Abstract

O cancro do cólon é uma das neoplasias malignas mais comuns em todo o mundo, mas as abordagens terapêuticas atuais para o câncer de cólon avançado são menos eficientes. Este estudo investigou as associações entre a expressão do fator de transcrição nuclear SOX4 e vários parâmetros clínico-patológicas, bem como a sobrevida dos pacientes. Os níveis de expressão de SOX4 nuclear foram analisados ​​por imuno-histoquímica; os dados composta por tecidos de cólon de 263 pacientes com câncer de cólon. Emparelhado

t

testes foram utilizados para analisar as diferenças na expressão SOX4 nuclear entre tecidos tumorais e não tumorais de cada paciente. Dois-atado Χ

2 testes foram realizados para determinar se as diferenças na expressão SOX4 nuclear e os parâmetros clínico-patológicas foram significativas. endpoints Time-to-evento para os parâmetros clínico-patológicas foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier, ea significância estatística foi determinada por meio de testes de log-rank univariadas. Cox modelo de riscos proporcionais foi usado para a análise multivariada para determinar a independência dos efeitos prognóstico da expressão SOX4 nuclear. Superexpressão de SOX4 nuclear foi significativamente correlacionada com profundidade de invasão (

P

= 0,0041), metástases à distância (

P Art 0,0001), e estágio (

P = 0,0001

). Os pacientes que apresentaram elevados níveis de expressão de SOX4 nuclear alcançado uma taxa de sobrevivência significativamente mais pobres livre de doença, em comparação com pacientes com baixos níveis de expressão SOX4 (

P Art 0,001). A análise de regressão univariada de Cox mostrou que a superexpressão de SOX4 nuclear era um marcador de prognóstico claro para o cancro do cólon (

P

= 0,001). A sobre-expressão de SOX4 nuclear pode ser utilizado como um marcador para prever o resultado de doentes com cancro do cólon

citação:. Lin C-H, Fang C-G, Hseu Y-C, Chen C-G, Wang J-W, Hsu S-L, et al. (2013) as implicações clínicas e prognósticos da Fator de Transcrição SOX4 em doentes com cancro do cólon. PLoS ONE 8 (6): e67128. doi: 10.1371 /journal.pone.0067128

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 21 de março, 2013; Aceito: 14 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Chi Mei Medical Center (Grant No. 101cm-TMU-03) (https://www.chimei.org.tw). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon é um dos cancros mais frequentes e uma causa comum de mortes relacionadas ao câncer [1]. Em Taiwan, o cancro do cólon classifica como a neoplasia maligna mais frequentemente diagnosticado e provoca mais de 4900 mortes por ano (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; acessado em setembro de 2012). Apesar das técnicas cirúrgicas atuais e quimioterapia que fizeram melhorias significativas, devido ao mau prognóstico e invasão distante e migração, a incidência global de câncer de cólon é de aproximadamente 5% ea taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com câncer de cólon é muito baixa [2]. Assim, a identificação de novos alvos para o desenvolvimento de tratamentos não-convencionais é urgente e vai tirar proveito do progresso na compreensão ampla e profunda da patogênese molecular de câncer de cólon.

Entre os marcadores prognósticos agora disponível para cancro do cólon, o mais importante é o Comité Misto americana do câncer (AJCC) estágio determinado pela profundidade de invasão, o envolvimento dos gânglios linfáticos e metástases à distância. No entanto, o prognóstico varia até mesmo entre pacientes no mesmo estágio. Em décadas recentes, vários estudos têm sugerido que alterações genéticas podem desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do cancro do cólon [3], [4]. Estudos em patologia molecular pode ajudar na compreensão da patogênese da doença e também pode revelar marcadores moleculares de prognóstico úteis. Alguns marcadores de prognóstico biológicos sugeridas incluem a sobre-expressão da proteína cinase CK2, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), intensificador de homólogo de zeste 2 e transglutaminase 2 [5] – [8].

Nos seres humanos, a região determinante do sexo Y (SRY) caixa de família, também referida como a família SOX, compreende 20 factores de transcrição altamente conservadas que desempenham papéis importantes no desenvolvimento. Estes factores de transcrição são definidos por uma sequência de assinatura conservado no domínio de ligação de ADN grupo de alta mobilidade (HMG) (DBD) [9], [10]. SOX4 é uma proteína de 47 kDa que é codificada por um único gene exão, que é altamente conservada em vertebrados. Em ratinhos, SOX4 é especificamente expresso no ovário, testículo, glândula mamaria, e o timo e em linhas de células linfocíticas de pré-B de rato [11] e t. Além disso, SOX4 é essencial para o desenvolvimento do coração, linfócitos, e timócitos, e ratinhos SOX4-nulo morrem de defeitos cardíacos [12]. A capacidade proliferativa das células progenitoras de células-B é severamente reduzida em células de ratinhos knockout SOX4 [13].

A importância clínica de SOX4 ganhou atenção crescente nos últimos anos, com numerosos relatos sugerindo que SOX4 pode contribuir para tumoral progressão. Três estudos independentes triagem para oncogenes importantes mostrou que SOX4 é freqüentemente alterada através de inserções retrovirais [14] – [16]. O vírus da leucemia murina tipicamente SOX4 alvo, e estabilizado a mensagem SOX4 para produzir os linfomas de células B que exibiu um aumento dos níveis de mensagem SOX4 [16]. O aumento da expressão SOX4 está associada com tumores da bexiga, da próstata, do pulmão e com tumores não-pequenas células [17] – [19]. No entanto, o papel de SOX4 em tais tumores não está totalmente compreendida e os dados relatados demonstram certos contradições. Considerando SOX4 knockdown resultou na apoptose das células de carcinoma adenóides císticos ACC3, SOX4 superexpressão promovido paragem do ciclo celular e a apoptose de células de carcinoma do cólon HCT116 [20], [21]. O microRNA (miRNA) miR-335 inibiu a invasão de células metastático e deliberado, pelo menos em parte, por meio de segmentação

sox4

e seu alvo putativo

TNC

, que codifica um componente da matriz extracelular implicado na célula migração [22]. Por outro lado, quanto maior for o nível de expressão SOX4, melhor o prognóstico para pacientes com meduloblastomas e outros tipos de tumores [23]. Assim, SOX4 podem exercer diferentes efeitos sobre as células tumorais, dependendo do contexto e do mecanismo de primeira transformação; mais estudos são necessários para esclarecer esta questão.

Até o momento, o significado prognóstico dos níveis de expressão SOX4 nuclear em câncer de cólon humano não foi estabelecida. Este estudo investigou as associações entre a expressão SOX4 nuclear e os parâmetros clínico-patológicas, e avaliou a importância da SOX4 nuclear em predizer o prognóstico para pacientes com câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o conselho de revisão institucional a Chi Mei Medical Center aprovou o protocolo de aquisição de tecidos para o estudo imuno-histoquímica e immunoblotting. consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante antes da aquisição de tecidos.

Os participantes e amostras

Foram coletados 263 casos de câncer de cólon consecutiva a partir dos arquivos médicos de Chi Mei Medical Center, em Taiwan. Todos os pacientes incluídos no nosso grupo de estudo foram tratados entre 1998 e 2005, e tinha recebido colectomia com dissecção de linfonodos. Todos os casos tem provas de tecido de adenocarcinoma via biópsia colonoscopic antes da operação. Completude da ressecção cirúrgica foi realizada em todos os casos, e exame anatomopatológico revelou nenhum envolvimento tumor das margens de ressecção em espécimes cirúrgicos. Nenhum dos nossos pacientes do estudo tinham recebido quimioterapia e /ou radioterapia pré-operatória. A porção não-tumor foi obtida a partir de mucosa do cólon normal, grosseiramente, separado a partir do tumor, a partir de amostras do cólon ressecados. parâmetros clínico-patológicas de câncer de cólon foram determinados de acordo com a classificação AJCC. A duração de follow-up para a sobrevivência livre de doença foi definida como o período entre a data da operação e no dia de recaída, de acordo com a ficha do paciente. Para cada paciente, foram analisados ​​um par de tecidos de tumor do cólon e de não tumor, para determinar a expressão SOX4 nuclear.

Análise imuno-histoquímica

SOX4 expressão nuclear foi analisada por imuno-histoquímica. blocos de tecido embebidos em parafina foram seccionados a 5 ^ M e transferidas para lâminas de microscópio (Muto Puré Chemicals Co. Ltd., Tóquio, Japão). O tecido mamário foi usada como um controlo positivo para SOX4. O controlo negativo implica a omissão do anticorpo primário e incubação com solução salina de tampão fosfato. Os cortes foram desparafinados com xileno, seguido de reidratação em álcoois graduados. secções desparafinadas foram incubadas em tampão de pH 6,0 de citrato de 40 min a 95 ° C numa placa de aquecimento para recuperar antigénios. Além disso bloqueio antigénio foi realizada utilizando uma solução de Dako REAIS Peroxidase-bloqueio (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) durante 5 min. As lâminas foram subsequentemente incubados com o anticorpo primário: policlonal anti-SOX4 (Tempo de vida, Victoria, Canadá) durante 1 hora à temperatura ambiente, a uma diluição de 1:3200. Detecção da coloração imunorreactivo foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina-peroxidase de acordo com as instruções do fabricante. Foi utilizado um sistema sensível Dako REAIS EnVision Detection (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Após incubação com diaminobenzidina durante 5 minutos, as secções foram contrastadas com hematoxilina e montadas em Dako Faramount aquosa Meio de Montagem (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) para a interpretação microscópica. Imunorreatividade foi semiquantitativa marcou com base na intensidade da imunomarcação: 0, sem coloração; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; 3, de coloração forte. Seções com uma pontuação de 0 ou 1 exibida baixa expressão de SOX4, enquanto que aqueles que marcou 2 ou 3 foram definidos como tendo alta expressão ou superexpressão de SOX4. coleta de dados clínicos e análise imuno-histoquímica foram realizados de forma independente um do outro, em um estudo cego-investigador.

Cultura de Células

humano normal (FHC) e cancro do cólon linhas celulares (DLD-1 e WiDr ) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). As linhas celulares foram autenticados pelo programa de biologia celular ATCC e foram passadas por não mais do que 6 meses antes de novas células foram trazidos para fora do estado congelado ou uma nova alíquota de células foi comprado de ATCC. As células foram cultivadas em DMEM /F-12 (FHC), RPMI-1640 (DLD-1), ou MEM (WiDr) meio suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina G, 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina, e 250 ng /mL de anfotericina B.

Preparação Proteína nuclear

as proteínas nucleares foram extraídas usando NE-PER Nuclear reagente de extracção (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até serem usadas. A concentração de proteína foi determinada utilizando um Kit BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology) com albumina de soro bovino como padrão.

imunotransferência

amostras de proteína desnaturada foram sujeitos a 12% de SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose, bloqueados e borrões foram incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpo policlonal anti-SOX4 (1:1000 diluição). proteína de ligação a TATA foi usada como um controlo interno para a carga de proteína igual. As membranas foram incubadas adicionalmente com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 h à temperatura ambiente. Eles foram, em seguida, incubadas com SuperSignal Oeste Femto Maximun Sensibilidade Substrato (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), e exposto a um filme de raios-X médico Fuji (Fuji Photo Film Co., Tóquio, Japão). processamento de imagens foi realizada utilizando software Fuji imagem Gauge.

Análise Estatística

Emparelhados

t

testes foram utilizados para avaliar a diferença na expressão SOX4 nuclear entre os tecidos tumorais e não tumorais para cada paciente. Nós examinamos vários parâmetros clínico-patológicas: idade, sexo, profundidade de invasão, de status nodal, metástases à distância, estágio, grau de diferenciação, de permeação vascular e invasão perineural. A associação entre a expressão SOX4 nuclear e cada parâmetro clínico-patológico foi examinada usando χ

2 de teste. Os endpoints tempo de colocação no evento para todos os parâmetros clínico-patológicas foram plotados pelo método de Kaplan-Meier, e o grau de significância foi calculado pelo teste de log-rank univariada. Parâmetros que emergiram como significativas (

P

≤0.05) na análise univariada foram inseridos como variáveis ​​no modelo de regressão de Cox multivariada, e taxa de risco (HR) e independência do impacto prognóstico poderia ser determinada de uma forma para trás passo a passo. Todos os dados foram analisados ​​usando o software SPSS versão 17.0 (SPSS, Chicago, IL). A

P valor

de 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Demografia

Este estudo envolveu 263 pacientes com câncer de cólon, 154 dos quais eram. homens e 109 mulheres (Tabela 1). A idade dos pacientes variou de 21 a 92 anos, no primeiro diagnóstico (média ± desvio standarad (DP): 68,0 ± 12,9 anos). Com base na classificação AJCC, 25 pacientes estavam em estágio I, 91 estavam na fase II, 108 estavam no estágio III, e 39 estavam em estágio IV. O período de seguimento para todos os pacientes variou de 0 a 146 meses (média ± D.P. .: 58,6 ± 40,2 meses). Durante o seguimento, 116 pacientes morreram de câncer de cólon.

Expression SOX4 Nuclear foi regulada e Associated com clínico-patológicas Parâmetros em Colon Cancer

Foi realizada análise imuno-histoquímica para investigar a expressão do nuclear SOX4 em tecidos obtidos a partir de nossos pacientes do estudo (Figuras 1A a C). SOX4 expressão nuclear foi significativamente mais elevada nos tecidos de tumor do que em tecidos não tumorais (

P

0,001). Superexpressão de SOX4 nuclear (escores de 2 ou 3) foi observada em 119 dos 263 pacientes (45,2%). A análise por Western blot demonstrou também que a expressão de SOX4 foi substancialmente aumentada em células de cancro do cólon e tecidos quando em comparação com as células normais e tecidos (Figura 1D). Além disso, a análise quantitativa por PCR em tempo real demonstrou que a expressão de ARNm SOX4 foi substancialmente aumentada em tecidos de tumor quando comparados com tecidos que não de tumor (Tabela 2). Como mostrado na Tabela 3, a superexpressão de SOX4 nuclear significativamente correlacionada com os seguintes parâmetros: profundidade da invasão (

P

= 0,0041), metástases à distância (

P Art 0,0001), e estágio (

P

= 0,0001). Nenhuma associação significativa emergiu entre a superexpressão de SOX4 nuclear e idade, sexo, estado nodal, grau de diferenciação, invasão vascular, ou a invasão perineural

Painéis A a C:. Amostras de cancro do cólon analisados ​​por imuno-histoquímica com um anticorpo contra SOX4 . O painel A mostra uma amostra sem expressão SOX4; O painel B mostra uma amostra com baixo nível de SOX4 expressão; O painel C mostra uma amostra com elevado nível de expressão SOX4. Painel D: expressão da proteína nuclear foi examinada SOX4 em 3 pares de células do cólon e 3 não tumoral /tumorais de tecidos do cólon. Ampliação:. 200 ×

A superexpressão de SOX4 Nuclear como um marcador de prognóstico para o cancro do cólon

Associações de resultados clínicos com a expressão SOX4 nuclear são apresentados na Figura 2 . superexpressão do SOX4 nuclear foi significativamente associada com sobrevida livre de doença mais curto (

P Art 0,001). Pacientes com níveis de SOX4 nuclear alta expressão alcançou uma taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos de 58,3% em comparação com 76,6% para os pacientes com baixos níveis de expressão. Além disso, de alta fase GC (fase III e IV) foi utilizado para encontrar o efeito da sobreexpressão SOX4 nuclear no prognóstico. Superexpressão de SOX4 nuclear foi significativamente associada com menor sobrevida livre de doença (

P

= 0,016, Figura 3). Pacientes com níveis de SOX4 nuclear alta expressão alcançou uma taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos de 44,8% em comparação com 63,8% para os pacientes com baixos níveis de expressão.

Todos os testes estatísticos foram bicaudais eo nível de significância foi

P

. 0,05

Todos os testes estatísticos foram bicaudais eo nível de significância foi de

P

. 0,05

os resultados da análise univariada dos marcadores de prognóstico do cancro do cólon são apresentados na Tabela 4. sobrevida livre de doença foi significativamente correlacionada com cada um dos seguintes: profundidade da invasão (

P

= 0,029), estado nodal (

P Art 0,001), metástases à distância (

P Art 0,001), fase (

P Art 0,001), invasão vascular (

P

0,001), invasão perineural (

P Art 0,001), e superexpressão de SOX4 nuclear (

P

= 0,001). No entanto, a associação entre a superexpressão de SOX4 nuclear e sobrevivência não foi significativo após o controle de outros marcadores prognósticos bem conhecidos em análise multivariada (

P

= 0,425, Tabela 5). Na análise multivariada, metástases distantes (HR = 0,052, IC 95% = 0,024-0,111,

P

= 0,001). Foi prognóstico independente

Discussão

O cancro do cólon continua a ser um importante problema de saúde pública em todo o mundo [1]. Apesar das técnicas cirúrgicas atuais e quimioterapia que fizeram melhorias significativas, a taxa de cura para o câncer de cólon avançado permanece baixa e a morbidade permanece elevada [2]. Maior conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento desta neoplasia mortal é necessário se novas estratégias de prevenção e tratamento do cancro do cólon estão a ser desenvolvidos. Em particular, a identificação de moléculas que são alterados durante o início e progressão do câncer pode fornecer ferramentas valiosas como marcadores prognósticos ou alvos terapêuticos.

A expressão de SOX4 em cancros humanos varia de acordo com o tipo de câncer. O nível SOX4 é elevado em numerosos cancros humanos, incluindo o da bexiga, da próstata, do endométrio, e no fígado, enquanto que é reduzida em pacientes com melanoma e cancro da vesícula biliar [17], [18], [24] – [27]. No presente estudo, foram avaliados os níveis de expressão de SOX4 nuclear nos tecidos do cólon obtidos de 263 pacientes com câncer de cólon. Os resultados foram consistentes com os da bexiga e próstata, e mostraram que a expressão SOX4 nuclear foi elevado em tecidos de tumor de cólon em relação a tecidos de cólon não-tumorais. Os resultados immunoblotting confirmou que a expressão SOX4 nuclear foi maior em células cancerígenas do cólon do que em células do cólon normais.

A nossa descoberta também mostrou que a superexpressão de SOX4 nuclear em tecidos de câncer de cólon foi estreitamente relacionado com a invasão tumoral e metástase. O mecanismo pelo qual SOX4 exerce a sua actividade invasiva e metastática permanece obscura. Na primeira linha de evidência, miARN (RNAs não codificantes pequena com funções reguladoras) foram mostrados para ser associado com a invasão tumoral e metástase [28], [29]. Os trabalhos anteriores por Tavazoie et al. mostrou que o miR-335 suprime a metástase através da regulação negativa de SOX4 [22]. Este resultado sugeriu que SOX4 está ligada à agressividade do tumor.

A segunda linha de evidência foi fornecida por estudos sobre a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que é um passo fundamental durante a embriogênese [30]. Acumulando as evidências sugerem que a utilização de EMT inadequado pode ser um componente da invasão de muitos tumores de tecidos epiteliais. características de células são fortemente afectados durante EMT, resultando em alterações de célula-célula e as interacções célula-matriz, a motilidade celular, capacidade de invasão e [31], [32]. estudo recente de Zhang et al. mostraram que a sobre-expressão de SOX4 em células epiteliais mamárias humanas levou à aquisição de características mesenquimais, e a migração de células e reforçada invasão. Além disso, SOX4 regulada positivamente a expressão de indutores conhecidos EMT e activada a via de TGF-β contribuir para EMT. A expressão de SOX4 foi induzida por TGF-β e foi necessário para EMT-TGF-β induzida. Estes resultados mostram que SOX4 desempenha um papel importante na progressão do cancro da mama, por orquestrar EMT [33]. Estes estudos podem explicar, em parte, para a associação da superexpressão de SOX4 nuclear com invasão tumoral e metástase.

previsão precisa do risco de recorrência iria ajudar a minimizar os efeitos adversos do cancro do cólon e maximizar o efeito terapêutico do tratamento . Dos marcadores prognósticos disponíveis para o câncer de cólon, o palco AJCC é mais importante. No entanto, o prognóstico varia até mesmo entre os pacientes na fase mesma doença; portanto, marcadores prognósticos alternativos são procurados. Poucos estudos têm investigado o valor prognóstico de proteínas SOX4. Aaboe et ai. mostrou que uma forte associação existente entre aumento da expressão SOX4 e aumento da sobrevida do paciente em casos de câncer de bexiga [17]. Da mesma forma, Kim et al. mostraram que a sobre-expressão da proteína SOX4 em pacientes com carcinoma hepatocelular foi associada com os resultados dos pacientes melhorados [25]. Além disso, Jafarnejad et ai. mostrou que, em pacientes com melanoma, uma forte associação existente entre a expressão SOX4 reduzida e sobrevida do paciente pobre [26]. Nós não encontrou relatórios publicados discutindo o significado prognóstico da SOX4 no câncer de cólon humano. Os resultados deste estudo mostraram que a superexpressão SOX4 nuclear foi inversamente correlacionada com a sobrevida do paciente; esta constatação contradisse as associações positivas relatados anteriormente. Nosso estudo foi o primeiro a mostrar que a superexpressão de SOX4 nuclear pode prever resultados mais pobres para pacientes com câncer de cólon. A sobre-expressão de SOX4 nuclear parece ser um marcador útil para prever resultados em pacientes com cancro do cólon que receberam a ressecção cirúrgica do tumor. Assim, os pacientes com câncer de cólon que apresentam superexpressão de SOX4 nuclear devem ser acompanhados cuidadosamente. Porque o nosso grupo de pacientes era pequena, estudos futuros devem incluir um grupo de pacientes de câncer de cólon maior para elucidar o significado prognóstico da SOX4 nuclear nesta doença.

Em resumo, este estudo forneceu evidências para o significado clínico da SOX4 sobre-expressos em pacientes com câncer de cólon. Os nossos resultados indicam que o direccionamento SOX4 pode proporcionar uma nova modalidade terapêutica para o tratamento de cancro do cólon.