Abstract

Acumulando as evidências indicam que uma pequena população de células-tronco cancerosas (CSCs) está envolvido em resistência intrínseca ao tratamento do cancro. O microambiente hipóxico é um importante nicho de células-tronco que promove a persistência de CSCs em tumores. O nosso objectivo foi aqui para esclarecer o papel da hipoxia e CSCs na resistência a gefitinib no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) com activação do receptor do factor de crescimento epidérmico mutação (EGFR). linhagens de células NSCLC, PC9 e HCC827, que expressam os

EGFR

exon 19 mutações de deleção, foram expostos a altas concentrações de gefitinib sob normóxica ou condições de hipóxia. Sete dias após a exposição a gefitinib, uma pequena fracção de células viáveis ​​foram detectados, e estes foram referidos como “persistentes resistentes a gefitinib” (GRP). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, e ALDH1A1-todos os genes envolvidos na stemness-se altamente expressa em GRPs em PC9 e HCC827 células e PC9 GRPs exibiu um elevado potencial de tumorigenicidade

in vivo

. A expressão do factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), também foi regulada positivamente e o receptor de IGF1 (IGF1R) foi activado em GRP. Importante, a exposição hipóxica aumentou significativamente a formação de esfera, o que reflecte a capacidade de auto-renovação, e a população de CD133- e GRP Oct4-positivos. Além disso, hipoxia upregulated expressão IGF1 através fator 1α hypoxia-inducible (HIF1α), e acentuadamente promovida a activação de IGF1R em GRP. Knockdown de expressão IGF1 reduziu significativamente GRPs expressando IGF1R fosforilada sob condições de hipóxia. Finalmente, a inibição de HIF1α IGF1R ou por inibidores específicos diminuiu significativamente a população de CD133- e GRP Oct4-positivas, que foram aumentadas por hipoxia em células PC9 e HCC827. Colectivamente, estes resultados sugerem que a hipóxia aumentou a população de CSCs pulmonares resistentes a gefitinib em

EGFR

mutação-positiva NSCLC ativando IGF1R. Segmentação da via IGF1R pode ser uma estratégia promissora para superar a resistência gefitinib em

EGFR

mutação-positiva NSCLC induzida por CSCs pulmonares e fatores do microambiente como hipóxia tumor

Citation:. Murakami A, Takahashi F , Nurwidya M, Kobayashi I, Minakata K, Hashimoto, M. et al. (2014) hipóxia câncer de pulmão aumenta resistentes a gefitinib Stem Cells através da ativação de Insulin-like growth factor 1 Receptor. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10.1371 /journal.pone.0086459

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de julho de 2013; Aceito: 13 de dezembro de 2013; Publicação: 28 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Murakami et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por Grant-in-Aids de Investigação científica No. 23591906 (Fumiyuki Takahashi) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a aquisição de resistência aos fármacos anti-cancerígenos continua a ser um obstáculo fundamental para melhorar o prognóstico de pacientes com câncer. A resistência às drogas pode ocorrer através de uma variedade de mecanismos, incluindo efluxo de droga a partir de células cancerosas, metabolismo da droga aumentada, mutações secundárias no alvo da droga, e envolvimento de vias de sobrevivência alternativas [1]. Estes mecanismos de resistência adquirida são geralmente causada por alterações genéticas no interior das células tumorais, que persistem durante o tratamento do cancro. No entanto, estudos recentes revelaram também mecanismos não-mutacionais de resistência a drogas, incluindo a existência de pequena população de cancro de células estaminais (CCC) [2]. CSCs, que também são conhecidas como células de iniciação do tumor e células cancerosas haste-like, os marcadores de células estaminais express incluindo CD133, ABCG2, Bmi-1, e Oct4, e pode formar esferas flutuantes em meio isento de soro, uma propriedade associada com a haste células [3] – [5]. A evidência crescente indica que pequenas populações de CSCs são intrinsecamente mais refractária para uma variedade de fármacos anti-cancro e são responsáveis ​​pela resistência ao tratamento do cancro, o que muitas vezes acompanha a reincidência do tumor [6]. Assim, CSCs segmentação pode melhorar os resultados do tratamento e levar ao desenvolvimento de novas terapias para pacientes com câncer.

Stem “nichos” de células são definidos como locais específicos ou microambientes que mantêm as propriedades de células-tronco auto-renovação e multipotency [ ,,,0],7], [8]. Os tumores sólidos geralmente contêm regiões com fornecimento insuficiente de oxigénio, uma condição conhecida como hipoxia, e vários relatórios recentes sugeriram que a hipoxia promove a persistência de tumores CSCs em [9]. Esse nicho hipóxica é responsável pela manutenção CSC e desempenha um papel na promoção da resistência terapêutica [10]. Assim, tendo como alvo o microambiente hipóxico pode ser outra estratégia promissora para o controle eficaz de CSCs [9].

câncer de pulmão de células avançada não-pequenas (NSCLC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [11]. Mutações somáticas no gene do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), tais como uma mutação de deleção em grelha no exão 19, está associada a uma resposta favorável para os inibidores da tirosina-cinase EGFR (EGFR-TKI), gefitinib e erlotinib [12]. mutações no domínio quinase EGFR ocorrem com uma frequência significativamente mais elevada em tumores de pacientes asiáticos em comparação com os não-asiáticos [13]. No entanto, na maioria dos relatórios, a sobrevivência livre de progressão dos pacientes não superior a 12 meses, ea maioria dos pacientes desenvolveram resistência adquirida [14]. Além disso, 25-30% dos pacientes são intrinsecamente resistentes a EGFR-TKI como os seus tumores são diagnosticados como hospedeiros mutações activadoras no

EGFR

[15], [16]. Os principais mecanismos de resistência identificados até à data incluem mutações secundárias e um “interruptor de quinase do oncogene.” O

EGFR T790M

contas de mutação para 50% dos casos, e

TEM

amplificação pode ser detectado em 20 % dos pacientes com

EGFR

-mutant NSCLC resistente ao TKI [17]. No entanto, os mecanismos responsáveis ​​pela resistência intrínseca e outra resistência adquirida a EGFR-TKI, bem como a questão de saber se CSCs e nichos hipóxicas contribuir para a resistência de EGFR-TKI, não são completamente compreendidos.

IGF1R é um transmembranar receptor tirosina-quinase responsável pela proliferação celular e sobrevivência [18]. IGF1R é expressa em muitos tipos de células cancerosas, incluindo NSCLC [18], e melhorada a activação de IGF1R está implicada na resistência à quimioterapia e terapias alvo, tais como EGFR-TKI [19], [20]. Vários relatórios recentes sugeriram que o IGF1R desempenha um papel crítico na sobrevivência de alguns CSCs [21]. células de cancro colorrectal resistente à quimioterapia, foram enriquecidas para os CSCs e aumento da sensibilidade à inibição do IGF1R [21]. De acordo com Sharma et ai., A subpopulação de drogas tolerantes após a exposição da droga letal parecia ter o fenótipo expresso e CSC IGF1R fosforilada em vários modelos de linhas celulares testadas, incluindo a linha celular PC9 NSCLC. Co-tratamento de células com PC9 EGFR-TKI mais inibidor do IGF1R impedido emergência do fenótipo tolerante CSC-droga [2]. resultados coletivos sugerem um papel potencial para IGF1R sinalização na tolerância à droga dos CSCs de EGFR-TKI. No entanto, a correlação entre a hipóxia, CSCs e IGF1R sinalização na resistência EGFR-TKI não foi esclarecida.

Neste estudo, examinamos o papel da hipóxia na persistência da CSCs pulmonares na resistência gefitinib em NSCLC com a ativação

EGFR

mutações. A linhas de células NSCLC e PC9 HCC827, que leva uma activação

EGFR

mutação, foram expostas a uma concentração elevada de gefitinib sob condições de hipóxia ou de normóxia. Descobrimos que a hipóxia aumentou CSCs pulmonares resistentes a gefitinib em

EGFR

NSCLCs mutação-positivo, ativando IGF1R. O significado biológico de hipóxia para a persistência da CSCs resistentes a gefitinib e activação melhorada do IGF1R foram investigados.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e reagentes

As linhas de células NSCLC PC9 e HCC827, que expressam

EGFR

exão 19 mutações de deleção (ΔE746-A750), foram utilizados neste estudo. células PC9 foram estabelecidas na Universidade de Medicina de Tóquio (Tóquio, Japão), como descrito anteriormente [22], e foram gentilmente cedidas pelo Dr. Kazuto Nishio (Departamento de Genome Biology, Faculdade de Medicina da Universidade de Kinki, Osaka). HCC827 células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As linhas celulares foram verificados para ser livre de micoplasma. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japão) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina e estreptomicina (100 U /mL e 100 ug /ml, respectivamente), e foram cultivadas numa atmosfera humidificada 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C numa incubadora, na qual a tensão de oxigénio foi realizada em ambos os 21% (normoxia) ou 1% (hipóxia). Gefitinib foi adquirido a Research Chemicals Trading JS (Wedel, Alemanha). YC-1 e AEW541 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e Selleck Chemicals (Houston, TX, EUA), respectivamente.

Geração de gefitinib resistentes-persistentes (GRP)

Um total de 2 x 10

5 células foram plaqueadas em dez placas de 10 cm e deixadas a aderir durante 24 h. As células foram então tratadas com gefitinib a uma concentração de 1 uM, o que é 30-50 vezes a sub estabelecida IC

50 valores, e incubou-se sob normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2). O meio foi substituído com meio fresco contendo gefitinib a cada 3 dias. As células viáveis ​​que permaneceu ligado no prato no dia 7 sob condições de hipóxia ou de normóxia foram considerados persistentes resistentes a gefitinib (GRP) ou persistentes resistentes a gefitinib hipóxicas (GRP hipóxicas), respectivamente, e foram recolhidas para análise. A identidade genética dos GRPs com as células parentais foi confirmada usando o GenomeLab Humano STR Primer definir a partir de Beckman Coulter (Fullerton, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

Quantitative PCR em tempo real

os ARNs totais foram extraídos a partir de linhas celulares utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA). O ADNc foi gerado a partir de 1 ou 2 ug de ARN utilizando o kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante. Quantitative PCR em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando rápida SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) como previamente descrito [22]. O programa a seguir foi executado: segurando a 95 ° C durante 20 seg, 40 ciclos de amplificação por meio de desnaturação (95 ° C durante 3 seg, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 30 seg), com análise de fusão-curva concomitante. Foram avaliados onze genes housekeeping (

ACTB, GAPDH, UBC, B2M, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SdhA, TOP1,

e

ATP5B) em amostras experimentais para identificar o mais estavelmente genes de controle expressos usando software geNorm (https://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). beta actina (

ACTB

) e complexo succinato desidrogenase, subunidade A flavoprotein (

SdhA

) foram identificados como os genes de limpeza mais estáveis ​​em nossos modelos de celulares por análise de qPCR; portanto,

ACTB

ou

SdhA

foram usados ​​como controles internos

Os iniciadores que eram específicas para os genes foram os seguintes:.

CD133

Avançado, 5′-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 ‘

reversa, 5′-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3′

Oct4

Avançado, 5′-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG-3 ‘

reversa, 5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3′

Sox2

Avançado, 5′-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3

reversa, 5′-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG ‘

-3 ‘

Nanog

Avançado, 5′-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3′

reversa, 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 ‘

CXCR4

Avançado, 5′-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 ‘

reversa, 5′-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3′

ALDH1A1

Avançado, 5′-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 ‘

reversa, 5′-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 ‘

IGF1

Avançado, 5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′

reversa

, 5′-CGACTGCTGGAGCCATACC-3 ‘

imunofluorescência

PC9 ou HCC827 células foram cultivadas em câmara Lab-Tek II lâminas (Nunc, Rochester, NY, EUA), com ou sem 1 pM ou 2 gefitinib � e inferior normóxica ou hipóxica condições durante 72 h, fixadas com 8% de paraformaldeído durante 20 min, e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 durante 3 min. Após bloqueio com soro de cabra a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, as células foram incubadas a 4 ° C durante a noite com os seguintes anticorpos primários: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), IGF1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), e pIGF1R (Sigma-Aldrich). As proteínas foram visualizadas por incubação com o anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho Alexa Fluor 594 ou IgG de cabra anti-ratinho (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As lâminas foram montadas com meio de montagem Vectashield com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As imagens foram obtidas em um Axioplan 2 de imagem (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) com um software AxioVision (Zeiss). Imagens utilizados para as comparações de diferentes células e /ou tratamentos foram adquiridas com as mesmas configurações do instrumento e tempos de exposição e foram processados ​​de modo semelhante. O número de CD133-, Oct4-, e células-IGF1R positivo fosforilados foram contadas; a proporção de células positivas foi calculada em cinco campos para cada experimento.

Esfera Forming Ensaio

culturas em suspensão de uma única célula foram preparados em densidades de 2,5 × 10

3 células por poço em meio isento de soro de DMEM /F12 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com comercial hormona mistura B27 (Gibco), EGF (20 ng /mL; Gibco), o FGF (20 ng /mL; Invitrogen), e heparina ( 2 ug /mL), e semeadas em placas de 6 cavidades de fixação ultra-baixo (Corning, Corning, NY, EUA). células parentais e GRP PC9 foram incubadas sob condições de normóxia, enquanto GRP PC9 hipóxicas foram incubadas sob condições de hipóxia. O meio de cultura foi substituído a cada 3 dias; o número eo tamanho das esferas foram gravadas e análises de imunofluorescência foram realizadas 7 dias após o início do período de cultura [23].

RNA Interferência

Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) visando IGF1 ( Discrição Select RNAi siRNA) foram personalizados sintetizados pela Invitrogen. Um controlo negativo também foi adquirido de Invitrogen. células PC9 ou HCC827 foram transfectadas com 2 siRNAs específicos diferentes e um controlo não-específica usando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram separadas e diluídos em meio de crescimento completo, sem antibióticos e, em seguida, colocadas em placas em cada um dos poços. ARNi duplex e Lipofectamina RNAiMAX foram misturados em meio de soro reduzido Opti-MEM®I (Gibco) e incubadas durante 15 min à temperatura ambiente. complexos de ARNi duplex de Lipofectamine ™ RNAiMAX foram adicionados aos poços que contêm as células. As células foram então incubadas durante 48 h a 37 ° C

As sequências de ARNsi contra o IGF-1 eram os seguintes:.

IGF1 # 1:5′-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3

‘

IGF1 # 2:5′-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 ‘

Colony Ensaio de Inibição de

células PC9 (2 × 10

5) ou HCC827 células (4 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 10 cm e deixadas a aderir durante 24 h. As células foram então incubadas com 1 uM de gefitinib ou 2 ^ M, e com ou sem 0,01 uM, 0,1 uM, ou 1 uM AEW541 sob condições hipóxicas durante 18 dias para as células PC9 ou 11 dias para HCC827 células. Após a incubação, o número de colónias foram contadas.

In vivo

tumorigenicidade Estudo

NOD /Shi-scid /IL-2Rcnull (NOG) ratos (7-semana- idade, do sexo feminino) foram adquiridos no Instituto Central de Animais experimentais (Kanagawa, Japão). Todos os ratinhos foram enviados para a Universidade Juntendo e foram mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos. Os ratinhos foram alojados numa sala com temperatura controlada (25 ° C), humidade e iluminação (12 horas de ciclo claro /escuro).

Ad libitum

acesso a alimentos e água da torneira foi permitida durante todo o período do estudo. Para avaliar o

in vivo

potencial tumorigénico, 1 × 10 células ou 1 × 10

2 células de células parentais PC9 e normóxica e GRPs PC9 hipóxicos foram misturadas com Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) e injectados em ambos os flancos de ratos NOG. a formação do tumor foi avaliada 22-50 dias após a injecção.

Ética

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes fundamentais para condução adequada de Experimentação Animal e actividades conexas, instituições de pesquisa acadêmica sob a jurisdição do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (Aviso n º 71, de 2006) e foram aprovados pelo Comitê de Experimentação animal da Universidade Juntendo com a Aprovação No. 240182.

Análise estatística

Os valores foram comparados por meio de um Student bicaudal

t

-teste. Para comparar vários grupos, foi aplicada uma análise de uma via da variância (ANOVA). A análise estatística do tamanho da esfera foi realizada utilizando o teste de Kruskal-Wallis. foram consideradas estatisticamente significativas diferenças entre as médias, quando p . 0,05

Resultados

Isolamento e Gene Expression Analysis of resistentes a gefitinib persistentes (GRPs) derivadas de linhas celulares de NSCLC abrigar uma Activar

EGFR

mutation

A linha de células PC9 NSCLC, carregando um activador

EGFR

mutação, foi tratado com 1 pM gefitinib. Como descrito num relatório anterior [2], uma pequena fracção de células viáveis ​​pode sobreviver e permanecer 7 dias mais tarde, enquanto a maioria das células foram mortas dentro de poucos dias (Figura 1B). Nós nos referimos a essas células como persistentes resistentes a gefitinib (GRP). Embora GRP eram extremamente quiescente, GRP retomado proliferar sob a elevada concentração de gefitinib (Figura 1C) e, eventualmente, mostrou a proliferação normal (Figura 1D). Uma população análogo de GRP foi detectado na outra linha de células NSCLC testado, HCC827 abrigando um sensível

EGFR

mutação, por tratamento com gefitinib 1 uM (dados não apresentados).

Primeiro, 2 × 10

5 PC9 células foram plaqueadas em placas de 10 cm e deixadas a aderir durante 24 h (a). As células foram então tratadas com 1 uM de gefitinib. gefitinib contendo meio fresco foi substituído a cada 3 dias. Sete dias após a exposição a gefitinib, uma pequena fracção de células viáveis ​​permaneceram (B), é retomada em proliferação após 18 dias (C), e continuou a proliferar, mesmo depois de 30 dias (D). A. representativo de imagem microscópica de células PC9 parentais. B, C, D. imagens representativas dos GRPs PC9 expostos a 1 PM gefitinib para 7, 18 e 30 dias foram fotografados, respectivamente.

A identidade genética dos GRPs com as células parentais foram confirmados usando uma análise baseada em PCR (Humana GenomeLab STR conjunto de iniciadores a partir da Beckman Coulter) que interroga um conjunto de 12 repetições em tandem curtas. Análise de ADN genómico de células e de GRP PC9 parentais e HCC827 células são mostradas na Figura S1 S1 informação. STR perfis de células parentais e GRP são as mesmas. Além disso, GRP e de PC9 HCC827 células reteve o

EGFR

exão 19 mutação de deleção (ΔE746-A750), tal como avaliado através de sequenciação directa (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados confirmam que GRPs não surgiu a partir de células contaminantes. Nem o

EGFR T790M

mutação nem

TEM

amplificação do gene foi observada em GRP em ambos PC9 e HCC827 células (dados não apresentados). A tirosina-quinase Src não foi activado no GRP de ambos PC9 e HCC827 células em comparação com as células parentais não tratadas (Figura S2 na informação S1). EGFR e HER3 foram ativados nas células PC9 e HCC827 parentais, mas expressões foram suprimidos acentuadamente nos GRPs de ambas as linhas de células (Figura S2 em Informação S1).

Para identificar o mecanismo subjacente a resistência gefitinib em nosso modelo de celular, analisou-se em primeiro lugar a expressão do gene em células parentais e GRP utilizando qPCR. O pulmão putativo CSC marcador CD133 foi altamente expressa em GRP em PC9 e HCC827 células (Figura 2A), sugerindo um fenótipo stemness. Para determinar adicionalmente se poderia revelar GRP as características de CSCs em nossos modelos celulares, avaliou-se a expressão de genes que regulam e manutenção do fenótipo de células estaminais. Curiosamente, as expressões dos genes de Oct4, Sox2 e Nanog, que também são conhecidos por estarem envolvidos no rato reprogramação ou células somáticas humanas para células estaminais indiferenciadas, pluripotentes, foram significativamente aumentados em GRP em células PC9, mostrando um aumento de 3,4 vezes, 5,4 fold, e 6,9 ​​vezes, respectivamente, em relação às células parentais PC9 (Figura 2A). Além disso, a expressão de CXCR4 e ALDH1A1, também demonstrado estar associada com o fenótipo CSC, foram regulados positivamente (Figura 2A). Resultados semelhantes foram obtidos para HCC827 GRP (Figura 2A). Outros genes de células estaminais conhecidos tais como ABCG2, Bmi-1, e CD117 (c-Kit), não foram regulados positivamente no GRP (dados não mostrados).

. RT-PCR foi realizada com os iniciadores específicos para CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4, e ALDH1A1, os quais são genes stemness em PC9 HCC827 ou células progenitoras e GRP. B. RT-PCR foi realizada com os iniciadores específicos para IGF1 e IGF1R em PC9 HCC827 ou células progenitoras e GRP. Os dados foram normalizados para a expressão de actina. * P 0,01, ** p 0,001, *** p . 0,0001

Um relatório anterior também mostrou que IGF1R foi fosforilada e ativada em células EGFR-TKI tolerantes em células PC9 e que um inibidor do IGF1R, AEW541, poderia impedir o surgimento destas células tolerantes [2]. Examinamos IGF1 e IGF1R expressão usando qPCR em nosso modelo de celular. expressão IGF1 foi dramaticamente sobrerregulada no PC9 GRP em comparação com as células parentais PC9, mostrando um aumento de 49,8 vezes (Figura 2B). IGF1R expressão foi ligeiramente aumentada no GRP (Figura 2B). Resultados semelhantes foram obtidos para o GRP em células HCC827 (Figura 2B).

Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a pequena população de células NSCLC que foram altamente enriquecidas para a expressão do gene de IGF-1 e stemness sobreviveu e poderia continuar a proliferar sob tratamento de uma concentração elevada de gefitinib.

Capacidade e de tumorigenicidade de GRPs foram regulada e Formação Sphere por GRPs aumentou após exposição a condições de hipóxia

para melhor avaliar a stemness de GRPs, sphere- Sphere-forming formando ensaios que refletem a atividade de auto-renovação e

foram realizadas in vivo

estudos de tumorigenicidade. A capacidade para formar esferas foi significativamente maior no PC9 GRP do que nas células parentais (Figura 3A). Importante, hipoxia marcadamente aumentou o número de esferas de PC9 GRP (Figura 3A). Esfera de tamanho PC9 GRP sob condições hipóxicas foi significativamente maior do que o das células parentais (Figura 3B). resultados de imunofluorescência mostrou que as esferas de GRP eram positivos para CD133, Oct4, e IGF1R fosforilada (Figura 3C). Além disso, foi injetado 1 × 10 células ou 1 × 10

2 células de células PC9 parentais e normóxica e GRPs hipóxicos em ambos os flancos de ratos NOG e comparou o potencial tumorigénico

in vivo

. incidências de tumor de normóxica e GRPs hipóxicos em camundongos foram maiores do que aqueles em células parentais (Tabela 1). Notavelmente, GRP de normóxia e de hipóxia formado tumores em duas e cinco dos 16 ratos NOG em 1 × 10 células /injecção, respectivamente, embora as células parentais não formam tumores (Tabela 1). A diferença na formação de tumores entre o grupo de células parental e grupo GRP hipóxicas com a injecção de 1 x 10 células foi estatisticamente significativa (* p = 0,040). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que GRPs enriquecido para marcadores stemness têm características do fenótipo de células-tronco e que o microambiente hipóxico regulada e mantida propriedades das células-tronco de GRPs, tais como a capacidade de formação de esfera e tumorigenicidade.

PC9 células parentais, GRP, e GRP hipóxicas foram preparados em densidades de 2,5 × 10

3 células por 2 ml por poço em meio livre de soro suplementado com factores de crescimento e semeadas em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação. células parentais e GRP PC9 foram incubadas sob condições de normóxia, enquanto GRP PC9 hipóxicas foram cultivadas sob condições hipóxicas. O meio de cultura foi alimentada a cada 3 dias. O número e tamanho das esferas foram registados e a imunofluorescência foi realizada 7 dias após o início do período de cultura. As esferas foram fixadas e incubadas com anticorpos primários contra CD133, Oct4, ou IGF1R fosforilada (pIGF1R), e depois com anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (vermelho) ou Alexa Fluor de IgG anti-coelho de 488 cabra (verde) . os núcleos das células foram coradas com DAPI (azul). As imagens foram obtidas com um sistema de imagem com software Axioplan 2 AxioVision. A. O número de esferas foi significativamente aumentada em comparação com PC9 GRP em células parentais, e foi ainda aumentada em GRP PC9 hipóxicas. * P 0,01, # P 0,05. Esfera de tamanho B. PC9 GRP hipóxicas foi significativamente maior do que a de células parentais. # P 0,05. imagens C. imunofluorescência de células de PC9 (esquerda) de controle e esferas de GRPs (à direita) para CD133, Oct4 e pIGF1R.

População de CD133- e GRPs Oct4-positivos foram Aumento sob hipóxicos condições

Para investigar o papel da hipóxia sobre a geração e persistência da população de células estaminais gefitinib resistente, avaliamos CD133- e GRPs Oct4-positivos sob normóxica e condições de hipóxia imunofluorescência. Como mostrado na Figura 4A e 4B, hipóxia aumentou significativamente a população de CD133- e GRP Oct4-positivos em PC9 e HCC827 células.

A, B. PC9 HCC827 ou células, que cresce em lâminas de câmara Lab-Tek com ou sem 1 ou 2 ^ M gefitinib e sob normóxica ou condições hipóxicas durante 72 h, fixadas e incubadas com os anticorpos primários contra CD133 (a) e Oct4 (B), e depois com anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-ratinho IgG (vermelho). os núcleos das células foram coradas com DAPI (azul). As imagens foram obtidas com um sistema de imagem com software Axioplan 2 AxioVision. As imagens usadas para comparar células parentais, GRPs, e GRPs hipóxicos foram adquiridos usando as mesmas configurações do instrumento e tempos de exposição e foram processados ​​de forma semelhante. Os números de células CD133 e Oct4-positivas foram contadas, e a proporção destas células foi calculado em cinco campos em cada experiência. ** P 0,001, * p 0,01, # p . 0,05

IGF1R foi activado com GRPs sob condições hipóxicas e Knockdown de IGF1 Diminuição da População de CD133- e GRPs hipóxicos Oct4-positivos

Para investigar o efeito de hipoxia na activação do IGF1R, foi examinada a expressão do gene de IGF-1 em GRP por qPCR, assim como a fosforilação de IGF1R em GRP utilizando imunofluorescência sob normóxicas e condições hipóxicas. Como mostrado na Figura 5A, a expressão de ARNm de IGF1 foi muito maior no PC9 GRP do que nas células parentais e PC9 foi regulada positivamente pela exposição a condições de hipóxia. Importante, IGF1R fosforilada foi expressa no PC9 GRPs, e exposição à hipóxia acentuadamente regulada a população de fosforilada GRPs PC9 expressando IGF1R (Figura 5B).

A. RT-PCR foi realizada com os iniciadores específicos para o IGF1 ou em PC9 HCC827 células parentais, GRP, e GRP hipóxicas. Os dados foram normalizados para a expressão de actina. ** P 0,001. PC9 células B., cultivadas em lâminas de câmaras Lab-Tek, com ou sem 1 ^ M de gefitinib e sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 72 h, fixadas, e incubadas com os anticorpos primários contra IGF1R fosforilada (pIGF1R) e depois com os anticorpos secundários marcados com Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-coelho (verde). os núcleos das células foram coradas com DAPI (azul). As imagens foram obtidas utilizando um sistema de imagiologia Axioplan 2 com software AxioVision. Imagens usado para comparar células parentais PC9, GRPs, e GRPs hipóxicos foram adquiridas com as mesmas configurações do instrumento e tempos de exposição, e foram processados ​​de forma semelhante. O número de células pIGF1R-positivas foi contado, e a proporção destas células foi calculado em cinco campos em cada experiência. ** P 0,001. expressão C. IGF1 foi derrubado no PC9 ou HCC827 GRPs hipóxicos usando pequenas interferência RNA (siRNA) em lâminas de câmaras Lab-Tek. imunofluorescência para pIGF1R, CD133, ou Oct4 foi então realizada. Foram utilizados dois siRNAs específicos e um controlo não específico. Os números de pIGF1R-, CD133- e células Oct4-positivas foram contadas, e a proporção destas células foi calculado em cinco campos para cada experimento. ** P 0,001, * p . 0,01

Para esclarecer o significado biológico de IGF1 na resistência gefitinib em nosso modelo de célula hipóxica, nós derrubado expressão IGF1 no GRPs hipóxicos de PC9 e HCC827 células usando dois siRNAs diferentes específicos (# 1 e # 2; Figura S3 em Informação S1). Como mostrado na Figura 5C, o knockdown de IGF1 reduziu significativamente GRP-expressando IGF1R fosforilados, e diminuiu CD133- e GRP Oct4-positivos, em condições de hipóxia. Estes achados sugerem que o IGF1 desempenha um papel na activação do IGF1R e a manutenção das CSCs resistentes a gefitinib.

A hipoxia Regula IGF1 expressão através HIF1α, e a inibição da HIF1α IGF1R ou Diminuição CD133- e GRP Oct4-positivos sob hipóxia

Para investigar ainda mais os efeitos de hipoxia na supra-regulação de IGF-1 e de activação do IGF1R, que regulada negativamente expressão hipoxia-inducible factor 1α (HIF1α) em GRP hipóxicas utilizando o inibidor específico HIF1α YC-1. O tratamento com YC-1 inibiu a expressão HIF1α significativamente em ambos PC9 e HCC827 células sob a hipoxia em uma maneira dependente da dose (Figura S4 na informação S1). Como mostrado na Figura 6A, a inibição da HIF1α por YC-1 também suprimiu tratamento expressão IGF1 em GRP hipóxicas, e reduziu significativamente a fosforilação do IGF1R em GRP sob a hipóxia. Além disso, YC-1 tratamento diminuiu significativamente a população de CD133- e Oct4- GRP hipóxicas positivos. Finalmente, o tratamento com o inibidor do IGF1R AEW541 diminuiu significativamente a população de CD133- e GRP Oct4-positivas de uma forma dependente da dose, após exposição a gefitinib sob condições hipóxicas (Figura 6B). Além disso, o número de colónias consistindo em GRP foi suprimida significativamente por AEW541 sob condições hipóxicas (Figura 6c). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a hipóxia regula a expressão IGF1 através HIF1α, e que IGF1 regulada induz a ativação de IGF1R e aumenta as CSCs resistentes a gefitinib em

EGFR

células NSCLC mutação-positivos sob a hipóxia.

A. HIF1α expressão foi suprimida em PC9 ou HCC827 GRP hipóxicas por tratamento com 50 uM, 100 uM, 200 uM e YC-1 em lâminas de câmara Lab-Tek. imunofluorescência para IGF1, IGF1R fosforilada (pIGF1R), foi então realizada CD133, e Oct4. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4.