Abstract

Fundo

KRAS

mutações ocorrem em 35-45% dos cancros metastáticos colorretal (CCRm) e capacidade de resposta se opõem à terapia alvo-EGFR com cetuximab ou panitumumab. No entanto, menos de 20% dos pacientes que apresentam o tipo selvagem

KRAS

tumores obter uma resposta objetiva. Alterações em outros efectores a jusante de EGFR, tais como BRAF, e desregulação da via PIK3CA /PTEN foram encontrados de forma independente para dar origem a resistência. Nós apresentamos uma análise abrangente da

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

mutações, e expressão de PTEN em pacientes com CCRm tratados com cetuximab ou panitumumab, com o objectivo de clarificar a relação contribuição dessas alterações moleculares de resistência.

Metodologia /Principais achados

Foram analisados ​​retrospectivamente de resposta tumoral objectiva, (PFS) livre de progressão ea sobrevida global (oS) em conjunto com o estado mutacional de

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e expressão de PTEN em 132 tumores de cetuximab ou panitumumab tratados pacientes com CCRm. Entre os 106 pacientes que não responderam, 74 (70%) tinham tumores com pelo menos uma alteração molecular nos quatro marcadores. A probabilidade de resposta foi de 51% (22/43) dos pacientes sem alterações, 4% (2/47) dos pacientes com uma alteração, e 0% (0/24) para pacientes com alterações ≥2 (p 0,0001) . Assim, PFS e OS eram cada vez pior para pacientes com tumores nenhum, 1, ou ≥2 alteração molecular (s) (p 0,001) abrigando.

Conclusões /Significado

Quando a expressão de PTEN e as mutações de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA Quais são concomitantemente determinado, até 70% dos pacientes com CCRm improváveis ​​para responder às terapias anti-EGFR pode ser identificado. Propomo-nos a definir como ‘

quadruple

negativo “, o CRCs falta alterações no

KRAS

,

BRAF

, PTEN e

PIK3CA

. dissecção molecular abrangente do EGFR vias de sinalização devem ser considerados para selecionar pacientes com CCRm para terapias cetuximab- ou à base de panitumumab

Citation:. Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, Molinari F, De Dosso S , Saletti P, et al. (2009) Análise Multi-Determinantes de alterações moleculares para a previsão de Benefício Clínico para Targeted-EGFR anticorpos monoclonais no câncer colorretal. PLoS ONE 4 (10): e7287. doi: 10.1371 /journal.pone.0007287

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 05 de junho de 2009; Aceito: 02 de setembro de 2009; Publicação: 02 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 SartoreBianchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC), Ministério da Saúde italiano, Regione Piemonte, Ministério da Universidade e da Pesquisa italiano, Association for Cancer Research International (AICR-UK), o contrato UE FP6 MCSCs 037.297, CRT Progetto Alfieri, Oncosuisse concede OCS-01921-08-2006 e OCS-02301-08-2008, Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Câncer (Fundação Tessin para Pesquisa do Câncer), e OCGO (Oncologia Ca Granda Onlus) Fondazione. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a terceira causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental [1]. Apesar das melhorias no arsenal terapêutico para metastático CRC (mCRC), a sobrevida global em 5 anos (OS) permanece pobre, com uma sobrevida média de 18 a 21 meses [2]. medicamentos adicionais, bem como novas perspectivas sobre os mecanismos de resistência, são necessárias para melhorar o resultado clínico. As opções de tratamento para CCRm hoje em dia incluem o cetuximab anticorpo IgG1 monoclonal quimérico (moAb) e o panitumumab moAb IgG2 humana [3], [4]. Ambas as moléculas se ligam ao Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR), que conduz à inibição da sua sinalização a jusante, fornecendo uma vantagem clínica significativa. taxas de resposta objectiva em populações não selecionadas de mCRC, no entanto, são limitadas a 8-12% para esses agentes quando usado como monoterapia em primeiros [5] e subsequentes linhas de tratamento [4], [6], [7].

e outros mostraram anteriormente que somática

KRAS

mutações (um efector chave do EGFR sinalização iniciada) pode prejudicar a eficácia independentemente de panitumumab ou cetuximab [8] – [10]. Isto levou os EUA e as autoridades de saúde europeias para restringir a utilização destes agentes para os pacientes com o tipo selvagem

KRAS

CCRm apenas [11] – [13]. Embora se espere que esta decisão para melhorar o índice terapêutico nesta população selecionada, a taxa de resposta objectiva é ainda muito limitada. Na verdade, ele está restrito a 17% (

vs

0% no

KRAS mutado

) para o panitumumab em monoterapia [10], para 12,8% (vs 1,2% em

KRAS

mutado) para o cetuximab em monoterapia [14] e para 59-61% (

vs

36-33% no

KRAS mutado

) para cetuximab mais quer irinotecano ou à base de oxaliplatina quimioterapia, respectivamente [15], [16]. Estes resultados sugerem claramente que outros fatores, como alterações em outros efetores EGFR, incluindo membros da RAS-MAPK ou PI3K poderia conduzir a resistência à terapia anti-EGFR.

BRAF é o principal efetor a jusante do KRAS [ ,,,0],17], [18] e sua mutação V600E oncogênico é mutuamente exclusiva com

KRAS

mutações em CRCs [19]. Nós e outros autores demonstraram recentemente que a mutação V600E também pode impedir a capacidade de resposta ao panitumumab ou cetuximab em pacientes com CCRm e modelos celulares de CRC [20]. O

gene PIK3CA

é mutado em aproximadamente 20% dos CRCs [21].

PIK3CA

mutações que ocorrem nos localizados no exão 9 (E542K, E545K) e exão 20 (H1047R) são oncogênicos no CRC modelos celulares “hotspots” [22], [23]. O

gene PIK3CA

codifica para uma quinase de lípidos que regula, a par com KRAS, vias a jusante do EGFR sinalização. sinalização iniciada PI3K é normalmente inibida por PTEN (fosfatase e homólogo angiotensina excluída no cromossomo dez). Nós e outros autores mostraram previamente que a perda de expressão de PTEN, que ocorre em 30% dos casos esporádicos, está associado com a falta de resposta ao cetuximab [24], e que

PIK3CA /PTEN

desregulação pode ser um biomarcador de resistência no

KRAS

pacientes do tipo selvagem [25], [26] e celulares modelos de CRC [27].

em conjunto, os resultados de análises retrospectivas mostram que

BRAF

e

alterações PIK3CA

/PTEN podem representar ferramentas adicionais para a seleção de pacientes com CCRm para o tratamento alvo EGFR [20], [24] – [26]. No entanto, uma identificação clara dos quais biomarcadores deve ser utilizada em conjunto com

KRAS

na prática clínica ainda precisa ser definido. Isto porque nestas análises retrospectivas: a) diferentes determinantes foram avaliados em cada estudo; e b) uma sobreposição entre alguns desses biomarcadores podem ocorrer em pacientes individuais. No presente estudo, foi realizada a primeira análise mutacional abrangente de

KRAS, BRAF

, e

PIK3CA

, juntamente com a avaliação da expressão de PTEN em uma coorte de 132 pacientes tratados com mCRC.

resultados

Distribuição e sobreposição de alterações moleculares em tumores individuais

Conforme mostrado na Figura 1, a análise de tumores de uma coorte de 132 pacientes (para características clínico-patológicas, consulte a Tabela 1) levou à identificação de 104 alterações moleculares. Especificamente, detectamos 35

KRAS

mutações (26,5%), 11

BRAF

mutações (8,3%), 17

PIK3CA

mutações (12,3%) e 41 (out de 114 avaliáveis) perda de expressão de PTEN (36,0%). Mutações do

KRAS

ocorreu no códon 12 em 24 casos (68,6%) e no códon 13 em 10 casos (28,6%); uma mutação de ponto duplo envolvendo ambos os códons foi detectada em um caso (2,9%).

PIK3CA

mutações foram encontradas tanto no exão 9 (4 casos) ou no exão 20 (13 casos). As 11 mutações de

BRAF

foram todas as substituições V600E.

As mutações do

KRAS Comprar e

BRAF

ocorreu em um mutuamente exclusivos forma, enquanto foi observado um padrão de sobreposição entre outras alterações. As impressões digitais sobrepostas mais frequentes foram a perda de PTEN e

KRAS

mutações (co-ocorrendo em 13 pacientes), e

BRAF

e

PIK3CA

mutações (em 7 pacientes) (Figura 1)

Associação de variáveis ​​clínicas e resposta objectiva do tumor

Entre as variáveis ​​clínicas (ver Tabela 1), apenas toxicidade cutânea foi associada com resposta objetiva (teste de Wald:. p = 0,002; direção de response = 0-1-≥2). Outras variáveis ​​clínicas, incluindo sexo, local do tumor primário (cólon, junção sigmóide e reto, reto, outros sites), e idade não foram significativamente associados com a resposta tumoral objectiva (p = 0,491, 0,490 e 0,904, respectivamente; valores de p foram obtidos por o teste exato de Fisher para local e de género e pelo teste de Wald para a idade). Desde pacientes selecionados nesta coorte foram tratados com linhas mistas de regimes de quimioterapia anteriores (embora a grande maioria recebeu 2-3 linhas anteriores de tratamento, ver Tabela 1), também estudou a associação entre o número de linhas de quimioterapia anteriores e resposta tumoral objectiva , mostrando que esta variável não exerceu qualquer efeito (de Wald test: p = 0,536)

A análise multivariada de alterações moleculares e de resposta objectiva

A análise multivariada incluindo todas as quatro alterações moleculares (ajustado por cutâneo. toxicidade e número de linhas de quimioterapia anteriores) mostrou que apenas

KRAS

mutações e perda de expressão de PTEN estavam independentemente associados com a falta de resposta objectiva (p = 0,001 0,001, respectivamente) (Tabela 2). É importante ressaltar que o critério informativo Bayesian de acordo com Schwarz sugeriu que um modelo incluindo

KRAS

mutações e perda de expressão de PTEN foi geral a melhor estratégia na identificação de pacientes não-responsivos em nossa coorte.

análise multivariada das alterações moleculares e sobrevivência

a análise multivariada de Cox para oS confirmou que o papel da

KRAS

mutações e perda de PTEN foi significativa em conferir pior evolução clínica (HR = 1,72, p = 0,043 e HR = 0,54, p = 0,012, respectivamente), com também

BRAF

mutações exercer um efeito limítrofe prejudicial (HR = 2,31, p = 0,093). Quanto PFS, apenas a

KRAS

mutações foram associados com diminuição da sobrevida (HR = 1,65, p = 0,033), enquanto que nenhuma das outras alterações moleculares foi demonstrada a afectar de forma independente resultado clínico (Tabela 3).

analisa

multivariada das alterações moleculares e os resultados clínicos em pacientes com o tipo selvagem

KRAS

mCRC

a nossa coorte consiste de casos retrospectivos e, por esta razão, também

KRAS

pacientes mutados foram incluídos na análise. Após a decisão das autoridades de saúde para restringir o uso de cetuximab e panitumumab ao tipo selvagem

KRAS

mCRC [11] – [13], [28], este subgrupo tem conseguido maior relevância. Assim, nós nos concentramos nossa análise sobre o efeito da

BRAF

e

PIK3CA

mutações e perda de PTEN em 96 de tipo selvagem restante

KRAS

pacientes. Na análise multivariada, a perda de PTEN confirmou uma associação significativa com a falta de resposta (p 0,001), enquanto

BRAF

e

PIK3CA

não foram significativas (p = 0,265, 0,075, respectivamente) ( tabela 4).

análises

Sobrevivência mostrado na tabela 5 demonstraram que

BRAF

mutações (HR = 3,75; p = 0,015) e a perda de PTEN (HR = 0,43; p = 0,009 ), mas não

PIK3CA

mutações (HR = 1,20, p = 0,672), foram significativamente associados com a diminuição da OS, que nenhuma destas alterações foi significativamente associada com PFS.

Effect do número de alterações moleculares em resultado clínico

luz da ocorrência de alterações moleculares múltiplas no mesmo tumor, foi investigada a nossa coorte de pacientes que separam de acordo com o número efectivo de anormalidades moleculares no mesmo tumor, isto é, , nenhum

vs

1

vs

alterações ≥ 2. Porque o estado molecular de um marcador entre PTEN,

PIK3CA

e

BRAF

não foi determinado em 18 tumores, decidimos realizar esta análise nos 114 pacientes restantes.

A probabilidade de resposta foi de 51,1% (22/43) entre os pacientes sem alterações, 4,2% (2/47) com uma alteração, e 0% (0/24) com ≥ 2 alterações, e estas diferenças foram estatisticamente significantes (p 0,0001 pelo teste exato de Fisher). A Figura 2 mostra a distribuição do número de mutações no coorte e resposta à terapia alvo EGFR de acordo com o número de anormalidades moleculares dentro amostras tumorais individuais. O efeito prejudicial da acumulação de alterações também foi confirmado pelo modelo logístico, mostrando que, em média, um aumento unitário do número de alteração (s), significa uma redução na probabilidade de resposta de 96% (odds ratio = 0,04; p 0,00001). Tomados em conjunto, estas descobertas significam que uma condição necessária, mas não suficiente para alcançar a resposta objectivo é ter não mais do que uma das quatro alterações moleculares. Do mesmo modo, a sobrevivência análises mostraram que os pacientes apresentaram diferentes PFS e OS, dependendo do número de alterações moleculares em seus tumores. Figuras 3 e 4 mostram que PFS e OS estavam cada vez pior para nenhum, 1 ou ≥2 alterações moleculares (p = 0,0002 para ambos PFS e OS, teste logrank). Os testes de pares ajustado para comparações múltiplas documentados que uma pior evolução clínica foi observada em pacientes com tumores que carregam ≥2 alterações

vs

1 (p = 0,0198 e 0,0213 para PFS e OS, respectivamente) e ≥2

vs

nenhum (p = 0,0002 para ambos PFS e OS), mas não para pacientes com uma alteração

vs

nenhum (p = 0,3852 e 0,3807 para PFS e OS, respectivamente). PFS mediana foi de 2,8 meses (5,0, 2,8 e 1,7 para os pacientes abrigando nenhum, um ou ≥2 alterações, respectivamente); OS mediana foi de 9,4 meses (14,6, 9,3 e 7,3 para os pacientes portadores nenhuma, uma ou ≥2 alterações, respectivamente).

Os dados do grupo de pacientes com um estado molecular conhecido de todos os quatro marcadores.

dados da coorte de doentes com um nível molecular conhecido de todos os quatro marcadores.

Discussão

Apesar da recente recomendação da ASCO [28] e pelas autoridades de saúde na Europa [11], [12] e US [13] de

KRAS

testes como pré-requisito de diagnóstico para terapias cetuximab- ou à base de panitumumab alvo EGFR para CCRm, a taxa de resposta, quer destes fármacos é limitada a menos do que 20% no tipo selvagem

KRAS

pacientes [10], [14]. Dados recentes indicam que

BRAF

ou

PIK3CA

mutações podem contribuir para adicional de 20-30% de resistência [20], [25], [26]. Além disso, também PTEN tem sido proposta como um factor preditivo independente de eficácia cetuximab [24], [25], [27]. No entanto, a contribuição relativa e geral de cada uma dessas alterações moleculares para tomada de decisão clínica permanece incerta. Além disso, se e em que medida, a ocorrência de alterações moleculares múltiplas afeta resposta clínica e sobrevida dos pacientes é ainda desconhecida.

EGFR

copiar o número avaliado por FISH também foi sugerido para ser preditivo do resultado clínico para terapias alvo-EGFR [29] – [33]. No entanto,

EGFR

FISH para mCRC está passando por inter-laboratório normalização [30] e para evitar a introdução de elementos de confusão nos eleitos não realizar esta análise. Aqui, nós explorada a análise molecular abrangente de EGFR efectores a jusante para determinar seu papel na previsão da resposta /resistência ao cetuximab ou panitumumab em mCRC. Pela avaliação concomitante de quatro alterações moleculares, fomos capazes de identificar-se para 70% de pacientes que não responderam, um resultado que nunca foi alcançado antes. Notavelmente, apenas três pacientes com tumores que transportam uma única alteração foram no subgrupo de respondedores, (dois pacientes com

KRAS

mutações e um paciente com perda de expressão de PTEN), ao passo que outros não mostrou qualquer alteração ( “negativo quadruple “tumores). Isto sugere que anteriormente relatados casos desviantes, ou seja, casos muito raros de mCRC com

KRAS

mutações que respondem à terapia [9], [14], [29], [34] podem ser pacientes que abrigam apenas um deles molecular alterações, portanto, não simultaneamente desregulamentação tanto PI3K MAPK e.

Nossos dados indicam que as mutações únicas ou múltiplas de

KRAS

,

BRAF

, ou

PIK3CA

afetam desfavoravelmente o resultado clínico para cetuximab- ou terapias à base de panitumumab; no entanto, a possibilidade de que estas alterações moleculares pode ser biomarcadores prognósticos negativos independentemente a partir de terapias específicas devem ser tidos em conta. O estudo retrospectivo RASCAL realizado em 2721 pacientes com CCR indicou que a presença de

KRAS

mutações está associada com um risco aumentado de 26% do resultado fatal [35]. No entanto, dados conflitantes sobre o mesmo tema têm sido publicados recentemente. Em um ensaio clínico de fase III relatados por Karapetis et al. [14], o benefício clínico em pacientes com o tipo selvagem

KRAS

mCRC foi encontrada em pacientes tratados cetuximab, mas não em pacientes de controle tratados com melhores cuidados de suporte única, indicando assim que o benefício não foi devido a um efeito prognóstico de

KRAS

. Além disso, Roth et ai. [Proc Am Soc Clin Oncol gastrointestinais Cancers Symposium 206, 2009; Abstr 288] testou o valor prognóstico por estágio de

KRAS Comprar e

BRAF

mutações usando amostras de tumores CRC de julgamento PETACC3 o adjuvante, e eles não encontraram efeitos significativos na sobrevida livre de recidiva para ambas as mutações , nem na fase II, nem na fase III. Os estudos que avaliam o impacto de outras alterações moleculares em vez de

KRAS

mutações são limitadas. Quanto ao papel prognóstico do

PIK3CA Comprar e

BRAF

, em um estudo com 586 pacientes por Barault et al., Diminuição das taxas de sobrevida em 3 anos foram associados com mutações de pelo menos um gene Entre

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

[36]. Um relatório recente do Tol et al. descobriu que a presença da mutação BRAF V600E foi um marcador de prognóstico negativo em 516 pacientes com câncer colorretal metastático tratados com capecitabina, oxaliplatina, e com base bevacizumab regimes [37]. Finalmente, Ogino et ai. informou que, em uma série de 450 pacientes com estágio I-III CRC submetidos à cirurgia curativa, tumor

PIK3CA

mutação foi associada à sobrevida específica para o câncer mais curto. Tal efeito adverso do

PIK3CA

mutação no prognóstico foi consistente em mais estratos de preditores clínicos e tumorais de resultado para o paciente. Curiosamente, este efeito negativo foi limitado principalmente para pacientes com

KRAS

do tipo selvagem tumores [38]

Em conclusão, podemos documentar que a detecção concomitante de

KRAS, BRAF Comprar e

PIK3CA

mutações e avaliação de perda de expressão de PTEN em pacientes com CCRm tem implicações clínicas notáveis, aumentando a capacidade de prever o resultado para terapias alvo-EGFR. Em função da natureza da nossa série paciente, o indicador mais fiável sobre o valor preditivo de biomarcador (s) é a resposta objectiva do tumor. Interpretação de análises de sobrevivência deve realmente levar em conta uma possível limitação devido à pacientes tratados com linha mista anterior (s) da quimioterapia, incluindo um 10% (13/132) dos doentes tratados com o primeiro-line cetuximab em monoterapia. Por outro lado, o estudo de tais pacientes representa uma oportunidade única para determinar o valor preditivo de um determinado biomarcador sem a influência da quimioterapia, quer em paralelo ou anterior, bem como de selecção exercida por outros tratamentos. À luz destas considerações, propomos aqui um novo algoritmo para decidir o uso clínico de anticorpos monoclonais direcionados-EGFR que é baseado em taxas de resposta objectiva (Figuras 5 e 6). Esta nova abordagem merece validação em estudos prospectivos em terapias cetuximab- ou à base de panitumumab em mCRC antes de ter um impacto tão prática em mudança clínica. Importante, descobrimos que aproximadamente 20% do CCRm não-respondedores não abrigam mutações do

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

nem perda de expressão de PTEN e propomos definir esses tumores como “negativo quadruple”. A falta de resposta em doentes negativos quádruplos podem ser devido a várias razões, incluindo mas não limitado a: a) a sensibilidade limitada dos métodos de sequenciação correntes em detectar mutações pontuais no DNA extraído a partir de FFPE tumores [39]; b) a desregulamentação oncogênico dos mesmos quatro genes por outro mecanismo, em seguida, mutações (tais como a amplificação como relatado por

PIK3CA

); c) a ocorrência de alterações em outros elementos-chave da cascata de sinal dependente do EGFR (tais como, por exemplo, AKT e MAPK); e d) a presença de alterações genéticas em diferentes do EGFR receptores de tirosina-quinase, proporcionando uma via alternativa de sobrevivência e /ou proliferação. Mais dissecções moleculares da cascata de sinalização oncogénica iniciou-EGFR são susceptíveis de ser útil para melhorar a adaptação de EGFR alvo terapêuticas. No geral, nossos resultados sublinham a relevância do uso de algoritmos de base molecular para mudar o tratamento de tumores sólidos para a era da medicina personalizada do câncer.

A área marcada em cinza dentro da caixa de linha pontilhada descreve a hipótese gerada nesta estudo.

propomos definir como “quadruple negativa” a mCRCs falta alterações no

KRAS

,

BRAF

, PTEN e

PIK3CA

.

Materiais e Métodos

Ética declaração

as amostras foram coletadas de acordo com os requisitos e regulamentos éticos e obtenção de consentimento escrito como aprovado pelo conselho de revisão do Ospedale Niguarda Ca ‘Granda, Milano, Itália e do Ospedale San Giovanni, Bellinzona, Suíça.

população de doentes e regimes de tratamento

Foram analisados ​​retrospectivamente 132 pacientes com EGFR-positivo mCRC em Ospedale Niguarda Ca ‘Granda (Milão, Itália), no Centro de Oncogenomics, Institute for Cancer Research and Treatment, (Candiolo, Itália), ou no Instituto de Patologia (Locarno, Suíça). Pacientes deram consentimento informado e foram tratados com regimes panitumumab- ou à base de cetuximab no Ospedale Niguarda Ca ‘Granda ou no Instituto de Oncologia do sul da Suíça (Bellinzona, Suíça). Os pacientes foram selecionados com base em evidências de que o resultado do tratamento pode ser atribuído apenas à administração de panitumumab ou cetuximab. características clínicas dos pacientes estão apresentados na Tabela 1. Com a exceção de 13 pacientes que receberam cetuximab como monoterapia de primeira linha [5], os outros tinham falhado pelo menos um regime de quimioterapia. Vinte e três (17,4%) receberam monoterapia panitumumab, quinze (11,4%) pacientes cetuximab em monoterapia, e cetuximab noventa e quatro (71,2%) mais quimioterapia à base de irinotecano. Para os pacientes que evoluíram em quimioterapia à base de irinotecano, o cetuximab foi administrado com irinotecano com a mesma dose e horário a que eram resistentes. O tratamento foi mantido até doença progressiva (PD) ou toxicidade ocorreu, de acordo com critérios padrão [40].

Critérios

avaliação clínica e a resposta do tumor

A resposta clínica foi avaliada a cada 6-8 semanas com radiológica exame (CT ou MR) de acordo com os critérios RECIST. tumor respostas objetivas foram classificados em resposta parcial (PR), doença estável (SD) e PD. Os pacientes com SD ou PD também foram definidos como não-respondedores. A resposta à terapia também foi avaliada retrospectivamente por radiologistas independentes.

analisa Molecular

blocos de tumor fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) foram revistos para conteúdo de qualidade e tumor. Um bloco único representativo, tanto do tumor primário ou das metástases do fígado, dependendo da disponibilidade, contendo pelo menos 70% de células malignas, foi seleccionado para cada caso. O ADN genómico foi extraído utilizando o estojo QIAamp Mini (Qiagen, Chatsworth, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Análises moleculares foram realizados em amostra de tecido de tumor primário utilizado para o diagnóstico inicial em 130 de 132 casos. Em dois casos somente a análise foi realizada em locais metastáticos (do fígado).

expressão de PTEN

expressão da proteína PTEN foi avaliada por imuno-histoquímica em 3 mm secções de tecido FFPE como relatado [24] com algumas modificações . Resumidamente, anti-PTEN Ab4 (Thermo Fisher Scientific, CA, EUA) com 1:200 diluição e PTEN Ab2 (Neomarkers, Fremont, CA) com a diluição 1:50 foram usadas no Hospital Niguarda e do Instituto de Patologia de Locarno, respectivamente. a expressão da proteína PTEN foi detectada principalmente a nível citoplasmático, enquanto muito poucos casos também mostrou positividade nuclear. Os tumores foram considerados negativos, isto é, com a perda de expressão de PTEN, quando ausência ou redução da imunocoloração foi observado em mais de 50% das células em comparação com os controlos internos (isto é, células endoteliais vasculares e nervos). endométrio normal foi usado como controlo positivo externo. As avaliações foram realizadas por dois patologistas independentes, sem conhecimento dos dados clínicos ou resultados de análises moleculares.

A análise mutacional de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

em amostras de tumor

Temos procurado por

KRAS

(exão 2), para a

BRAF

(exão 15) e para

PIK3CA

(exons 9 e 20) mutações.

KRAS

exão 2 inclui códons 12 e 13,

BRAF

exão 15 inclui códon 600,

PIK3CA

exão 9 inclui códons 542 e 545 e

PIK3CA

exão 20 inclui codão de 1047, em que a grande maioria das mutações ocorrem nestes genes [29]. A lista de iniciadores utilizados para a análise mutacional está disponível a partir dos autores, mediante solicitação. Todas as amostras foram sujeitas a sequenciação automatizada pela ABI Prism 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Todos os casos mutados foram confirmadas duas vezes com reações de PCR independentes.

Análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​com os métodos estatísticos descritivos adequados, depois de verificar suas distribuições por meio do teste de Shapiro-Wilk. Tabulações cruzadas de variáveis ​​qualitativas foram analisadas com o teste exato de Fisher, enquanto as comparações entre as variáveis ​​contínuas foram realizadas com testes de Mann-Whitney U t de Student ou. A regressão logística com o teste de Wald, e regressão logística exata (lidando com one-way nexo de causalidade, tal como o caso em que todos os pacientes em um grupo de mostrar um resultado positivo ou negativo), com p-valor exato (como a probabilidade de observar um mais extremo valor com respeito a estatísticas suficientes para um determinado parâmetro de regressão) foram utilizados para avaliar análise uni e multivariada com desfecho binário. A análise de sobrevivência foi realizada com a função de sobrevivência de Kaplan-Meier, seguido pelo teste de logrank, e com o modelo de Cox; assunção de risco proporcional foi verificada com os resíduos de Schoenfeld. A significância estatística foi considerada para p 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Stata /SE 10.1 (a StataCorp, College Station, TX-EUA).

Reconhecimentos

Agradecemos Salvatore Artale para cuidados clínicos, Federico Pozzi para gerenciamento de dados, Carlo Zanon e Silvia Benvenuti para análise da sequência e gerenciamento de dados e Roberta Schiavo para a supervisão de amostras tumorais de aquisição.