Abstract

O activado AHR /ARNT complexo (AHRC) regula a expressão de genes alvo em cima exposição a contaminantes ambientais, tais como 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

p

-dioxin (TCDD). É importante ressaltar que a evidência mostrou que TCDD reprime estrogênio receptor (ER) a ativação do gene alvo através da AHRC. Nossos dados indicam que AHR e ARNT agir de forma independente um do outro em locais elemento de resposta não-dioxinas. Por isso, procuramos determinar as funções específicas de AHR e ARNT na sinalização dependentes de estrogénio no cancro da mama MCF7 humana e células de carcinoma endometrial ECC-1 humanos. Knockdown da AHR com siRNA anula repressão dioxina-inducible da transcrição de genes dependentes de estrogénio. Curiosamente, knockdown de ARNT não afeta a repressão mediada por TCDD da transcrição regulados por estrogénios, sugerindo que AHR reprime função ER independentemente ARNT. Esta teoria é suportada pela capacidade do modulador selectivo AHR 3 ‘, 4’-dimetoxi-α-naftoflavona (DiMNF) para reprimir a transcrição de estrogénio-indutível. Além disso, as células basais e transcrição activados-estrogénio dos genes que codificam

catepsina-D e

pS2 Quais são regulados negativamente em células MCF-7, mas up-regulamentada em ECC-1 em resposta à perda de ARNT. Estas respostas são espelhados no nível de proteína com catepsina-D. Além disso, knock-down de ARNT levou a alterações opostas, mas correspondentes na proliferação estimulada por estrogénio em ambos MCF7 e as células ECC-1. Obtivemos evidências experimentais demonstrando uma função repressor dependente de dioxina para AHR e uma função de co-ativador /co-repressor independente de dioxina para ARNT na sinalização estrogênio. Estes resultados nos dão uma visão mais aprofundada dos mecanismos de fator de transcrição crosstalk e alvos terapêuticos putativos em cancros estrogênio positivo

Citation:. Labrecque MP, Takhar MK, Hollingshead BD, Prefontaine GG, Perdew GH, Beischlag TV ( 2012) papéis distintos para Hidrocarboneto de Aril Receptor Nuclear Translocator e Ah Receptor na sinalização estrogênio-Mediated em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 7 (1): e29545. doi: 10.1371 /journal.pone.0029545

editor: Bernhard Ryffel, Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica, França |

Recebido: 24 Outubro, 2011; Aceite: 30 de novembro de 2011; Publicação: 03 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Labrecque et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Breast Cancer Foundation – BC /Yukon, as Ciências naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa para Dr. Beischlag, e um dos Institutos Nacionais de Saúde concede ES04869 ao Dr. Perdew. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

elucidar os mecanismos subjacentes a transcrição é crucial para a nossa compreensão de como as células e os organismos respondem a sinais fisiológicos e estímulos ambientais. O receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) e o translocador nuclear do receptor de hidrocarboneto de arilo (ARNT) são membros da família de base hélice-laço-hélice /PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) de proteínas e formar um factor de transcrição heterodimérica após ligação uma variedade de contaminantes ambientais, incluindo 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

p

-dioxin (TCDD) [1]. O activado AHR /complexo ARNT (AHRC) desempenha um papel-chave na carcinogênese e regula a expressão de

citocromo P4501A1

(

CYP1A1

) e de outros genes alvo xenobióticos para combater os efeitos de contaminantes ambientais [1 ]. Além disso, a AHR foi mostrado ser importante para o desenvolvimento normal e a homeostase fisiológica [2], [3], [4] e é essencial para certas funções da resposta imune, tais como a regulação das células T-helper de interleucina-17 produzindo [5] e a indução da citoquina interleucina-6 em células de cancro da mama MCF-7 [6].

Unliganded AHR existe no citoplasma como parte de um complexo multimérico, contendo duas moléculas de HSP90, HSP90 a co-chaperonas p23 , e vírus da hepatite B X-proteína associada 2 (XAP2) [7], [8], [9], [10]. Após a ligação ao ligando, a AHR transloca para o núcleo, onde se associa com ARNT para formar um complexo de factor de transcrição funcional, o AHRC. Como um complexo activado, o AHRC é capaz de recrutar proteínas reguladoras, tais como o receptor de esteróides coactivador-1 (SRC-1), ligação a CREB proteína (CBP /p300), NCOA2 /GRIP1 [11], [12], do receptor interactuantes -protein 140 (RIP140) [13], cacau [14], GAC63 [15], NcoA4 [16] e TRIP230 [17], que desempenham papéis importantes na determinação da actividade de transcrição do gene induzido por TCDD. Estes co-ativadores e co-repressores se incorporar complexos multiméricos que modificam a estrutura da cromatina, estabilizar núcleo maquinaria transcricional, e mediar o alongamento da cadeia de RNA [18]. Em adição a estes de transcrição co-activadores clássicos e co-repressores, a AHR é recrutada por outros factores de transcrição durante a transcrição, incluindo o receptor de estrogénio α (ERa) [11], [19], [20] e NF-kB [21] para modificar as suas actividades intrínsecas.

ERa /β são factores de transcrição activados de ligandos que pertencem à superfamília dos receptores de hormonas nuclear (NR) [22] e se ligam 17β-estradiol (E2) para regular os genes envolvidos em reprodução e o crescimento celular e proliferação [23]. Após a ligação ao ligando, forma um homodímero ER funcional e liga-se os seus elementos de resposta cognatos. Curiosamente, não é uma perturbação dependente do ligando recíproca entre ER e sinalização AHR. Por exemplo, ERa activado inibe a actividade da AHRC em

CYP1A1

através de interações proteína-proteína diretos, denominado

transrepress�

[11]. Por outro lado, as propriedades anti-estrogênicas da TCDD estão bem documentadas, uma vez que reprime os genes E2-induzíveis

pS2

e

catepsina-D (CAT-D)

[24], [25], [26 ]. No entanto, os mecanismos que ocorrem na repressão de genes E2-sensível não são claras. teorias propostas para essa repressão incluem: (i) a concorrência para um conjunto comum de co-ativadores [27]; (Ii) uma regulação direta de

CAT-D

transcrição através de elementos de resposta dioxina inibitórios a montante [28]; (Iii) activação de um factor de inibição de TCDD-indutível [28]; (Iv) um E3-ligase dependente do AHR que degrada proteínas cruciais para sinalização ER-[29], ou; (V) uma interacção directa entre transrepress� AHR e ER [11], [19].

Neste estudo, examinamos o papel da AHR e ARNT na transcrição de genes-alvo ERa-dependente na cancro da mama MCF7 humana e os ECC-1 linhas celulares de cancro do endométrio-cervical humanos. Nossos dados sugerem que AHR e ARNT agir independentemente uns dos outros sites em off-alvo e nós revelou que ARNT não é essencial para a repressão dependente de TCDD de ER-sinalização. Além disso, demonstrámos que ARNT actua como um coactivador específico de células em células MCF-7, e como um co-repressor em células ECC-1. Finalmente, mostramos que ARNT knockdown não só afeta a acumulação de ARNm e proteínas de genes ERa-alvo, mas também tem consequências fenotípicas, influenciando a proliferação de células ERa-mediada.

Resultados

AHR-dependentes repressão da sinalização de estrogênio no ECC-1 células

a presença de AHR, ARNT e ERa no

CYP1A1

potenciador dioxina-inducible ea E2-inducible

pS2

promotor tem já foi documentada em células MCF7 e outras linhas celulares de cancro da mama [11], [19], [20], [30]. Embora estudos preliminares identificaram ECC-1 células endometriais humanos como um sistema ideal para estudar perturbações dioxina de estrogênio sinalização [31], [32] Muito pouco se sabe sobre os papéis de AHR, ARNT e ER e suas respectivas interações nesta linha celular . Nós empregamos o ensaio chip para verificar o status dessas proteínas no

pS2

promotor e

CYP1A1

potenciador tanto na presença e ausência de E2 e TCDD. células ECC-1 foram tratadas com DMSO, 10 nM de E2, 2 nM TCDD ou de uma combinação de E2 e TCDD durante 45 min. Após ligação cruzada quimicamente proteína ao ADN com formaldeído, as células foram colhidas e sonicado. complexos DNA-proteína tosquiada foram precipitados com anticorpos específicos a Ahr, ARNT e ERa ou complexos, em seguida, foram isolados inversa reticulado e o ADN foi sujeito a amplificação por PCR. Consistente com as observações de outros pesquisadores em células de cancro da mama, observamos o recrutamento de AHR e ARNT na humana

CYP1A1

potenciador de uma forma dependente da TCDD e ERa foi muito enriquecido somente após o tratamento com uma combinação de 2 nM TCDD, e 10 nM de E2 (Figura 1A). Além disso, o recrutamento de ERa ao

pS2

promotor ocorre de forma E2-dependente, enquanto AHR e ARNT estão presentes após o tratamento com qualquer ligando, mas são enriquecidos durante a co-tratamento (Figura 1B).

cromatina ensaios de imunoprecipitação da

CYP1A1

potenciador (a) e as regiões

pS2

promotor (B) em células ECC-1 utilizando anticorpos dirigidos contra AHR, ARNT ou ERa. As células foram tratadas durante 45 min com DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) ou uma combinação de E2 e TCDD. (C e D) O papel funcional da AHR em transcrição mediada por TCDD. células ECC-1 foram transfectadas com ARNsi para qualquer GFP (siGFP) como um controlo negativo ou AHR (siAHR # 3 ou siAHR # 4) 24 h antes do ligando tratamento, em seguida, as células foram tratadas com DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) ou uma combinação de E2 e TCDD. Os níveis de ARNm para

pS2

(C) e

CYP1A1

(D) foram determinadas através de tempo real de RT-PCR e normalizada para a expressão de GAPDH constitutivamente activa. células (E) ECC-1 foram transfectadas com siRNA de a AHR e colhidas para lisados ​​de células inteiras para análise Western Blot dos níveis de proteína AHR, ERa e XAP2.

Nós temos mostrado previamente que os associados ERa com a AHRC para mediar transrepress� dependente de estradiol de dioxina-inducible transcrição de genes [11]. Portanto, partimos para determinar o significado funcional da AHR na transcrição do gene estrogênio-inducible. Nós transfectadas células ECC-1 com RNA inibitório pequena voltados para tanto AHR (siAHR) ou um controlo negativo GFP (siGFP). Após a transfecção, as células foram privadas de soro durante 24 h, seguido de 24 h de tratamento ligando e, em seguida, colhidas para o ARNm total que foi quantificada por meio de PCR quantitativa. Como esperado, a ablação de AHR e co-tratamento com 2 nM de TCDD, e 10 nM de E2 resultados na perda de repressão induzida por TCDD de

pS2

transcrição (Figura 1C). No entanto, a perda de AHR não teve nenhum efeito mensurável sobre o basal, ou estrogênio ativado

pS2

acumulação de mRNA. Como um controlo para a especificidade de ARNsi, transferências de Western de proteínas AHR mostram uma expressão muito reduzida de proteína após a transfecção e a AHR proteína inalterados os níveis de ERa e XAP2 que serviu como um controlo de carga (Figura 1E). Estes demonstram a especificidade dos siRNA de a Ahr, e que a perda de AHR não afecta a acumulação de volume de negócios ou de níveis de proteína ERa basais. Além disso, a indução de

CYP1A1

transcrição com TCDD após AHR knockdown é atenuado, quando comparado com o controlo negativo siGFP (Figura 1D). Assim, a AHR é um requisito para a repressão induzida por TCDD de transcrição do gene E2 de resposta e o aumento da resposta transcricional com o tratamento combinatória é unicamente devida à perda de AHR e outros modificadores de transcrição putativos associados com a sua presença. Por fim, obtivemos resultados essencialmente idênticos em ambos os MCF7 e linhas celulares ECC-1 sob condições ou soro despojado de carvão sugerindo que privadas de soro diferenças na capacidade das linhas de células ‘para percorrer ciclo celular não afeta este fenómeno. Em conjunto, estes resultados suportam o conceito de que a linha celular ECC-1 é um excelente modelo para estudar célula alternativa perturbação induzida por dioxina de sinalização do receptor de estrogénio.

ARNT tem funções celulares específicas co-activador /co-repressores

a identificação de ARNT como um co-activador na sinalização de estrogénio [27], [30], justapostos com os efeitos transrepressor conhecidos de TCDD, levou-nos a investigar o papel desempenhado por ARNT em trans repressão mediada por TCDD de ER função de várias linhas celulares de cancro humano, ou seja, células MCF7 e ECC-1. Através siRNA dirigido para ARNT e um controle negativo mexidos (siSCX), e subsequente análise qPCR de endógena

pS2

e

CAT-D

transcrição do gene, fizemos várias observações interessantes. Em primeiro lugar, ARNT exibe propriedades de co-repressor em células ECC-1. Acumulação de

pS2

(Figura 2A) e

CAT-D

níveis (Figura 2B) de mRNA são exacerbados durante os tratamentos E2 após a perda de ARNT sugerindo uma função específica celular para ARNT independente da AHR. Além disso, observou-se este fenómeno com três siRNAs dirigidos para ARNT separados (de 1 e 3 siRNA são mostrados na Figura 2A, B e C). Utilizou-se pelo menos duas siRNA é para todos os outros parâmetros experimentais com resultados essencialmente idênticas, mas por questões de brevidade, futuramente nós só apresentam dados que descrevem o uso de um siRNA. Em segundo lugar, consistente com os resultados de vários outros investigadores, ARNT exibido propriedades co-activador em células MCF7 [27], [30]. Na verdade, knockdown de proteína ARNT amortece a transcrição induzida por E2 de

pS2

(Figura 2C) e

CAT-D

(Figura 2D). Finalmente, através de uma experiência de resposta à dose, observou-se uma diminuição concomitante dos níveis da proteína CAT-D com concentrações crescentes de TCDD em ambos ECC-1 e as células MCF7 (Figura 2E). Estes dados indicam que a função ARNT no que se refere à sinalização ER é provável ditada por outros factores específicos do ambiente celular.

ECC-1, células (A e B) e as células MCF7 (C e D) foram transfectadas com quer mexidos siRNA (siSCX) ou siARN direccionado para ARNT (siARNT # 1 ou # 3 siARNT). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com veículo (DMSO), E2 (10 nM), TCDD (2 nM) ou uma combinação de E2 e TCDD. A expressão de genes foi determinada por em tempo real de RT-PCR após o isolamento e transcrição reversa do RNA total.

CAT-D Comprar e

pS2

expressão foram normalizados para a expressão do gene 36B4 constitutivamente ativo. (E) Análise de mancha de Western dos níveis da proteína CAT-D em células MCF7 e ECC-1. As células foram tratadas com DMSO ou E2 (10 nM) e concentrações variáveis ​​de TCDD (10 horas, 50 horas, 100 horas, 500 pM, 1 nm ou 5 milhas náuticas). Após 24 horas de tratamento, os lisados ​​de células inteiras foram colhidas, e Western blot foram realizados usando anticorpos dirigidos contra CAT-D e α-tubulina. As barras de erro representam ± S.D. * P . 0,05

Para determinar se a modulação da atividade transcricional traduzido em perfis de expressão de proteínas semelhantes, usamos análise de Western blot para visualizar o nível de proteína CAT-D após ARNT knockdown. As células foram transf ectadas e ligando tratada sob condições idênticas, como os parâmetros de qPCR. Quando comparado com o controlo negativo mexidos, a expressão da proteína CAT-D após tratamento E2 é exacerbado em células ECC-1 com ARNT knockdown (Figura 3A). Por outro lado, as células MCF7 transfectadas com ARNsi ARNT resultou numa expressão de CAT embotada da proteína D-E2 durante o tratamento (Figura 3C). Além disso, os níveis de ERa permaneceu consistente, independentemente do status ARNT (Figura 3A e C). Mais importante ainda, a repressão induzida por dioxina da sinalização ER foi mantida ao nível da proteína após ARNT knockdown (Figura 3A e C). Os blots representativos foram normalizados para a-tubulina e a luminescência foi medida usando o software GeneTools 4.01.2 (Syngene). Estes valores normalizados mostraram uma indução de duas vezes da CAT-D em células ECC-1 com ARNT knockdown após o tratamento E2 (Figura 3B, colunas 2 e 6), enquanto que em células MCF-7, knock-down de ARNT resultou em uma diminuição de 40% na expressão de CAT D-E2-dependente (Figura 3D, colunms 2 e 6). Estes resultados fornecem evidência concreta de que o nível de expressão da proteína espelha a resposta transcricional em ambas as linhas celulares e que as consequências fisiológicas deve resultar na perda de ARNT.

ECC-1 (A e B) e MCF7 (C e D células) foram transfectadas com qualquer um ou siSCX siARNT ligando e tratados como descrito na Figura 2. (a e C) Western blots representativos de ARNT, CAT-D, ERa e os níveis de proteína alfa-tubulina. Os gráficos de barras de níveis de proteína CAT-D em células ECC-1 (B) e MCF7 (D) após a normalização para valores de luminescência a-tubulina. barras abertas representam tratamentos ligando após siRNA para o controle mexidos negativo (siSCX) e fechada (preto) barras representam tratamentos ligando após siRNA para ARNT (siARNT). As experiências foram realizadas três vezes com resultados essencialmente idênticos.

Estes resultados surpreendentes foram acoplados com a observação de que a repressão induzida por TCDD de ER-sinalização é mantido em ambas as linhas celulares após ARNT knockdown (Figura 2 e 3 ) assim fornecendo prova de que ARNT não é necessária para a repressão de TCDD /AHR-dependente da sinalização de ERa. Esta hipótese é suportada pela capacidade de um modulador selectivo do receptor de hidrocarboneto de arilo (SAHRM) para reprimir a sinalização de estrogénio. Foi examinada a capacidade do SAHRM conhecido, DiMNF [33], [34] para reprimir a transcrição de E2 mediada por RT-PCR em células MCF7 e ECC-1 (Figura 4). DiMNF foi tão eficaz em reprimir a acumulação de mRNA CAT-D como TCDD. DiMNF é um potente antagonista de AHR e desloca eficazmente TCDD do receptor AT 1 fiM [34]. Além disso, DiMNF falha para induzir a formação de elemento de resposta a AHR-ARNT-dioxina num ensaio de desvio de mobilidade electroforética, o que sugere que a AHR-ARNT dimerização pode não ocorrer [34], Deste modo, parece provável que a função transrepressão do AHR é inteiramente ARNT-independente.

O efeito do 1? M DiMNF na expressão CAT-D E2-inducible em MCF7 e as células ECC-1. As células foram tratadas com os ligandos indicados durante 24 h antes do isolamento do ARN. A expressão de genes foi determinada como descrito acima. As barras de erro representam ± S.D. * P . 0,05

Arnt causas knockdown aumento da proliferação em células ECC-1 e a proliferação diminuída em células MCF7

Sensibilidade ao estrogénio tem sido associada a proliferação e transformação das células em ER- células de carcinoma positivo [35]. Para estabelecer se ARNT pode influenciar a proliferação celular E2-dependente, realizamos ensaios de proliferação em ECC-1 e células MCF-7 depois do tratamento ARNT siARN. Consistente com nossa PCR quantitativa e ocidentais dados blot, as células MCF7 e ECC1 exibida taxas alterados de proliferação depois de ARNT knockdown em comparação com células transfectadas com o ARNsi de controlo negativo mexidos (Figura 5A e B). Knockdown de ARNT foi monitorizado durante 72 h e o knock-down significativa observada foi essencialmente inalterada em cada ponto de tempo (Figura 5C). Nem a linha de células exibido padrões de crescimento alterados até o ponto de tempo de 48 horas. Às 48 horas, as células ECC-1 em ambas as condições siSCX e siARNT mostraram proliferação em resposta modesta aos tratamentos E2. No ponto de tempo de 96 horas, houve um aumento altamente significativo na proliferação E2-indutivel de células ECC-1 tratadas com siARNT, em comparação com células de controlo tratadas mexidos. Curiosamente, ARNT knockdown aumentou as taxas de crescimento da base e causou uma resposta exacerbada a E2 com o número de células quase dobrando nos tratamentos siARNT E2 em comparação com os tratamentos siSCX E2. Por outro lado, as células MCF-7 mostraram uma taxa de proliferação celular diminuiu após ARNT knockdown (Figura 5B). As taxas de crescimento não eram significativamente diferentes, até o ponto de tempo de 48 h, quando a resposta proliferativa E2-induzível no controlo negativo mexidos foi aparente. As células transfectadas siARNT teve uma resposta de crescimento blunted durante tanto condições E2 controle e. Em 96 horas, as células começaram a perder sensibilidade ao E2 e entrou em um estado de senescência. Seja ou não este foi devido às condições de crescimento não é clara. No entanto, estes dados suportam ainda mais a hipótese de que ARNT tem propriedades de co-repressor em células ECC-1 e propriedades de co-activadores em células MCF7. Além disso, a sensibilidade à E2 e as respostas de crescimento recíproca exibidas pelas duas linhas de células são consequências fenotípicas bona fide de ARNT ablação.

ECC-1 (A) e MCF7 (B) As células foram transfectadas quer com ou siSCX siARNT durante 6 horas, em seguida, tratadas com tripsina e re-semeadas a 10000 células /poço em placas de 12 poços. Vinte e quatro horas após a sementeira, as células foram tratadas com DMSO ou E2 (10 nM) e as contagens de células foram conduzidas a 0, 48 e 96 horas após os tratamentos com um Fuchs-Rosenthal câmara de contagem. No ponto de tempo de 48 h, as células foram tratadas uma segunda vez com 10 nM de E2. As experiências foram efectuadas em triplicado e cada ensaio foi contada três vezes. (C) Análise de Western blot de ARNT após siRNA knock-down revela que significativa knock-down foi alcançado e persiste ao longo de um período de 72 h. As barras de erro representam ± S.D. * P . 0,05

Discussão

Muitos contaminantes ambientais que servem como activadores do receptor de hidrocarboneto aromático são conhecidos como compostos de desregulação endócrina putativos. A exposição a muitos destes compostos ocorrem numa base diária e representa riscos significativos para a saúde humana. Em particular, os efeitos repressivos induzidos por ligandos da AHR em sinalização ER têm sido bem documentadas [11], [19], [36], [37], [38]. Outros relatórios descreveram o potencial de co-activador de ARNT mediada por ER-transcrição [27]. Apesar do crescente corpo de evidências para apoiar papéis para AHR e ARNT em função ER, pouco se sabe sobre o papel fisiológico normal dessas proteínas como eles se relacionam com a sinalização de estrogênio ou os determinantes moleculares de transrepress� induzida por substâncias tóxicas da função ER pela AHR. Finalmente, esta investigação revelou que ARNT não é essencial para AHR-mediada transrepress� fora do alvo. Para delinear os mecanismos moleculares transrepress� mediada por AHR subjacente buscou-se desacoplar função AHR e ARNT em linhas de células humanas de câncer ER-positivo. Ao fazê-lo, descobrimos que ARNT atenua activado transcrição do gene ER-alvo em células ECC-1, em contraste direto com a sua função de co-ativador descrita em células MCF-7 [27].

ARNT foi originalmente identificado como um fator de bona fide transcrição [39] e parceiro de dimerização do AHR [40]. Além de sua função fator de transcrição canônica, ARNT pode interagir com vários outros fatores de transcrição, incluindo ERa [11] e sua função co-ativador para a sinalização ER foi bem descrito [27], [30]. Portanto, espera-se que knockdown de ARNT em ECC-1, células de cancro do endométrio-cervical iria resultar numa diminuição da expressão do gene alvo ER. O aumento resultante na acumulação de ARNm, a expressão de proteínas e a proliferação E2-indutível sugere fortemente que ARNT actua como um co-repressor transcricional nesta linha celular. O mecanismo (s) molecular subjacente às diferenças observadas em células MCF7 e ECC-1 provavelmente está relacionada com diferenças na natureza e composição da maquinaria transcricional auxiliares recrutados por ARNT em cada linha celular. ARNT apresenta vários domínios de interacção proteína-proteína diferentes para o recrutamento de proteínas co-activador, incluindo um domínio carboxi-terminal de transactivação [18], a sua região PAS-B [41] e o seu domínio de hélice de base de ciclo-hélice [12] . Além disso, uma associação entre a ARNT e a proteína co-repressor de transcrição, SMRT tem sido demonstrada [42]. No entanto, nós acreditamos que esta é a primeira demonstração de que tem funções ARNT co-activador /co-repressores dupla de uma forma específica de células (Figura 6). Além disso, as repercussões desses efeitos de transcrição pode ser observado nos níveis de translação e fenotípicas.

A presença de E2 facilita a montagem de modificadores de transcrição que induzem a transcrição de genes E2-responsivos. AHR ligando activada reprime ER-sinalização independente de ARNT. A perda de ARNT em células ECC-1, onde actua como um co-repressor, leva ao aumento da sensibilidade à E2 e o aumento da actividade transcricional de genes regulados ER. A perda de células MCF7 ARNT em, onde actua como um co-activador, leva à diminuição da sensibilidade à E2 e diminui a actividade de transcrição de genes regulados ER.

Vários modelos têm sido propostos para explicar a moleculares mecanismos subjacentes factor de transcrição mediada por conversa cruzada, particularmente a capacidade de um factor de transcrição para reprimir a função de uma outra [18]. Reugg e colegas, entre outros, sugeriram que a transcrição mediada pelo factor de trans repressão pode ser o resultado da competição por um conjunto limitado de proteínas co-activador [27]. No entanto, a identificação de ARNT como um co-repressor em células ECC-1 desmascara um mecanismo mais complexo de trans genes em E2-indutíveis, em seguida o modelo de competição co-activador sugere. Enquanto esses dados não definitivamente refutar este modelo, acreditamos que nossos dados sugerem que é improvável porque a concorrência co-activador não pode explicar a repressão TCDD-inducible em células ECC-1 como AHR activado deve silenciar função de co-repressor da ARNT. Além disso, ARNT, uma proteína que tem demonstrado a capacidade de recrutar numerosos co-activadores [12], [15], [17], [41], [43], [44] deve ilícito um efeito semelhante ao ligando-activada AHR se piscinas co-ativador se encontravam em tal oferta limitada que a concorrência iria dificultar função de fator de transcrição individual. Isto claramente não é o caso na linha celular ECC-1.

A evidência experimental apresentada acima indica que a AHR não requer ARNT para mediar a sua transrepressor efeitos fora do alvo. Perda de ARNT tanto em MCF7 e as células ECC-1 não conseguiu revogar os efeitos repressivos do TCDD sobre a expressão de transcrição e proteínas E2-inducible (Figuras 2 e 3). Os efeitos DiMNF-bound AHR são independentes do elemento de resposta de ligação dioxina como extracto nuclear das células tratadas com DiMNF não retardar o movimento de um elemento de sonda marcada resposta dioxina em ensaios de desvio de gel [34]. Além disso, a AHR-ARNT dimerização é um requisito para a ligação do DNA, sugerindo que este não pode ocorrer na presença de DiMNF. Isto representa uma mudança de paradigma na nossa compreensão da função AHR e tem implicações para o uso ea eficácia de moduladores seletivos AHR. Com efeito, um novo antagonista AHR provou ser um potente estimulador da expansão de células estaminais AHR-dependente [45]. Assim, antagonistas que não provocam a AHR-ARNT dimerização pode ser repressores mais eficazes do que os agonistas de ER função puros como a AHR não iria ser reprimido por ligação ARNT. O sarhm DiMNF é um repressor dependente de AHR potente da citocina [33], [34]. Além disso, foi eficaz na DiMNF reprimir a expressão do gene alvo regulada-ER (Figura 4). estudos de modelagem molecular demonstrar que DiMNF forma uma ligação de hidrogênio extra com AHR em Thr289 [34], uma característica não compartilhada com o agonista parcial α-naftoflavona sugerindo que o DiMNF-AHR adota uma confirmação único. Assim, os flavonóides representam uma classe de compostos que podem ser alvos atraentes para mais testes e desenvolvimento para determinar os seus efeitos na expressão do gene alvo ER.

Nossa evidência experimental demonstra uma função repressor dependente de TCDD para AHR e uma TCDD /função de co-ativador /co-repressor AHR-independente para ARNT na sinalização estrogênio. Estes resultados nos dão uma visão mais aprofundada dos mecanismos de fator de transcrição crosstalk e alvos terapêuticos putativos em cancros de estrogênio positivo. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem um mecanismo mais complexo da função ARNT e transrepress� AHR-mediada da ER-sinalização do que o sugerido anteriormente. A utilidade clínica destes resultados continua a ser testado e será objecto de futuras investigações.

Materiais e Métodos

Materiais e cultura celular

3 ‘, 4’- dimetoxi-α-naftoflavona (DiMNF) foi obtido comercialmente (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ). células ECC-1 e MCF-7 (ATCC) foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; BioWhittaker, Lonza,) com soro de bovino fetal a 10% (FBS; Hyclone, Perbio, Thermo Fisher Scientific Inc.) e suplementado com 100 unidades /ml potássio penicilina-100 ug /ml de sulfato de estreptomicina (BioWhittaker, Lonza) a 37 ° C, 20% de O

2, e 5% de CO

2. Vinte e quatro horas antes de qualquer perturbação experimental, as células foram lavadas 2 × com PBS, e mantida em meio Fenol-Red-livre sem FBS [46].

ensaios de imunoprecipitação da cromatina.

imunoprecipitação da cromatina (chip) Os ensaios foram realizados como descrito previamente por [17]. Resumidamente, as células foram semeadas em 150 cm

2 pratos e privadas de soro 24 h antes do tratamento. O tratamento de células foi feita em meio isento de soro suplementado com 3 mg /mL de albumina de soro de bovino durante 45 min. complexos de cromatina foram quimicamente reticulados utilizando formaldeído a 1% /solução de 0,7 mol /L de HEPES (concentração final), pH 7,8, e os complexos foram sonicados para produzir fragmentos de ADN de 200-900 pb de tamanho. Os complexos foram pré-aclarados com proteína A resina de agarose (Calbiochem) e incubadas durante a noite com anticorpos específicos ERa [policlonais de coelho ou ARNT policlonal de cabra (Santa Cruz) ou policlonais de coelho AHR descrito anteriormente [47]. imunoadsorvido complexos foram capturados em proteína A agarose de resina e lavou-se duas vezes com 0,5 × RIPA, seguido por três lavagens com 10 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mmol /L de EDTA. As amostras foram eluídas fora da resina utilizando 100 mmol /L de NaHCO3 e SDS a 1%, e ligações cruzadas foram invertidos a 65 ° C durante a noite. As amostras foram extraídas e precipitou-se com EtOH a 70% e Pellet Paint (Novagen) fenol-clorofórmio. Imuno-adsorvido ADN foi analisada por PCR. Primers para o

CYP1A1

intensificador e promotor pS2 foram descritos anteriormente [20], [48].

Transient transfecções

MCF7 e as células ECC-1 foram cultivadas na condições descritas acima, até aproximadamente 70% confluentes antes da transfeco de siARN. As células foram transfectadas quer com Proteína Fluorescência verde (GFP) siRNA (Dharmacon), mexidos (SCX) siRNA (DS mexidos siRNA controlo negativo, Integrated DNA Technologies Inc.), AHR siRNAs (Dharmacon) ou ARNT siRNAs (Integrated DNA Technologies Inc., Cat. No. HSC.RNAI.N187426.11.1, HSC.RNAI.N178426.11.2, HSC.RNAI.N178426.11.3; siARNT 1, siARNT 2 e siARNT 3, respectivamente). As células foram transfectadas com 10-15 nM de ARNsi utilizando 0,3% (v /v) Trifectin (Integrated DNA Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram deixadas a incubar na mistura de transfecção durante 6 h a 37 ° C, e 5% de CO

2 após o que a mistura de transfecção foi removido e substituído com meio isento de soro.

A transcrição reversa e Real- PCR em tempo

a transcrição reversa e PCR em tempo real foram realizados como descrito anteriormente [11]. Em resumo, as células foram tratadas quer com DMSO (Me

2SO), TCDD (2 nM), E2 (10 nM), ou uma combinação de TCDD e E2, durante 24 h.