram que o tratamento CpG ODNs de 95D células significativamente aumentada a sua proliferação in vitro e a progressão do tumor in vivo (Figura 1A e B, P 0,05). Para elucidar o potencial papel de miR-574-5p nos efeitos de sinalização de TLR9 sobre a progressão de células de cancro do pulmão humanas, que validou a plataforma de microarray anterior e avaliada a expressão de miR-574-5p 95D em células com ou sem CpG ODN tratamento por análise de PCR em tempo real. Nós revelou que a expressão de miR-574-5p foi de facto significativamente elevados em células 95D após o tratamento de CpG ODN em uma maneira dependente da dose e do tempo (Figura 1C e D, P 0,05). Para confirmar ainda mais que era TLR9 /MyD88 sinalização que conferiu a expressão regulada para cima de miR-574-5p, a cloroquina inibidor de sinalização de TLR9 e peptídeo inibidor MyD88 foram aplicadas para bloquear a sua via de sinalização. Descobrimos que tanto a cloroquina e o péptido inibitório MyD88 pode revogar significativamente a expressão elevada de miR-574-5p induzida por CpG ODN em células 95D de uma forma dependente da dose (Figura 1E e F, P 0,05). Nossos resultados demonstraram fortemente que TLR9 sinalização efetivamente elevou a expressão de miR-574-5p em células de câncer de pulmão humano.

A regulação de miR-574-5p revogou a progressão do tumor avançado induzida por TLR9 Sinalização na Pulmão humano cancro

Para elucidar o potencial papel de miR-574-5p na progressão tumoral aumentada de cancro do pulmão humano induzida por sinalização TLR9, 95D células foram transfectadas com o miR-574-5p inibidor e em seguida estimuladas com CpG ODN. Como mostrado na Figura 2A, observou-se que a transfecção com o inibidor de miR-574-5p eficazmente reduzida a sua expressão em células 95D (p 0,05). Notavelmente, mostramos que a transfecção com o inibidor de miR-574-5p inibiu significativamente a proliferação de células 95D induzida por CpG ODN (Figura 2B, p 0,5). Para confirmar ainda mais esse fenômeno in vivo, esponja de miR-574-5p foi construído para regular negativamente a expressão de miR-574-5p. O nível de knockdown funcional de miR-574-5p foi ensaiada por um ensaio de repórter, em que o local de miR-574-5p de ligação prevista foi introduzido na UTR 3 ‘de um repórter de luciferase. Verificou-se que a transfecção de células 95D com a esponja de miR-574-5p provocou um aumento significativo na actividade da luciferase comparado com a esponja de controlo (Figura 2C, p 0,05), sugerindo que foi alcançada a inibição eficaz da actividade de miR-574-5p. Assim, os grupos de ratinhos nus foram inoculados com células 95D que expressa estavelmente esponja miR-574-5p, e em seguida estimuladas com CpG ODN. É de notar, que mostrou que a sub-regulação de miR-574-5p 95D em células inibiu significativamente a sua progressão aumentada induzida por sinalização TLR9 in vivo (Figura 2D, p 0,05). Consistentemente, verificou-se que a sub-regulação de miR-574-5p também prolongou significativamente o tempo de sobrevivência de ratinhos nus portadores de tumor (Figura 2E,

P

0,05). Combinando estes dados sugerem que miR-574-5p conferido o efeito de TLR9 sinalização na progressão do tumor de células de câncer de pulmão humano.

Mir-574-5p Promovido a progressão do tumor de células de câncer de pulmão humano

Para caracterizar o mecanismo subjacente ao papel central do miR-574-5p em progressão tumoral melhorada induzida por sinalização TLR9, avaliou-se ainda mais o efeito directo de miR-574-5p sobre o crescimento de células 95D in vitro e in vivo. Como mostrado na Figura 3A, verificou-se que a sobre-expressão de miR-574-5p 95D em células resultou em elevada a sua proliferação in vitro (p 0,05). Consistentemente, a expressão reduzida de miR-574-5p 95D em células deficientes a sua proliferação in vitro (Figura 3B, p 0,05). Para confirmar ainda mais estes resultados in vivo, os ratinhos nus foram inoculados com células 95D que foram estavelmente transfectadas com o miR-574-5p vector de expressão ou vector de esponja de miR-574-5p respectivamente. Descobrimos que sobre-expressa o miR-574-5p aumentou significativamente a progressão do tumor de células 95D in vivo, acompanhado por um tempo de sobrevivência reduzida de ratinhos com tumor (Figura 3C e D, P 0,05). Consistentemente, a sub-regulação de miR-574-5p 95D em células revogada seu crescimento in vivo e prolongou o tempo de sobrevivência de ratinhos portadores de tumor (Figura 3E e F, P 0,05). Estes resultados sugerem que miR-574-5p foi um fator importante associado com a progressão do tumor avançado de câncer de pulmão humano.

Ches1 era um alvo direto de miR-574-5p para promover a progressão do tumor do cancro do pulmão humano

Para entender melhor o efeito de miR-574-5p na regulação da progressão do tumor de células de câncer de pulmão humanos, previmos os alvos de miR-574-5p por programas de previsão, incluindo TargetScan e Miranda, e selecionou 10 possível alvo incluindo CALCOCO1, RFX4, CD96, CHEX1, FOXI2, DGKG, ZNF589, ZDHHC14, CCDC88C, CLVS1 para análise de PCR em tempo real. Descobrimos que a expressão de Ches1 exibiu um alçado dramaticamente em 95D células transfectadas com o inibidor de miR-574-5p (Figura 4A, p 0,05). Para confirmar este resultado, realizamos western blot para detectar a expressão de Ches1 em 95D células transfectadas com inibidor de miR-574-5p. Verificou-se que o nível de proteína de Ches1 foi significativamente aumentada pela transfecção com inibidor de miR-574-5p 95D em células (Figura 4B, p 0,05). Em seguida, realizado um ensaio de repórter de luciferase para validar o potencial relação regulatória. Foi observado um efeito negativo significativo sobre a actividade da luciferase sobre a UTR 3 ‘de Ches1 na presença de miR-574-5p, tais repressão desapareceu quando o local de destino previsto na UTR 3’ de Ches1 foi mutado (Figura 4C, p 0,05 ). Para detectar ainda mais o papel potencial de Ches1 em TLR9 sinalização crescimento aumentado das células 95D, 95D células foram transfectadas com Ches1 vector de expressão e em seguida estimuladas com CpG ODN. Como mostrado na Figura 4D, verificou-se que a transfecção com o vector de expressão Ches1 aumentou significativamente a sua expressão em células 95D (p 0,05). Notavelmente, verificou-se que a transfecção de imita o miR-574-5p não conseguiu aumentar a proliferação de células 95D que foram co-transfectadas com o vector de expressão Ches1 (Figura 4E, p 0,05). Nós adicional mostrou que a transfecção com o vector de expressão Ches1 eficazmente o tumor revogada efeito promotor de miR-574-5p in vivo (Figura 4F, p 0,05). Além disso, revelou que a sobre-regulação de Ches1 inibiu eficazmente a sinalização de TLR9 promoveu a proliferação de células 95D (Figura 4G, p 0,05). Consistentemente, verificou-se que a sobre-expressão de Ches1 95D em células deficientes eficazmente a sua progressão tumoral melhorada induzida por sinalização TLR9 em ratinhos nus (Figura 4H, p 0,05). Estes resultados indicaram que Ches1 era um alvo de boa fé de miR-574-5p na regulação TLR9 sinalização progressão tumoral melhorada do cancro do pulmão humano.

Sobre-expressão de Ches1 Entrada Ciclo Celular inibido de células de câncer de pulmão humano

para elucidar o potencial papel de Ches1 na progressão do tumor de células de cancro do pulmão humanas, 95D células estavelmente transf ectadas com vector de expressão Ches1 foram detectados para a sua proliferação in vitro e a progressão em ratinhos nus in vivo. Mostrámos que a sobre-expressão de Ches1 inibiu significativamente a proliferação de células 95D (Figura 5A, p 0,05). Consistentemente, verificou-se que a progressão do tumor de 95D células transfectadas com vector de expressão Ches1 foi drasticamente melhorada do que o grupo de controlo (Figura 5B, p 0,05). Estes resultados sugeriram que era um jogador Ches1 inibidora no crescimento de células de cancro do pulmão humano. Para caracterizar ainda mais o mecanismo subjacente, analisamos o possível efeito de Ches1 na apoptose e ciclo celular de células de câncer de pulmão humanos. 95D células estavelmente transfectadas com o vector de expressão Ches1 ou o vector de controlo foram sincronizadas primeiro na fase G0 através da substituição do meio de cultura com meio isento de soro, e, em seguida, continuamente cultivadas e colhidas após 24 horas. Descobrimos que a taxa de apoptose de 95D células transfectadas com vector de expressão de Ches1 era baixa e geralmente comparáveis ​​com o grupo controle (Figura 5C). Em contraste, a percentagem de células 95D transfectadas com vector Ches1 expresson na fase Go /G1 foi significativamente mais elevada do que aqueles do grupo de controlo (Figura 5D, p 0,05). Além disso, também revelou que a redução da expressão de CDK2 em 95D células após a transfecção com Ches1 vector de expressão (Figura 5E, p 0,05), o que poderia explicar em parte os nossos resultados e era consistente com o nosso estudo anterior demonstra que a sobre-regulação de CDK2 foi crítico para TLR9 sinalização para estimular a entrada de proliferação e ciclo celular de células de câncer de pulmão humanos [4].

a expressão de miR-574-5p foi positivamente correlacionada com TLR9 e Inversamente correlacionada com Ches1 em clínicas pacientes com câncer pulmonar

Para investigar ainda mais o papel potencial de miR-574-5p no efeito de sinalização de TLR9 em doentes com cancro de pulmão humano, foram detectados a relação entre a expressão de miR-574-5p e TLR9 em doentes com NSCLC clínicos. Como mostrado na Figura 6A, os níveis de TLR9 e miR-574-5p expressão foram mais elevados no tecido do cancro do pulmão em comparação com o tecido adjacente de tumor a partir de amostras clínicas de cancro do pulmão (p 0,05). Em contraste, a expressão de Ches1 foi significativamente menor em tecidos tumorais em comparação com tecidos adjacentes (Figura 6A, p 0,05). Mais importante, verificou-se que o nível de expressão de miR-574-5p foi positivamente correlacionada com a expressão de TLR9 em tecidos tumorais clínicos (Figura 6B, p 0,05). Além disso, revelou que a expressão de miR-574-5p foi inversamente correlacionado com o nível de expressão de Ches1 nos tecidos de tumor (Figura 6C, p 0,05). Além disso, a expressão de TLR9 foi também inversamente correlacionado com o nível de expressão de Ches1 nos tecidos de tumor (Figura 6D, p 0,05). Esses achados estão de acordo com os nossos dados anteriores que demonstraram que Ches1 era um alvo predominante para miR-574-5p para conferir a progressão do tumor reforçada induzida por TLR9 sinalização no cancro do pulmão humano.

Discussão

nos últimos anos, os dados sugerem que se acumulam TLRs foram funcional expresso em células tumorais e envolvidos em progressão tumoral [4] – [8]. Nós anteriormente demonstrado que a sinalização de TLR9 poderia melhorar a progressão do tumor de células de cancro do pulmão humanas in vitro e in vivo [3], [4], [9] – [11]. Aqui nós estendemos o nosso estudo anterior, demonstrando que a regulação positiva de miR-574-5p conferiu a progressão do tumor melhorada induzida por TLR9 sinalização em células de câncer de pulmão humano. Nossos achados sugerem que miR-574-5p era um jogador importante na TLR9 de sinalização e biologia do tumor.

No presente estudo, verificou-se que TLR9 sinalização significativamente elevados a expressão de miR-574-5p em 95D células, o que foi consistente com o nosso estudo anterior [19]. Para abordar o papel potencial de miR-574-5p em TLR9 sinalização aumentada a progressão de células de cancro do pulmão humanas, foi avaliado o efeito da sub-regulação de miR-574-5p em TLR9 sinalização aumentada progressão de células 95D e descobriram que a sub-regulação de miR-574-5p poderia, obviamente, reduzir a progressão de células 95D in vitro e in vivo. Os nossos dados sugerem que o miR-intrínseca 574-5p poderia contribuir para a progressão de células cancerígenas do pulmão humano. Com efeito, o nosso estudo mostrou que sucessiva miR-574-5p poderia promover a progressão de células cancerígenas do pulmão humano, indicando que a expressão sustentada do miR-574-5p foi essencial para a progressão de células cancerígenas do pulmão humano.