Abstract

O câncer de pâncreas é uma das mais mortais doenças malignas humanas, e seu prognóstico não tem melhorado ao longo dos últimos 40 anos. modelos de ratos que desenvolvem espontaneamente adenocarcinoma pancreático e imitam a progressão da doença humana estão a emergir como uma nova ferramenta para investigar a biologia básicas desta doença e identificar potenciais alvos terapêuticos. Aqui, nós descrevemos um novo modelo de adenocarcinoma pancreático metastático com base na expressão, indutivel e reversíveis específicos do pâncreas de uma forma oncogénica de Kras, em conjunto com a expressão específica de pâncreas de uma forma mutante do gene supressor tumoral p53. Usando de alta resolução de imagem de ressonância magnética para seguir animais individuais em estudos longitudinais, que mostram que ambas as lesões primários e metastáticos depende da atividade Kras contínua para a sua manutenção. No entanto, a re-ativação de Kras * seguinte inativação prolongada leva à recidiva tumoral rápida, aumentando a preocupação de que Kras * -Resistência pode, eventualmente, ser adquirido. Assim, nossos dados identifica Kras * como um oncogene chave na manutenção de câncer pancreático, mas levanta a possibilidade de resistência adquirida deve inibidores Kras tornam-se disponíveis para uso no câncer de pâncreas

Citation:. Collins MA, Brisset JC, Zhang Y , Bednar F, Pierre J, Heist KA, et al. (2012) metastático cancro do pâncreas é dependente Oncogênicos Kras em camundongos. PLoS ONE 7 (12): e49707. doi: 10.1371 /journal.pone.0049707

editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 30 de março de 2012; Aceite: 12 de outubro de 2012; Publicação: 03 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Collins et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pela Universidade de Michigan Programa Acadêmico Biológica e pelo GI SPORE, P50CA13810 (Pilot Grant para MPdM) e pelos Institutos Nacionais de P50CA93990 bolsa de investigação da Saúde. MRI realizada pelo Centro de Imagem Molecular é suportado pelo NIH P50 CA093990. MAC é suportada por uma Universidade de Michigan Programa na bolsa de formação Biologia Celular e Molecular (NIH T32 GM07315) e por uma Universidade de Michigan Center for Organogénese Training Grant (5-T32-HD007515). FB é apoiado pela American College of Surgeons Scholarship Residente Pesquisa e pelo NIH T32 HD007505. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma do pâncreas ductal (PDA), a forma mais comum de câncer de pâncreas, está frequentemente associado a mutações do oncogene Kras, mais comumente KRAS

G12D [1], [2]. Mutações do -mais supressor tumoral p53 comumente R175H [3] – são freqüentemente observadas em amostras humanas [1]. Expressão do mutante Kras

G12D (Kras *) e o mutante p53

R172H -o ortólogo de rato R175H- no pâncreas de ratinho foi usado para gerar o modelo KPC. ratinhos KPC imitam de perto a progressão da doença humana [4], [5] e responder à terapêutica de um modo semelhante como pacientes humanos. Em contraste, tumores transplantados em ratinhos comprometidos imunologicamente mal prever a resposta terapêutica [6], [7]. O modelo KPC é, portanto, ideal para estudar a formação de câncer de pâncreas. No entanto, neste modelo de expressão mutante Kras é irreversível. Assim, os ratinhos KPC não são adequados para estudar o papel de Kras * na manutenção do tumor. Desde as drogas que alvejam Kras * estão actualmente indisponíveis, modelagem genética de inibição Kras é a única opção para determinar se este oncogene é necessário para a manutenção do tumor.

, e outros, descreveram recentemente a inducible-Kras * p53

+/- (iKras * p53

+/-) modelo de ratinho de cancro do pâncreas, que permite específico de tecido, a expressão indutível e reversível de Kras mutantes em combinação com uma perda de função do alelo supressor de tumores p53 [8 ], [9]. iKras * p53

+/- ratinhos desenvolvem câncer pancreático invasivo, mas não metastático que é dependente sustentada Kras * actividade para o seu crescimento e manutenção. Em outros modelos de ratinho de cancro do pâncreas, bem como noutros modelos de tumor, a perda da função de p53 acelerou a formação de tumores mas apenas raramente deu origem a doença metastática. Em contraste, a expressão de p53 mutante foi mostrado ser altamente metastático pró-[10], [11], [12]. Há uma certa variabilidade nestas conclusões: por exemplo, o potencial metastático tem sido descrita por outros grupos utilizando KC ou iKras * ratinhos combinada com a perda de alelo função de p53 [9], [13], assim, pode haver efeitos adicionais a considerar , tal como o fundo genético dos ratinhos. Tendo em conta que no nosso mouse colônia p53 perda de função não confere potencial metastático para iKras * camundongos, geramos iKras * camundongos que também carregava um alelo mutante p53 (p53

R172H, vem p53 *). Nosso objetivo era gerar um modelo metastático onde poderíamos abordar o papel dos Kras * na manutenção de câncer pancreático metastático, seguindo ratos em estudos longitudinais, utilizando

imagem in vivo

.

(A ) a composição genética de iKras * p53 * ratos. (B) Delineamento experimental: doxy foi administrada de forma contínua, a partir de desmame. pancreatite aguda foi induzida no prazo de 72 horas, em seguida, os animais foram envelhecidas até que eles desenvolveram tumores. De Kaplan-Meier curva de sobrevivência. iKras * p53 *, n = 25; iKras * p53

+/-, n = 9. análise estatística Log-rank rendeu um valor P de 0,001. (C) imagens brutas morfologia de um tumor primário e metástases hepáticas. T: tumor, S: estômago, Sp: baço, Int: intestino, L: fígado (D). Histologia de uma (linha superior) moderadamente diferenciado e um (linha de fundo) diferenciou-un tumor pancreático; fígado e metástases pulmonares. T: tumor. barra de escala 100 um.

Resultados

Em iKras * camundongos p53 *, o pâncreas-específicas p48-Cre (Ptf1a-Cre) [14] recombina uma cassete parada floxed inserido no a expressão Rosa26 lócus, activando assim o activador da transcrição de rtTa [15]. Cre recombinação também induz a expressão de p53

R172H (p53 *) [16] a partir do seu locus endógeno após recombinação de uma cassete de paragem floxed. O rtTa é transcricionalmente activo na presença de doxiciclina (doxy), e inactivo na sua ausência. Assim, o G12D TetO-Kras

(Kras *) [17] alelo pode ser transcrito numa forma induzível, e reversível específico do tecido através da administração de doxiciclina à água dos animais (Fig. 1A). A fim de induzir a carcinogénese, iKras * ratinhos p53 * foram colocados em doxy ao desmame, seguido de uma rajada curta de pancreatite aguda para promover a formação PanIN como descrito anteriormente [18], [19]. Os animais foram então mantidos em doxy até que eles desenvolveram PDA e tiveram de ser sacrificados ou sucumbiu, entre 2 e 45 semanas após a administração doxy (Fig. 1B e tabela 1). Curiosamente, a sobrevivência de iKras * p53 * animais foi maior do que a de p53 iKras *

+/- ratinhos (ver curva de Kaplan-Meier da Figura 1B.); No entanto, a razão para esta diferença permanece por esclarecer. Na necropsia, iKras * p53 * animais apresentaram com uma massa tumoral frequentemente na cabeça do pâncreas, juntamente com lesões metastáticas visíveis (Fig. 1C). Um subconjunto dos animais também apresentaram com ascite hemorrágica (n = 5). A histologia do tumor primário revelou a moderadamente diferenciadas adenocarcinoma pancreático-un com abundante estroma desmoplástico (Fig. 1D, a Fig. 2A e Tabela 1) semelhante ao que foi encontrado no p53 iKras *

+/- animais [8] . lesões metastáticas foram altamente prevalentes no fígado (Fig 1C inserir, 1D, Fig 2A e Tabela 1..), e menos frequentes nos pulmões; invasão duodenal também foi ocasionalmente observado (Fig. 1D, a Fig. 2A, a Tabela 1 e dados não mostrados). Ambos os tumores primários e metástases expressa fosfo-ERK1 /2, um efector a jusante de Kras (Fig. 2B). A caracterização adicional dos tumores e metástases revelou a expressão de marcadores de PDA, como CK19 (Fig. 2C), índice proliferativo elevado como medido por Ki67 coloração (fig. 2D), a acumulação de proteína p53 mutante (Fig. 2E), a instabilidade genómica como detectado por expressão γ-H2AX (Fig. 2F), e a acumulação de estroma desmoplástico incluindo músculo liso fibroblastos que expressam actina (Fig. 2G). Assim, os iKras * modelo de p53 * rato recapitula a histologia e comportamento biológico de cancro pancreático humano e os modelos anteriores do rato com a capacidade adicional para controlar Kras * expressão em uma data e à maneira de órgãos selectivo.

(a) a histologia de um adenocarcinoma pancreático primário e metástases de fígado e pulmão. (B-G) A imuno-histoquímica de tumor primário e de metástases por: (B) fosfo-ERK1 /2; (C) CK19; (D) Ki67; (E) p53; (F) γH2AX; (L) αSMA. H: metástase. Barra de escala 20 um.

A fim de determinar o efeito de Kras * inactivação no tumor primário e as metástases, avaliamos diferentes possibilidades de

in vivo

de imagem, o que permitiria a seguir animais individuais ao longo do tempo em estudos longitudinais. Fluorodeoxyglucose positrões tomografia de emissão (FDG-PET) e ressonância magnética (RM) têm sido amplamente utilizados para a imagem modelos ortotópicos de PDA [20], [21], e, em alguns casos, para os tumores espontâneos [22], [23] . Outros usaram o ultra-som de alta resolução em modelos de ratos geneticamente modificados principais de PDA [6]. Nós exploramos o uso de ressonância magnética, uma técnica de imagem clinicamente relevante que nos permitem obter imagens de alta resolução de tumores e metástases e medir as mudanças de volume ao longo do tempo. Nós fotografada ratos KPC (p48Cre; LSL-Kras; p53

R172H) [4], em paralelo com iKras * p53 * ratinhos para comparar a formação de tumores nos dois modelos. Inicialmente, os murganhos a ser trabalhada foram escolhidos com base na manifestação clínica da doença (condição pobre revestimento, distensão abdominal), ou, em alguns casos, à palpação de uma massa abdominal (Fig. 3A). Os ratinhos de controlo foram fotografadas para visualizar o pâncreas normal, aninhadas entre o estômago, o duodeno, o baço, e ao lado do rim direito (Fig. 3B). Em ambos KPC e iKras * p53 * camundongos (Fig. 3C e 3D) indivíduo, MRI imagem claramente identificada a massa do tumor pancreático. Além disso, em iKras * p53 * ratos, RM também visualizado múltiplas lesões metastáticas no fígado, que vão desde grandes lesões de muito pequena (0,11 mm

3) (Fig. 3D, painéis inferiores). Em experiências subsequentes de imagem, os animais foram fotografadas mensalmente, a partir de 1 mês após a activação de Kras * expressão e indução da pancreatite, e independentemente de qualquer sinal de doença. Neste segundo grupo de animais, os tumores mais pequenos foram ocasionalmente identificadas de modo que o crescimento tumoral pode ser seguida ao longo do tempo (Fig. 3E e a Fig. 4B). Os volumes dos tumores e metástases no total foram medidos para os animais individuais (Fig. 3F, os volumes dos tumores, parte superior, e o volume combinado metástases, inferior, para KPC e iKras * p53 * # 1, # 2, # 3) nos pontos de tempo indicados. Assim, esta técnica é um método eficaz e não invasivo para determinar a presença de tumores e metástases em animais individuais.

(A) Concepção Experimental. (B) MRI de um pâncreas de rato controle e fígado. P: pâncreas, S: estômago, Sp: baço, K: rins, L: fígado, G: vesícula biliar. (C) Grande massa pancreática (T), mas sem lesões metastáticas em um rato KPC. (D) Dois iKras * p53 * camundongos no doxy 15 semanas (esquerda) e 42 semanas (à direita) mostram um grande pancreáticas metástases em massa e do fígado. (E) Identificação dos tumores menores (iKras * p53 * # 3, painel esquerdo, 38 semanas) pode ser monitorado como elas se desenvolvem em tumores maiores (iKras * p53 * # 3, painel direito, 40 semanas). (F) medições de volume de ambos os tumores primários e metástases combinados para KPC e iKras indivíduo * animais p53 * nos pontos de tempo indicados.

A fim de determinar se o tumor primário e as metástases são dependentes Kras * que se retirou doxy em iKras * p53 * ratos, assim, inactivar o Kras * transgene, e realizada de imagens seriadas do mesmo animal ao longo do tempo (esquema na Fig. 4A e a Fig. 5A). Após inactivação * Kras, a massa do tumor primário (Fig. 4B e Fig. 5B) regrediu para dificilmente detectável ou indetectável no prazo de 3 semanas (Fig. 4C e a Fig. 5C). Por 6 semanas seguintes Kras * inactivação, as lesões metastáticas raras persistiu única, embora com tamanho reduzido (Fig. 5C). Para cada ponto de tempo, que foram capazes de obter medidas volumétricas tanto do tumor primário e de metástases (Fig. 4D e a Fig. 5F). Quando os ratos foram dissecados seguindo Kras prolongados * inativação, o seu pâncreas parecia pequeno e translúcida, e carecido qualquer massa tumoral visível aparente (Fig. 4E). A análise histológica (Fig. 4E, painel do meio) revelou parênquima fibrótico (

green seta

), com ácinos (

seta vermelho e) intercaladas dentro de dutos dilatados (

seta amarela

) e rodeado por tecido adiposo (

blue seta

). Alguns dos ductos dilatados retidos acumulação mucina intracelular identificado por coloração com PAS positivo (Fig. 4E, painel da direita). Também observamos cistos revestidos com células CK19-positivas, que possam indicar o local do tumor anterior (Fig. 4F painel esquerdo). As áreas fibróticas retido fibras de colágeno, como destacado com coloração de Tricrômico, mas as células dentro deles faltava músculo liso expressão de actina e não foram proliferativa, indicando o tecido da cicatriz em vez de estroma ativa. Tanto ao longo do pâncreas e restantes dentro dos cistos, fosfo-ERK1 /2 foi expressão rara, confinado às células individuais; Ki67 coloração estava presente num subconjunto de células epiteliais, mas figuras mitóticas foram raros (Fig. 4F). Assim, concluiu-se que neste modelo de cancro do pâncreas espontânea Kras * foi necessário para a manutenção de tanto do tumor primário e as metástases, mesmo na presença de um oncogene adicional, o p53 mutante. A dependência de um único oncogene para tumores avançados foi observada antes de [24], [25], [26], [27], [28], [29]; no entanto, a nosso conhecimento, o efeito de inactivação oncogene nas metástases de tumores sólidos tem sido pouco abordado.

(A) Delineamento experimental. (B) MRI tomada em 38 semanas após Kras * activação mostra morfologia pâncreas normal. P: pâncreas, S: estômago, Sp: baço. No entanto, no mesmo animal, não existe evidência de um pequeno tumor pancreático (T) na 40 semana, 2 dias, o que continua a aumentar de tamanho ao longo dos próximos quatro semanas. (C) ocorre a seguir à regressão do tumor Kras * inactivação. Por três semanas, já não é uma massa tumoral identificável. (D) O volume do tumor nos pontos de tempo indicados. (E) morfologia do pâncreas seguinte Kras * inactivação – note o pâncreas sem massa tumoral evidente (painel esquerdo). Histologia do tecido regrediu (HE, painel central, bar Scale 100 um) revela ácinos (seta vermelha) cercado por fibrose (seta verde) e tecido adiposo (azul seta) com dutos dilatados (seta amarela) contendo algumas células que apresentam acúmulo de mucina identificado por setas (coloração PAS, painel direito, bar Scale 20 um). (F) Histologia dos cistos fibróticas, indicando um possível local do tumor anterior (painel HE, esquerda), são revestidas com células que são positivas CK19 (inset). barra de escala 100 um. Gomori Tricromio (Barra de escala 100 um), SMA coloração (inserção), p-ERK1 /2, e coloração Ki67 indicam que a fibrose restante não é mais reativa. Barras de escala 20 um.

A seguir, procedeu-se determinar se as células do tumor foi completamente eliminado, ou se um subconjunto deles tinha sobrevivido a inactivação de Kras *. Para esse efeito, nós re-induzida Kras * expressão a seguir a regressão do tumor. Após a administração doxy, observou-se uma rápida recorrência da massa do tumor primário (Fig. 5D e 5F), sugerindo que algumas células do tumor tinha sobrevivido à inactivação do transgene e foram capazes de retomar o crescimento rápido. Além disso, uma análise mais profunda revelou fosfo-ERK1 /2 níveis foram aumentados ao longo do tumor primário, bem como nas metástases do fígado e do pulmão (Fig. 5E). Esta observação levou-nos a investigar se as células tumorais podem eventualmente adquirir resistência a Kras * inativação.

(A) Delineamento experimental. (B) Identificação de uma grande massa tumor pancreático 22 semanas após Kras * ativação. T: tumor, S: estômago, Sp: baço, L: fígado, G: vesícula biliar. (C) As imagens tomadas 1, 3 e 6 semanas após Kras * inativação. Note-se a massa do tumor primário muito reduzido ea carga metastático. (D) Reativação do Kras * resulta em recidiva tumoral rápida. (E) Histologia do tumor primário, bem como metástases encontradas no fígado e pulmão após recidiva tumoral mostra abundante fosfo-ERK1 /2 de expressão (inserções). A barra de escala 100 O volume do tumor e metástases totais nos pontos de tempo indicados da UM (F).

Para abordar esta possibilidade, e para ser capaz de obter informação histológica do mesmo tumor ao longo do tempo, geramos primária linhas de células de p53 * * iKras tumores. linhas de tumores primários em cultura foram caracterizados tanto por epitelial mesenquimal ou morfologia semelhante (Fig. 6A e 6C). A expressão do mutante Kras * RNA foi regulada por doxy em cultura, como esperado (Fig. 6A e 6C). Além disso, determinou-se a actividade do RAS nos iKras * p53 * linhas de células primárias era comparável com os níveis de Ras activo em células extraídas de KPC tumores (Fig. 6G). /2 níveis de fosfo-ERK1 foram inicialmente regulada por doxy no meio; no entanto, este regulamento foi enfraquecido ao longo do tempo na cultura, com fosfo-ERK1 /2 níveis tornando-se constitutivamente elevada, embora Kras * expressão ainda era doxy-dependente (Fig. 6B e 6D). Curiosamente, a proliferação, tal como medida por proliferação de antigénio nuclear celular (PCNA), não parecem ser doxy-dependente em cultura. No entanto, uma das linhas celulares (p53 iKras * * -2) exibiu um aumento da expressão do marcador de apoptose caspase-3 clivada, em resposta à remoção da doxy a partir do suporte (Fig. 6E e 6F). Os dados são consistentes com observações anteriores de que um subconjunto de células de cancro pancreático humano é dependente Kras oncogénicas de sobrevivência [35], [36].

(A) iKras linha de células primárias * p53 * -1 exposições epitelial morfologia e demonstra doxiciclina dependente Kras * expressão (* p 0,05), e pErk1 /2 níveis na passagem 5. (B) A mesma linha de células na passagem 12; Kras * expressão ainda é dependente doxy (*** p 0,001), mas os níveis de pErk1 /2 não dependem de Kras * expressão. (C) Uma segunda linha de células primárias, iKras * p53 * -2, tem morfologia mesenquimais. Na passagem 6, Kras * expressão é dependente de doxy (** p 0,01), e pErk1 /2 valores dependem Kras * expressão. (D) Análise na passagem 11: Kras * ainda é regulada por doxy (* p 0,05, ** p 0,01), mas pErk1 /2 níveis permanecem elevados. (E) análise de transferência de Western de apoptose, indicado pela caspase-3 (CC3), e proliferação, medida pela proliferação de antigénio nuclear celular (PCNA), em ambos os iKras * p53 * -1 e iKras * p53 * -2 linhas celulares. (F) Imunofluorescência de apoptose, indicado pela caspase-3 (CC3), em iKras * p53 * -2 células, quer na presença de (48 h) ou ausência (-48 h) de doxy nos meios de comunicação. Coloração DAPI marca os núcleos. barra de escala 100 um. ensaio de pull-down (G) Ras demonstra que os níveis de atividade Ras são comparáveis ​​entre iKras * linhas celulares p53 * e células de tumores KPC.

Para determinar o efeito de Kras * inativação

in vivo

, injetamos as células por via subcutânea em camundongos NOD /SCID. Embora a injecção subcutânea não é apropriado para estudos pré-clínicos de cancro pancreático, uma vez que não reflecte a complexidade do microambiente do tumor, no entanto, que fornece uma leitura da capacidade das células tumorais a crescer

In vivo

. Todas as linhas testadas (n = 3) tumores rapidamente formados quando transplantados em ratinhos NOD /SCID mantidos em doxy-água. Após a retirada doxy, os tumores primeira parou de crescer e, posteriormente regrediu rapidamente; Curiosamente, a regressão completa só foi observado na linha de células que era dependente Kras oncogénicos para a sobrevivência em cultura de células (iKras * p53 * -2). Após um período de latência, no entanto, os tumores voltaram a crescer na ausência de doxy (Fig. 7A e Fig. 7C). A análise histológica revelou que os tumores transplantados, bem como os tumores se assemelhava recidiva do tumor primário que foram derivadas de (Fig. 7B e Fig. 7D, comparar com a Fig. 1D, painéis superior e inferior, respectivamente). Ambos os níveis de expressão de Ki67 /2 e fosfo-ERK1 foram inicialmente regulada para baixo em cima Kras * inactivação (Fig. 7D, inserção), mas expresso em tumores recidivantes (Fig. 7B e Fig. 7D). Observou-se também a infra-regulação da SMA nos fibroblastos em torno das células tumorais, mesmo que, como esperado, a expressão SMA foi retida nos fibroblastos associada a vasculatura (Fig. 7D), indicando uma mudança na interacções epiteliais-mesenquimais sobre Kras * inactivação no epitélio. Quando se analisou a expressão oncogénica de Kras * nos tumores, verificou-se que os tumores tinham recidiva expressão constitutivamente elevada de Kras *, indicando perda de dependência de doxiciclina no transgene (fig. 7E). Assim, parece provável que a recorrência do tumor é devido à pressão selectiva para Kras * expressão, e não a independência adquirida a partir Kras *. Nós também exploraram se as vias oncogênicas adicionais podem contribuir para a recaída. Não foi detectada qualquer alteração na via de sinalização EGF, mas se observou um aumento na expressão myc nos tumores recaíram (Fig. 7E, dados não mostrados).

(A) O volume do tumor medido ao longo do tempo para iKras * p53 * -1 células transplantadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID. A linha amarela indica a presença de doxy, linhas pretas indicam a ausência de doxy, setas indicam pontos de tempo de colheita. N = 5. (B) Histologia e fosfo-ERK1 expressão /2 (inserção) de iKras * p53 * -1 tumores colhidos durante a fase de crescimento inicial e de tumores recaíram. barra de escala 100 um. (C) formação do tumor, regressão, e recaída em ratinhos NOD /SCID injectados subcutaneamente com iKras linha de células primárias * p53 * -2. N = 5. Uma segunda coorte de ratinhos NOD /SCID foram injectados com p53 iKras * * -2 células, mas mantidas na ausência de doxy que não desenvolvem tumores. N = 10. A linha amarela indica a presença de doxy, linhas pretas indicam a ausência de doxy, setas indicam colheita pontos temporais. (D) Histologia e pErk1 /2, Ki67 e SMA expressão de iKras * p53 * -2 tumores durante o crescimento, regressão e as fases de recaída (inserção). barra de escala 100 um. (E) Quantitative PCR para Kras oncogênicos * e myc expressão em iKras * p53 * -2 tumores.

Em um conjunto diferente de experiências, injetamos células tumorais em NOD /SCID em doxy ausência, para determinar se as células independentes de doxy já estavam presentes nas linhas de tumor. Neste caso, as células de tumor não conseguiu dar origem a tumores ao longo de um período de 13 semanas (Fig 7C.); Assim, a desregulação da Kras * transgene não era susceptível de estar presente na população de células inicial, mas ocorreu enquanto que as células estavam a crescer em ratinhos NOD /SCID. Em resumo, as nossas observações indicam que,

In vivo

, as células de tumor dependem Kras oncogénicos * para formar e manter a tumores. De nota, não se observou recorrência em iKras * p53 * ratos, mas apenas uma vez as células foram cultivadas e re-estabelecida em camundongos NOD /SCID; portanto, é possível que o meio ambiente diferente, possivelmente devido à falta de um sistema imune funcional, ou por causa da manipulação das células, pode ser permissiva para o crescimento do tumor.

Discussão

Graças a estudos em modelos de ratinho que imitam de perto a progressão da doença humana, bem como os dados genéticos e estudos em tumores humanos primários, nós desenvolvemos uma compreensão sofisticada da biologia do cancro do pâncreas [1], [30], [31]. Dado o perfil mutacional complexo de câncer pancreático ea impossibilidade de direcionar cada única alteração, é de fundamental importância para compreender os genes /vias que são necessários para a manutenção do tumor. As mutações no gene Kras ocorrer precocemente durante a progressão da doença [32]. Estudos modelo de ratinho demonstraram um papel chave de Kras mutantes no início da doença [33], [34]. Além disso, um subconjunto de linhas celulares de cancro do pâncreas humanos exigem Kras * para o crescimento e sobrevivência tanto

in vitro Comprar e em ratos hospedeiros imunocomprometidos [35], [36]. Além disso, outros tumores humanos, tais como adenocarcinoma de pulmão e câncer de mama mostram dependência semelhante sobre oncogênico Kras [17], [24]. Temos demonstrado recentemente que o câncer de pâncreas em ratos é viciado em Kras [8] *. No entanto, o nosso primeiro estudo não se estendem para analisar o papel do Kras * na presença de um outro evento oncogênico, nem investigar a doença metastática. Dado que o câncer de pâncreas é altamente metastático em humanos, sentimos que era essencial para alargar a nossa abordagem para incluir esta característica, combinando Kras * expressão com p53 mutante *. Mesmo na presença de p53 *, mostra-se que Kras * é necessário para a manutenção do tumor primário e as metástases. No entanto, as células tumorais sobreviveram Kras * inactivação e, mediante Kras * reactivação, deu origem ao crescimento do tumor renovada. Além disso, quando as células tumorais foram isoladas e implantados em hospedeiros comprometidos imunologicamente, eles rapidamente desenvolveram resistência. Em outras modelos que visem a dependência oncogene, eventual aquisição de resistência tem sido comumente observado [24], [37]. No nosso sistema, ele continua a ser determinado se a presença de p53 mutante promove resistência à Kras * inibição, ou se o estado imuno-comprometido do hospedeiro é permissiva para a reincidência do tumor, como anteriormente sugerido [38]. Tomados em conjunto, os nossos resultados validar a noção de inibir Kras em pacientes com câncer pancreático; no entanto, eles também fornecem uma nota de cautela a respeito do potencial de células tumorais para ignorar, eventualmente, a sua dependência oncogene. Estudos futuros devem ser destinadas a compreender os mecanismos que permitem um subconjunto de células tumorais para sobreviver Kras * inactivação para fornecer estratégias para a erradicação completa do tumor.

Materiais e Métodos

Mice

os ratos foram alojados em instalações específicas isentos de agentes patogénicos da Universidade de Michigan Comprehensive Cancer Center. Este estudo foi aprovado pela Universidade do Comitê Universidade de Michigan sobre o uso e tratamento dos animais diretrizes (UCUCA). p48Cre camundongos (Ptf1a-CRE) [14] foram cruzam com TetO-Kras

G12D [17], Rosa26

rtTa /rtTa [15] e p53

R172H /+ [16] Os ratos para gerar p48Cre; TetO-Kras

G12D; Rosa26

rtTa /+; p53

R172H /+ (iKras * p53 *). Ninhada falta Cre ou o Kras mutante e alelos p53 foram utilizados como controle. ratinhos KPC [4] e iKras * p53

+/- ratinhos [8] foram descritos anteriormente.

Doxy foi administrado através da água de beber, numa concentração de 0,2 g /L em uma solução de 5 % de sacarose, e substituídas a cada 3-4 dias.

pancreatite foi induzida através de duas séries de oito injecções intraperitoneais de hora em hora de ceruleina (Sigma), a uma concentração de 75 ug /kg, ao longo de um período de 48 horas, como previamente descrito [18].

Imagem por Ressonância magnética

os ratos foram anestesiados com 1-2% de isoflurano /ar, e a temperatura do corpo foi mantida por sopragem de ar quente através do furo do íman usando um Air-Therm (Instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL). exames de ressonância magnética foram realizados utilizando a 7 T Agilent (Palo Alto, CA)

Direct Drive

sistema com uma bobina volúmica cabeça quadratura rato (imagem m2m, Cleveland, OH). Os ratos foram colocados em posição supina na bobina, gravada por baixo da caixa torácica, na cama para reduzir o movimento respiratório. imagens ponderadas em T2 foram adquiridas usando uma rotação rápida de eco sequência multi-slice com TR /TE: 4000/30 ms, 8 trens de eco, 4 médias, 2 scans manequim, campo de visão (FOV) = 25 × 25 mm

2, tamanho de matriz = 128 × 128, espessura de corte = 1 mm número de fatias = 25 contíguo. Usando in-house software desenvolvido em MATLAB (The MathWorks, Inc., Natick, MA) a fronteira tumor foi definida manualmente em cada fatia e depois integrada em fatias para fornecer uma estimativa do volume.

Imunohistoquímica

Histologia e Imuno-histoquímica foi realizada como previamente descrito [8]. Uma lista de anticorpos é fornecida na Tabela 2. As imagens foram adquiridas com uma Olympus BX-51 microscópio, e câmera digital Olympus DP71 e software DP Controller.

O estabelecimento de culturas de células primárias

Tissue foi colhido a partir do tumor primário, picados, e digeriu-se com 1 mg /ml de colagenase V (Sigma) a 37 ° C durante 15 minutos. A digestão foi parada com a adição de meio completo: RPMI-1640 (Gibco) + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% de penicilina /estreptomicina. As células foram isoladas por filtração através de um filtro de células de 100 UM e plaqueadas em meio contendo doxiciclina completo (Sigma) a 1 ug /ml.

subcutânea tumor Transplantation

1 × 10

6 iKras * * células p53 foram injectados por via subcutânea no flanco de ratinhos NOD /SCID, na proporção de Matrigel (BD Biosciences) e meio completo 01:01. Doxy foi administrado através da água de beber numa concentração de 0,2 g /L em uma solução de sacarose a 5% durante 3 dias, e em Chow (BioServ). O tamanho do tumor foi medido com um compasso.

RT-PCR quantitativo

extracção de ARN, preparação de cDNA e PCR quantitativo para Kras * e normalização para GAPDH foi realizada como previamente descrito [8]. A análise estatística foi realizada com um teste t não pareado.

Western Blot Analysis

As células foram lisadas em tampão RIPA (Sigma-Aldrich, R0278) e inibidor de protease (Sigma-Aldrich, P8340). Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a electroforese em 12% ou 4-15% de gel SDS-PAGE em gradiente, transferidas para membrana de PVDF (Bio-Rad). As membranas foram bloqueadas com leite a 5%, e as incubações do anticorpo primário foram realizadas durante a noite a 4 ° C. anticorpos e diluições primárias são fornecidos na Tabela 2. O anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP (1:5,000) foi usada e detectada com a Western ECL Plus-relâmpago (Perkin Elmer). bandas de proteína foram visualizadas em filme Kodak Biomax XAR.

Activo Ras suspenso Ensaio

Puxe para baixo e immunoblotting de Ras activo foi realizada utilizando um kit activa Ras pull-down (Pierce) seguinte as instruções do fabricante.

Reconhecimentos

Agradecemos Esha Mathew para a leitura crítica do manuscrito e Marsha Thomas para apoio laboratorial. Obteve-se o anticorpo CK19 (Troma III) a partir do Iowa Developmental Hybridoma Bank.