Abstract
Por causa das taxas de resposta global baixa de 10-47% para cancro terapêutica alvo, há é uma necessidade crescente de biomarcadores preditivos. Nós teve como objetivo identificar genes que predizem resposta a cinco inibidores da tirosina quinase já aprovados. Testamos 45 linhas celulares de cancro de sensibilidade ao sunitinib, erlotinib, lapatinib, sorafenib e gefitinib nas doses clinicamente administrados. Uma matriz de resistência foi determinada, e os perfis de subconjuntos de linhas celulares resistentes contra expressão de genes sensíveis foram comparados. assinaturas de expressão de genes triplicado foram obtidos a partir do projecto caArray. análise da significância dos microarrays e produtos de classificação foram aplicados para a seleção de recurso. Noventa e cinco genes também foram medidas por RT-PCR. No caso de quatro genes de resistência sunitinib associados, os resultados foram validados em amostras clínicas por imuno-histoquímica. foi identificada uma lista de 63 genes associados com melhores resistência contra os inibidores da tirosina-cinase cinco. análise de RT-PCR quantitativo confirmou 45 dos 63 genes identificados por análise de microarray. Apenas dois genes (
ANXA3
e
RAB25
) foram relacionadas a sensibilidade contra mais de três inibidores. A análise imuno-histoquímica de carcinomas de células renais metastático tratados com sunitinib confirmou a correlação entre RAB17, LGALS8 e EPCAM e sobrevida global. Em resumo, nós determinamos biomarcadores preditivos de cinco inibidores da tirosina quinase, e validado biomarcadores resistência sunitinib por imuno-histoquímica em uma coorte independente paciente
Citation:. Pénzváltó Z, Tegze B, Szász AM, Sztupinszki Z, Liko I, Szendrői Um, et ai. (2013) identificar a resistência à Mecanismos contra cinco de tirosina-quinase Inibidores visando o ERBB /RAS Caminho em 45 linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (3): e59503. doi: 10.1371 /journal.pone.0059503
Autor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Alemanha |
Recebido: 21 Agosto, 2012; Aceito: 15 de fevereiro de 2013; Publicação: 29 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Pénzváltó et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo OTKA PD 83.154, pelo projecto Predict (grant no 259303 da chamada Health.2010.2.4.1.-8.), pela TAMOP-4.2.1.B 01/09 /KMR-2010-0001 e pelo Alexander von Humboldt Stiftung. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. A filiação de Dr. István Liko com Richter Gedeon não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
a terapia direcionada no tratamento do cancro refere-se à aplicação de agentes especiais que actuam em características moleculares específicas de vias de transdução de sinal envolvidos no desenvolvimento de o fenótipo canceroso. inibidores de erlotinib, gefitinib, sorafenib, sunitinib e lapatinib são todos utilizados clinicamente tirosina cinase (TKI) receptores de segmentação e membros jusante da via de ERBB /RAS [1]. O erlotinib e gefitinib são reversíveis inibidores de tirosina-cinase do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) utilizados no tratamento de cancro do pulmão de células não-pequenas. Cerca de 10% dos pacientes respondem ao tratamento na população americana e europeia Norte [2]. Lapatinib inibe o domínio da cinase de tirosina do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2). Ele está aprovado para o tratamento do cancro da mama, em que a taxa de resposta global para este tratamento é de 24% [3]. Sorafenib inibe RAF, VEGFR, PDGFR, Flt-3, receptores de c-kit. A taxa de resposta parcial é de 10%, quando é administrada em pacientes com carcinoma de células renais avançado-[4]. Sunitinib é uma pequena molécula tirosina multi-alvo do receptor quinase (RTK) inibidor que foi aprovado pela FDA para o tratamento de carcinoma de células renais (RCC) e tumor do estroma gastrointestinal resistentes ao imatinib (GIST). taxa de resposta objectiva é 31% na primeira linha de tratamento do carcinoma de células renais [5]. Devido às baixas taxas de resposta global de 10-47% [6] – [10], existe uma necessidade crescente de biomarcadores preditivos resposta ao tratamento específicos terapia
Além parâmetros farmacocinéticos, um tumor pode implantar diferente molecular. mecanismos para alcançar a resistência contra agentes de terapia-alvo: a molécula alvo pode ser sujeita a modificações, alterações a jusante da via podem conduzir a resistência contra um agente de direccionamento de uma molécula a montante, ou outras vias podem ser activadas que, alternativamente, mediar a sobrevivência de células de cancro e proliferação. Por exemplo, a mutação do T790M
gene EGFR
retém a capacidade do receptor para activar a via de jusante diminui, mas ao mesmo tempo de ligação de gefitinib e erlotinib ao receptor e, portanto, conduz a resistência a drogas [11].
MET
amplificação provoca resistência contra erlotinib e gefitinib por meio da ativação de vias alternativas [12]. Interleucina-8 pode activar uma via alternativa que conduz à resistência de sunitinib [13]. As mutações dos genes de membros a jusante da via também pode contribuir para a resistência contra agentes de terapia-alvo, tal como descrito antes, no caso de
KRAS
[14],
PTEN
[15],
BRAF
[16], e
PIK3CA
[17]. Quando um componente a jusante do sistema de sinalização activa a via, a inibição pelo bloqueio de um elemento a montante foi demonstrado ser ineficaz. Estas alterações a jusante podem ser utilizados como indicadores de negativas para os agentes que actuam a montante desse elemento viciante da via, tal como descrito antes para
KRAS
[18]. Se
KRAS
abriga uma mutação ativadora, os agentes que actuam em EGFR não terá qualquer efeito sobre o crescimento do tumor [19].
Estudos anteriores já descrito que o uso de dados de expressão gênica, juntamente com
in vitro
ensaios de sensibilidade a drogas, pode ser utilizado para o desenvolvimento de assinaturas que poderia classificar resposta a agentes antineoplásicos convencionais [20], [21]. Em outro estudo, um painel de linhas celulares de cancro foi tratada com dasatinib, um inibidor da quinase multitarget, e sensibilidade ao fármaco foi medida. Em paralelo, os dados de expressão gerados a partir do mesmo painel de linhas celulares foi utilizada para desenvolver uma assinatura para prever a sensibilidade ao fármaco [22]. Em outro estudo, um painel de linhas celulares de cancro de pulmão foi usada para o desenvolvimento de assinaturas de expressão de genes que predizem a sensibilidade aos inibidores de EGFR gefitnib [23] e erlotinib [24]. Finalmente, os genes significativos comuns de um
in vitro
e um
in vivo
estudo foram capazes de prever a resposta a rapamicina [25]. Embora focado em agentes terapêuticos individuais em um tipo de câncer, esses estudos já demonstraram o poder de perfis de expressão genética para prever a resposta a um agente específico.
No presente estudo, fizemos uma abordagem mais ampla com o objetivo de identificar genes assinaturas associadas à resistência intrínseca contra 5 inibidores da tirosina quinase já aprovados visando o /RAS-pathway ERBB. Para obter novos biomarcadores preditivos, que correlacionou a sensibilidade de 45 linhas de células que representam 15 entidades diferentes de câncer para os padrões de expressão. Os genes candidatos com melhor desempenho, em seguida, foram validados utilizando qRT-PCR. Finalmente, a validação clínica foi realizada utilizando imuno-histoquímica com base em microarrays de tecido sobre um conjunto de carcinomas de células renais de pacientes tratados com sunitinib.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
A aprovação número para a coleta de amostras pelo Comité Científico Nacional e do Comitê de Ética em Pesquisa (ETT-TUKEB) (Hungria) # 185/2007. consentimento geral informado foi obtido antes da cirurgia. O Comité Científico e Ética em Pesquisa Nacional não solicitou uma permissão específica, por escrito, pois, foi um estudo retrospectivo, e os pacientes foram tratadas de forma anônima.
Cultura Celular
Foram obtidos 45 linhas de células ATCC . Antes da seleção, a ausência de
KRAS
mutação nas linhas celulares foi confirmada usando o Catálogo do Somatic Mutações em Câncer (Search feito no 25
th de junho de 2010). As células foram cultivadas de acordo com os protocolos de ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org/). Além disso, os antibióticos (penicilina-estreptomicina, Invitrogen, Cat. No .: 15070-063, anfotericina B, Invitrogen, Cat. No .: 15290-026) foram adicionados. As linhas celulares estão resumidos na Tabela 1. Uma visão geral do estudo é apresentado na Figura 1.
As caixas com fundo cinza representam passos de formação, enquanto fundo branco representa etapas de validação.
o isolamento de ADN e Controle de Qualidade
DNA foi isolado utilizando o Qiagen DNeasy Blood and Kit Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha, cat. no .: 69506) de acordo com o guia do usuário do produto. Quantidade e qualidade do ADN foram testadas usando um sistema de Nanodrop 1000 (BCM, Houston, TX, EUA). ADN (A260) e as concentrações de proteína (A280) e a pureza da amostra (260/280 rácio) foram medidos e apenas ADN de alta qualidade foi usado para posterior análise. O ADN foi armazenado a -80 ° C.
Autenticação de linhas celulares
Autenticação foi realizada para linhas celulares obtidas a mais de 4 anos atrás a partir de ATCC, utilizando análise de 10 específica de repetição em tandem curtas (STR) loci no genoma humano e um marcador específico do rato. Autenticação foi realizada por StemElite ID Sistema no Centro de Análise Fragmento, da Universidade Johns Hopkins (Baltimore, EUA). STR perfis das linhas de células foram aplicadas em comparação com a base de dados de perfil STR do Instituto Leibniz DSMZ – Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células (https://www.dsmz.de). Todas as linhas celulares incluídos neste estudo estavam livres de contaminação.
Os testes de resistência
Os medicamentos foram utilizados na sua forma comercialmente disponível, e foram aplicados às células em 3 concentrações (C1, C2, C3 ). C1 = 0,1 * C2 e C3 = 10 * C2. C2 concentração foi deduzida a partir das doses clinicamente utilizadas (ver Tabela 2).
O ensaio de MTT (Roche, Cat. No .: 11465007001), foi usada para testar o efeito anti-proliferativo e de reagentes viabilidade celular. Em cada experiência, as células de 2000 /poço foram semeadas em meio de 100 ul em placas de 96 poços. Após um dia de incubação, as células foram coradas precontrol. Ao mesmo tempo, as culturas foram tratadas com todos os 5 drogas estudadas a concentrações C1, C2 e C3. No quinto dia, a experiência foi terminada e as células foram coradas. A absorvância foi lida com um FC Thermo Scientific Multiskan®. A absorvância medida a 595 nm foi corrigido com o fundo medida a 690 nm. Todas as medições foram repetidas três vezes, e para o cálculo dos valores do índice de resistência (RI), foram usadas as médias das medições 3. O índice de resistência (RI) foi calculado pela fmula [26]: em que N
pré é o valor da absorvância média de pré-controlo (que representa o número de células no início do tratamento), n
pós é a forma valor de absorvência de controlo (que representa o número de células no final do tratamento com o tratamento com veículo apenas), e N
2 é o valor médio de absorvância de células tratadas tratados com a concentração de C2 a droga estudada. concentrações C1 e C3 foram utilizados como controlos internos para acompanhar a gama dinâmica dos agentes. Somente linhas celulares que preencheram os critérios de qualidade de N
pós N
pré e desvio no crescimento celular dentro de repetições. 15% foram incluídos na avaliação
Seleção de Recursos
dados de microarranjos em rama para as linhas celulares foram geradas no projeto GSK caArray (ftp://caftpd.nci.nih.gov/pub/caARRAY/transcript_profiling). caArray foi desenvolvido utilizando as diretrizes de compatibilidade caBIG, bem como as normas da sociedade gênica por microarrays de expressão de Dados (MGED) para dados de microarranjos. Após o download, os arquivos raw.CEL foram MAS5 normalizada no ambiente estatístico R (www.r-project.org) usando a biblioteca affy Bioconductor [27]. MAS5 classificado entre os melhores métodos de normalização quando comparado com os resultados das medições qRT-PCR em nosso estudo recente [28]. Cada linha celular foi medida nas micromatrizes de triplicados – na etapa final do pré-processamento a média destes foi calculada. Como conjuntos de sondas com muito baixa abundância não são apenas pouco provável que mantenha significado biológico, mas também estão sujeitos a erros, fizemos uma filtragem para reter apenas os conjuntos de sondas com uma expressão média mais de 100 e expressão máxima sobre 1000. O banco de dados normalizado completo é apresentado em tabela S1.
O conjunto de dados completo, consistindo um dos perfis de expressão foi arranjado em 2 classes, de acordo com as propriedades de resistência das linhas de células. linhas de células intermediárias foram excluídos. Este processo de selecção resultou em 5 conjuntos de dados, que foram tratados como tarefas de classificação autónomas. Para obter a lista de genes correlacionados com a resistência, foi utilizada análise de significância das Microarrays (SAM) [29] e ordenamento dos produtos [30], [31]. Enquanto SAM é o método mais utilizado, ordenamento dos produtos foram encontrados para oferecer o melhor desempenho em um ambiente semelhante ao nosso projeto com o tamanho reduzido da amostra em um resumo antes de métodos de seleção de atributos disponíveis [32]. A eficácia do gene para discriminar define linhas de células resistentes e sensíveis foi calculado utilizando análise de previsão de microarrays [33]. O arquivo R da análise estatística utilizada está disponível no material suplementar como Script S1.
Para avaliar a capacidade do gene-sets para prever a sobrevida, buscamos no Pubmed GEO para conjuntos de dados com disponíveis acompanhamento clínico em que os doentes de cancro foram tratadas com um dos cinco agentes investigados. Finalmente, para procurar listas de genes semelhantes aos nossos genes e para identificar genes correlacionados com os genes identificados, foi utilizado o motor de busca CCancer [34].
Isolamento RNA e Controle de Qualidade
Depois de homogeneização usando Qiashredder, RNA foi isolado usando o kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o guia do usuário do produto. Quantidade e qualidade do ARN isolado foi testada usando um sistema Nanodrop 1000 (BCM, Houston, TX, EUA) e por electroforese em gel utilizando um sistema Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). ARN (A260) e as concentrações de proteína (A280) e a pureza da amostra (260/280 rácio) foram medidos. Só de alta qualidade, RNA total intacta foi aceito para amostras que também mostraram 18S regulares e 28S ribosomal padrão de RNA curva na análise Bioanalyzer. O ARN foi mantida a -80 ° C até à medição de RT-PCR.
Ensaio TaqMan
TaqMan-PCR em tempo real foi utilizado para medir a expressão de 95 genes seleccionados (mais um gene de manutenção) utilizando Sistema de Micro pneumático cartão (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) em 40 linhas de células. As medições foram realizadas utilizando um Sistema de Detecção de Sequência ABI 7900HT PRISM® conforme descrito no Manual do Utilizador produtos. Os genes foram seleccionados para incluir os melhores genes correlacionados com a resistência a vários agentes. Além disso, com base em uma pesquisa bibliográfica, um conjunto de genes correlacionados com a resistência terapia-alvo e os membros do EGFR /RAS via também foram adicionadas para análises adicionais. A lista de genes incluídos são apresentados na Tabela S2.
Análise de Dados das medições de RT-PCR
Para a análise de dados primários foi utilizado o software SDS 2.2. Os valores Ct delta (que representam a expressão normalizada para expressão 18S ribossomal) foram agrupados de acordo com as características de resistência contra os diversos agentes em grupos. Em seguida, o teste t de Student foi realizado para comparar a expressão do gene nos vários grupos independentemente. A significância estatística foi estabelecido em p . 0,05
Renal Cell Carcinoma (RCC) Amostra Coleção
Os pacientes foram tratados no Departamento de Urologia da Universidade Semmelweis, Budapest, Hungria entre 2005 e 2010. As amostras foram coletados de acordo com state-of-the-art protocolo de patologia de todos os pacientes operados de câncer de células renais. No entanto, apenas os pacientes com doença metastática depois foram incluídos no presente estudo, uma vez que apenas esses pacientes receberam uma terapia direcionada tratamento. Os dois agentes em uso clínico para RCC metastático são sunitinib e sorafenib. Destes, sunitinib é administrada na primeira configuração de linha, portanto, estes pacientes foram escolhidos para a imuno-histoquímica. Tissue microarrays (TMA) de todas as amostras FFPE foram construídos com o instrumento Tissue Micro-matriz Builder (Histopatologia Ltd., Pécs, Hungria). No TMAs, duplicatas de núcleos de largura de 2 mm foram utilizadas de cada tumor representando suas áreas mais relevantes de acordo com a histopatologia.
Imunohistoquímica
A imuno-histoquímica (IHQ) as reacções foram realizadas em 4 mm de espessura obtido a partir de blocos de TMA. Após desparafinização, as lâminas foram aquecidas num forno de micro-ondas no alvo Retrieval Solution (Dako, Carpenteria, CA, EUA) durante 30 minutos. Um sistema de referência imunohistoquímica Ventana automatizado foi utilizada de acordo com o protocolo “880” (e “870” para LGALS8) fornecido pelo fabricante (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, EUA). RAB17 (diluição, 1:200), LGALS8 (01:50), EpCam (1:100) e CD9 (1:300) anticorpos foram utilizados para a coloração. Os tecidos foram contrastadas com hemalaun de Mayer (00-8011, Zymed Laboratories Inc.). Os controlos positivos e negativos de controlo tecidos foram aplicados em todas as pistas de IHC. Em caso de CD9, LGALS8, RAB17 reação citoplasmática, para a coloração membranoso EpCAM foi aceito como a localização adequada.
As lâminas coradas foram digitalizadas com um scanner de slides (Mirax MIDI digitalização, 3DHistech Ltd., Budapeste, Hungria), e intensidade da reação (0: reação negativa, +1: positividade fraca, +2: positividade moderada, 3: forte reação) e frequência de células coradas positivamente (0:0-1%, 1:1-5%, 2:5-10%, 3:10-20%, 4:20-33%, 5:33-50%, 6:50-66%, 7:66-80%, 8:80-100%) eram avaliadas separadamente. Finalmente, a correlação entre grupos de sobrevivência de 25 percentis, bem como parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier com base no agrupamento utilizando a mediana foram computados em WinStat para Excel (R. Fitch Software, Bad Krozingen, Alemanha).
Resultados
resistência
A resistência de cada linha celular foi medida em triplicado para cada uma das três concentrações dos cinco agentes. Em seguida, as linhas celulares foram classificados com base em seus valores de IR. Um valor RI intermediário foi designado como estando dentro do valor mediano RI +/- 10% da gama do RI. As linhas de células que exibem superiores IR foram designados como resistentes, e linhas de células com o RIS inferiores como sensíveis. Uma visão completa da separação de linhas celulares em grupos é descrito na Tabela 1.
identificação de genes discriminatórias
Para a classificação, os genes foram filtrados para incluir apenas aquelas que alcançaram um, pelo menos, diferença de 2 vezes na expressão média comparada entre as linhas celulares designadas como sensível ou resistente. Em seguida, foi realizada seleção de características com SAM e produtos de classificação. Apenas os genes foram aceitos como significativa, que alcançou uma taxa de descoberta de falsas abaixo de 20%. A lista completa de genes significativas está listado na Tabela S3.
A precisão da classificação na definição de validação cruzada leave-one-out utilizando todos os genes nas linhas celulares resultou numa eficiência de 92,8% na PAM (foram excluídos linhas celulares com resistências intermédios). A utilização dos 100 genes identificados pelo ordenamento dos produtos resultou em 79% previsões correctas. As classificações corretas usando os 100 melhores produtos de classificação genes identificados são apresentados em classificações azuis e incorretas em vermelho na Tabela S4.
Embora os agentes investigados estão em uso clínico já há mais de 7 anos, não fomos capazes de encontrar publicada conjuntos de dados adequados para a meta-análise do gene-set identificados. Assim, não foi possível realizar uma
in silico
validação na previsão da resposta clínica ou a sobrevivência. Usando CCancer, todos juntos 27 publicações com conjuntos de genes que se sobrepõem foram identificados. Estes são apresentados na Tabela S5.
TaqMan Validação da linha de células derivada do gene Perfis
TaqManq resultados de RT-PCR estão resumidas na Tabela 3. 45 dos 63 genes associados com resistência no recurso selecção usando os dados de microarray foram confirmados inferior a P 0,05 e 23 destes inferior a P 0,01. A maior significância foi alcançada por
ITGB4
(p = 0,005) do erlotinib-resistência associada, por
IADA
(p = 0,003) dos genes associados ao gefitinib, pelo
FAT4
(p = 0,011) dos genes de sorafenib associado e pela
furina
e
ME1
(p = 0,011) dos genes associados ao lapatinib. Vários genes foram significativamente confirmada do gene assinatura sunitinib resistência incluindo
KRT18
(p = 0,001),
LGALS8
(p = 0,019),
RAB17
(p = 0,002 ),
CD9
(p = 0,002) e
PPL
(p = 0,001). Enquanto isso, somente 7 dos 32 genes previamente descritos na literatura como estando associadas com resistência contra os agentes de terapia-alvo foram confirmados. O resultado normalizado completo dos ensaios de TaqMan está disponível como A Tabela S6.
Alguns dos genes foram associados com resistência contra vários agentes. A maior significado destes foi alcançado por
COL3A1
(p 0,001 em caso de sorafenib-resistência),
GJA1
(p 0,001 em caso de sunitinib-resistência) e
KRT19
(p 0,001 em caso de sunitinib-resistência). Nós também têm retratado os genes associados à resistência contra vários agentes usando um circo-plot (ver Figura 2). Utilizando esta abordagem pode-se reconhecer o elevado número de genes associados com a resistência de sunitinib e a presença de apenas um único gene correlacionada com a resistência lapatinib. Apenas dois genes (
ANXA3
e
RAB25
) foram correlacionadas com a resistência intrínseca contra pelo menos quatro agentes.
Circos lote de RT-PCR validado correlações de genes associados à resistência contra vários agentes como identificados por análise de microarray. A espessura das fitas correlacionar ao
log (p) da correlação (ver Tabela 2.). Nota o elevado número de genes associados com a resistência de sunitinib e o gene de resistência único associado com lapatinib. Os dois genes mais informativos são ANXA3 e RAB25, cada um associado a resistência contra quatro agentes.
Validação baseada em IHC em células renais carcinomas
No total, 39 pacientes tratados com sunitinib com renais metastático carcinoma de células foram incluídos no estudo. As amostras dos doentes foram colhidas antes da administração da primeira linha TKI e são, por conseguinte, semelhante à medição da expressão de genes em linhas de células sem tratamento. A idade média dos pacientes era de 59 anos, 63% dos pacientes eram do sexo feminino. A sobrevida global mediana é de 14 meses, com 12/39 mortes. A sobrevida média é de 20 meses. metastasectomia parcial foi realizada em caso de dezessete pacientes. Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica para três proteínas codificadas pelos genes identificados são apresentados na Figura 3. Os resultados detalhados em todas as amostras para todos os genes são apresentados na Tabela S7.
exemplos representativos de validação para immunhistochemical CD9, EpCAM e LGALS8. coluna da esquerda: renal normal, coluna da direita: selecionado tecido tumoral
O aumento da intensidade da coloração da LGALS8 (p = 0,026) e RAB17 (p = 0,018) ea freqüência de células positivas para EpCAM (p. = 0,01) e LGALS8 (p = 0,01) foram correlacionadas com a sobrevivência melhorada. Enquanto isso, CD9 – embora apresentando uma tendência para a redução de sobrevida em pacientes ter aumentado a intensidade da coloração (p = 0,14) – não foi significativa. A trama de sobrevivência de Kaplan-Meier para EPCAM está representado na Figura 4.
de Kaplan-Meier de sobrevivência de amostras de RCC metastático tratados com sunitinib divididos em dois grupos com base na mediana de células positivas EpCAM (p = 0,01).
Discussão
agentes de terapia-alvo que atuam através da via ERBB /RAS entrou nas diretrizes de terapia do cancro convencionais. Como ainda só 10-47% dos pacientes respondem a estas terapias, é de extrema importância para identificar os controladores e potenciais marcadores de resistência. Em nosso estudo utilizamos linhas de células cancerosas 45 e assinaturas de expressão de genes do genoma para identificar potenciais novos genes biomarcadores intrínsecas. Como uma potencial aplicação clínica da nossa estratégia, validados os produtos de genes associados à resistência por análise IHC em carcinomas de células renais tratados com sunitinib.
Foi utilizado um painel heterogêneo de linhas celulares de cancro provenientes de pulmão (usado TKI incluem erlotinib e gefitinib), mama (lapatinib), renal (sorafenib e sunitinib) e fígado (sorafenib). As linhas de células com uma mutação RAS conhecido foram excluídos, uma vez que as mutações activadoras RAS tornar a inibição de tirosina-quinases a montante completamente ineficaz, como foi mostrado anteriormente para o cancro do cólon [35]. A selecção de linhas celulares permite a identificação de genes robustas relacionadas com vias independentes anteriormente não identificados.
Em um estudo recente de Barretina et al, um grande painel de linhas celulares foi investigado para identificar marcadores de sensibilidade contra um conjunto de citotóxico e agentes direcionados, incluindo três dos inibidores da tirosina quinase utilizados no presente estudo (erlotinib, lapatinib e sorafenib), medindo a sensibilidade aos valores de IC50 e CE50 [36]. Para aumentar a relevância clínica dos testes de linha de células de câncer, usamos concentrações da droga aplicadas na prática clínica, como esperávamos encontrar os marcadores candidatos mais confiáveis em concentrações também alcançáveis em pacientes [37], [38]. A robustez da abordagem utilizando tais concentrações clínicas pré-definidos é apoiada pela validação bem sucedida em uma coorte clínica dos doentes tratados com sunitinib.
Nós descobrimos genes mais de resistência cruzada conexos relacionados com sunitinib-resistência. Curiosamente, até agora apenas uns poucos genes foram correlacionados com sunitinib-resistência na literatura, enquanto o número de genes candidatos envolvidos na resistência contra os outros agentes é muito maior. Portanto, nós particularmente focado na resistência sunitinib e realizaram experiências de imuno-histoquímica em amostras de tumores para validar o potencial discriminatório de quatro novos biomarcadores candidatos,
LGALS8
,
RAB17
,
EpCAM
, e
CD9
.
o nosso primeiro gene candidato
LGALS8
codifica um membro da família galectina. As galectinas têm sido implicadas em muitas funções, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, adesão célula-célula, interacção célula-matriz, regulação do crescimento, a apoptose, e o splicing de ARN. A galectina-8 podem também estar envolvidos na angiogénese [39], e a expressão é alterada durante a progressão do tumor e hypolaryngeal laríngea [40]. O segundo gene,
RAB17
é uma GTPase específicos de células epiteliais desempenhando um papel importante na regulação do tráfego de membrana [41]. O terceiro gene, molécula de adesão de células epiteliais (
EpCAM
) é uma proteína de membrana com propriedades proto-oncogénico que está expressa em vários tipos de câncer e é um alvo droga anticâncer promissor. Ele funciona como uma molécula de adesão celular independente de cálcio homotípica. A libertação do domínio intracelular da molécula resulta na activação da via de WNT [42]. Alta expressão de
EpCAM
está associada com mau prognóstico no carcinoma da vesícula biliar [43]. Finalmente,
CD9
desempenha um papel importante em muitos processos celulares, incluindo a diferenciação, adesão, transdução de sinal, o crescimento, e na supressão da motilidade de células cancerosas e metástases. Miyake
et al
demonstrou que em pacientes com carcinoma ductal invasivo da diminuição da expressão de
CD9
proteína foi associada com mau prognóstico [44]. Os resultados de coloração IHC confirmaram as correlações entre
LGALS8, RAB17
e
EpCAM
e sobrevivência de pacientes com carcinoma renal tratados com sunitinib, enquanto CD9 não conseguiu alcançar potencial discriminatório significativo.
de acordo com os resultados do nosso estudo desses genes pode representar novos candidatos para identificar pacientes que podem se beneficiar da terapia com sunitinib. Enquanto a análise imuno-histoquímica validado 3 dos 4 candidatos biomarcador, um estudo clínico maior será necessária para estimar com rigor o poder e confirmar o seu significado clínico.
Na última década, a dependência oncogene tem sido reconhecido como um dos fatores-chave da evolução do câncer, que também podem marcar caminhos e genes para terapias específicas [45]. No entanto, devido à adaptação das células cancerosas, dependência de drogas, resultante do tratamento intensivo pode superar a dependência do oncogene como foi recentemente demonstrado em linhas de células de cancro do pulmão [46]. Para compreender esses processos, a identificação de genes, que partilham um papel funcional na resistência contra vários agentes de terapia-alvo, é de alta prioridade.
Apesar do mecanismo de acção semelhante, nenhum gene foi identificado a ser correlacionada com a sensibilidade contra todos os cinco agentes do nosso estudo. Dois genes,
ANXA3
e
RAB25
estavam relacionados com quatro drogas.
Anexina 3
(ANXA3) desempenha um papel no crescimento celular e na transdução de sinal [47], e foi anteriormente ligada à resistência de platina em cancro do ovário [48]. O produto da
ANXA3
gene também foi identificado como um dos alvos da tirosina-fosforilação de EGFR por imunoprecipitação e western blot [49].
ANXA3
foi identificada como um dos quatro genes regulados negativamente envolvidos na progressão do cancro da próstata num estudo recente que o EGFR em comparação mutado e não mutado tumores [50]. Os nossos resultados sugerem a possibilidade do envolvimento de
ANXA3
em vias colaterais permitindo que as células cancerosas para contornar a terapia TKI.
RAB25
é um membro da família oncogene RAS. Perda de
RAB25
foi associada com adenocarcinomas humanos colorretal [51] e câncer de mama triplo-negativo [52], mas o gene ainda não foi investigado em relação com a tirosina quinase resistência. Futuros estudos envolvendo pacientes com tirosina quinases simultaneamente sequenciados e RAS sinalização membros da via são necessários para avaliar a sua relevância na terapia-alvo.
Em resumo, apresentamos um gasoduto análise abrangente para futuros estudos dos inibidores da tirosina quinase investigados. Como prova de princípio foi selecionado um conjunto de genes associados à resistência sunitinib (o agente com os biomarcadores preditivos menos publicados) para testes em uma coorte clínica.
Informações de Apoio
Tabela S1.
dados de microarray normalizadas de todos os genes em todas as linhas celulares.
doi: 10.1371 /journal.pone.0059503.s001
(XLSX)
Tabela S2. : Lista dos genes seleccionados para validação de qRT-PCR.