Sumário

A caracterização de células estaminais do cancro (CSC) subpopulação, através da comparação da assinatura de expressão de genes em relação às células cancerosas nativos, é particularmente importante para a identificação de novas estratégias anti-cancro eficazes e mais . No entanto, CSC ter características peculiares em termos de adesão, crescimento e metabolismo que implica possivelmente uma modulação diferente da expressão dos genes mais comumente utilizados arrumação (HKG), como de b-actina (ACTB). Embora seja crucial para identificar quais são os genes HKG mais estáveis ​​para normalizar os dados derivados da análise quantitativa PCR em tempo real para obter resultados sólidos e consistentes, uma validação exaustiva de genes de referência na CSC ainda está faltando. Aqui, foram isoladas esferas CSC diferentes de sarcomas e carcinomas musculoesqueléticas como um modelo para o estudo sobre a estabilidade da expressão de ARNm de 15 HKG comummente utilizado, no que diz respeito às células nativas. Os genes seleccionados foram analisados ​​para o coeficiente de variação e comparados usando o NormFinder algoritmos populares e geNorm para avaliar a estabilidade no ranking. Como resultado, verificou-se que: 1) a Tata Binding Protein (TBP), Tirosina 3-mono-oxigenase /triptofano 5-mono-oxigenase zeta proteína de activação polipéptido (YWHAZ), peptidilprolil-isomerase A (PPIA), e hidroximetilbilano sintase (HMBS) são as mais HKG estável para a comparação entre CSC e as células nativas; 2) pelo menos quatro genes de referência deverá ser considerada para resultados robustos; 3) o uso de ACTB não deve ser recomendada, 4) HKG específica deve ser considerada para estudos que estão focados apenas em um tipo específico de tumor, tal como o sarcoma ou carcinoma. Nossos resultados devem ser tomados em consideração por todos os estudos de análise de CSC a expressão do gene, e vai contribuir substancialmente para futuras investigações destinadas a identificar nova terapia anticâncer baseado em CSC segmentação

Citation:. Lema S, Avnet S, Salerno M, Chano T, Baldini N (2016) identificação e validação da Housekeeping Genes para Análise de Expressão gênica de células-tronco cancerosas. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10.1371 /journal.pone.0149481

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 20 de outubro de 2015; Aceito: 01 de fevereiro de 2016; Publicação: 19 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Lema et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela concessão (RBAP10447J FIRB para NB) do Ministério da Educação, Universidade e Pesquisa Italiano, pela Associação italiana de Investigação do Cancro ( AIRC IG11426 para NB), e pelo Ministério italiano da Saúde, o apoio financeiro para a Investigação Científica “5 por mille 2012” (a NB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

diferentes populações de células formam tumores malignos. Dentro de qualquer tecidos normais, reside uma subpopulação de células-tronco com capacidade de auto-renovação e diferenciação em células especializadas. Da mesma forma, um tumor é composta por uma população heterogénea de células malignas, com classificação distinta da diferenciação, proliferação e potencial tumorigénico. Entre as células malignas heterogêneas tais, as células-tronco cancerosas (CSC) são referidos como uma pequena, mas distinta população de elemento na massa tumoral, que são primários envolvidos nas etapas de iniciação, transformação e posterior progressão do tumor [1]. O modelo de CSC argumenta que, como células-tronco de tecidos normais, as células tumorais siga organizações hierárquicas em que CSC encontrando-se no ápice mantenha a capacidade de tumorigênese [2], a promoção de metástases [3-5], e resistência a quimioterapia ou radioterapia [6 -8]. Esta população de células de iniciação do tumor foi isolado e caracterizado pela primeira vez na leucemia mielóide humana [9,10], e subsequentemente também em outros tumores sólidos [11-13]. O ensaio mais amplamente utilizado para o isolamento de CSC é o ensaio de formação de esfera e baseia-se na capacidade de CSC para crescer em condições independente de ancoragem e para formar colónias flutuantes [12], os assim chamados “esferas”. Anteriormente, isolado esferas CSC de sarcomas músculo-esqueléticos humanos [14-16], e neste estudo também isolado CSC de carcinoma diferente. Considerando carcinomas são tumores malignos adultos comuns que exibem alto índice metastática no momento do diagnóstico e extenso morbidade [7, 12], sarcomas músculo-esqueléticas são heterogéneos, relativamente raros, e neoplasias altamente agressivas de ossos e tecidos moles que ocorrem com freqüência em crianças e adultos jovens [17] . A alta taxa de recaída típico dessas neoplasias afeta dramaticamente o resultado clínico e, apesar da cirurgia pode ser curativa, o prognóstico do tumor permanece pobre. Portanto, abordagens terapêuticas actuais não são suficientes para melhorar o resultado clínico, e melhorias adicionais podem derivar apenas a partir de uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares destas doenças, e para a identificação de marcadores específicos que definitivamente distinguir CSC a partir de outras células de tumor. Assim, neste contexto, o

in vitro

isolamento de esferas fornece uma ferramenta inestimável.

Quantitativa em Tempo Real Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) é o método mais sensível e preciso para quantificar a expressão de ARNm de um único gene em várias condições experimentais, e requer a normalização dos dados de encontro a um gene de referência, que tipicamente devem ter uma expressão altamente estáveis ​​sob as diferentes procedimentos experimentais consideradas [18]. A identificação de genes específicos de limpeza (HKG) é um pré-requisito fundamental para o estudo da alteração relativa na expressão de ARNm de um gene alvo. A HKG seleccionados não devem ser co-regulados com o gene alvo ou influenciada pelo procedimento experimental. Ele também deve ser expresso em abundância e têm variação mínima. O método mais comum para normalizar os níveis de expressão de genes é para comparar os níveis de ARNm do gene de interesse para o controlo do gene endógeno. A normalização dos dados de qRT-PCR contra HKG aleatório pode resultar em erros de cálculo da factor de normalização utilizada para comparar as condições experimentais, e, por conseguinte, que esconde as diferenças entre as amostras biológicas [19]. Entre os genes de referência diferentes, beta-actina, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, ou beta-tubulina são os mais vulgarmente utilizados, uma vez que são altamente expressos, necessário para a sobrevivência, não-regulada por vias de sinalização, e são sintetizados em todos os tipos de células nucleadas . No entanto, descobertas recentes demonstraram que mesmo beta-actina, uma das HKG mais comumente usado, poderia ser um controle interno inadequada [20,21].

analisa qRT-PCR da CSC já foram realizadas, mas, por nosso conhecimento, não há justificação para a selecção da HKG ainda está disponível. Neste estudo, foram selecionados 15 da HKG mais utilizado para avaliar a sua estabilidade em ambas CSC e células nativas aderentes isoladas de rabdomiossarcoma humano (RS), osteossarcoma (OS), sarcoma de Ewing (ES), carcinoma da mama (BC) e carcinoma renal (RC). Através da comparação da variação do coeficiente eo uso de geNorm [22] e NormFinder [23] softwares foi realizada uma análise válida, reprodutível e comparativa da estabilidade da HKG selecionado.

Materiais e Métodos

linhas celulares de tumores nativos e culturas CSC

RS (RD), linhas celulares do sistema operacional (MG-63, HOS, Saos-2), linha de células ES (A-673), célula aC a linha a linha celular de (MDA-MB-231) e RC (ACHN), foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA), e cultivadas em meio modificado Iscove da Dulbecco (IMDM, Gibco) acrescido de 20 L /mL de penicilina, 100 mg /mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS) (IMDM completo) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Uma cultura ES primário humano (ES4540) também foi utilizado, e foi obtido a partir de uma biópsia de fresco ES humanos, e caracterizada, como previamente descrito [16]. A amostra ES4540 foi recolhido após um consentimento informado assinado e, após a aprovação da comissão Istituto Ortopedico Rizzoli ética (0.033.626, 09 de novembro de 2011), de acordo com a Declaração de Helsinki. Resumidamente, as amostras de tecido foram submetidas a trituração mecânica, seguido por digestão enzimática, para se obter células isoladas que foram semeadas em IMDM completo até à formação de uma monocamada

.

CSC células foram obtidos tal como anteriormente descrito [16]. Resumidamente, todas as culturas de células de tumor nativo foram mantidas em condições independente de ancoragem, em meio DMEM: F12 com progesterona (20 nM), putrescina (10 mg /ml), selenito de sódio (30 nM), a apo-transferrina (100 ^ g /ml) , e insulina (25 ng /mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em frascos de baixo de ligação (Nunc, Penfie, NY) (ensaio de formação de esfera). Obteve-se a cultura CSC através da manutenção do esferóide em condições independente de ancoragem em meios de células específico, a adição de factores de crescimento EGF e bFGF a cada 3-4 dias (duas vezes na semana). EGF humano fresco (20 ng /mL) e de bFGF (10 ng /mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ) foram adicionadas duas vezes por semana até que as células começaram a crescer na forma de agregados flutuantes (esferas). culturas esferóides foram amplificados por tratamento da cultura com tripsina CSC primário, seguido por dissociação mecânica suave, e por re-plaqueamento suspensão de célula única para se obter a segunda cultura esferóide. A viabilidade foi verificada por coloração com eritrosina. A percentagem de células mortas foi baixa (10-15% de células mortas). Somente aquelas culturas que foram capazes de formar esferas e que expressavam marcadores relacionados com células-tronco foram consideradas.

Illumina genoma analisador de sequenciação e análise de dados

A análise de sequenciação profunda da MG-63, HOS, e Saos-2 SO modelos celulares foi realizada para comparar a expressão transcricional mundial de CSC para as respectivas células nativas, de modo a seleccionar um painel da HKG estável para a análise de qRT-PCR. Resumidamente, o ARN total foi recolhido a partir do lisado celular em tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio ácido [24]. O ARN total foi quantificado por Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) seguindo as instruções do fabricante. RIN (ARN Número de Integridade) e razão A260 /A280 da ARN total Preparou-se de todos os 10, e mais de 1,8, respectivamente. A biblioteca de moléculas do molde para sequenciação de DNA de alto rendimento foi convertido a partir do ARN total utilizando TruSeq ARN Amostra Prep Kit V2 (Illumina, San Diego, CA), seguindo o protocolo do fabricante. A biblioteca também foi quantificada com Bioanalyzer (Agilent), seguindo as instruções do fabricante. A biblioteca (07:00) foi submetido a amplificação de agrupar em uma única célula V4 Leia de fluxo com um aparelho de geração de cluster (Ilumina). A sequenciação foi realizada num analisador de Genoma GAIIx durante 70 ciclos utilizando regentes Cycle Sequencing (v4 Ilumina). construção genoma humano 19 (hg19) foram baixados da Universidade da Califórnia, navegador genoma Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu/). análise de imagem e chamada de base foram realizadas utilizando Off-Line Basecaller Software 1.6 (Illumina). Lê foram alinhadas usando ELAND v2 de casava Software 1.7 com os conjuntos de dados de sequência. Transcrição cobertura para cada locus do gene foi calculada a partir do filtro número total de passagem que lê mapeado, por ELAND-ARN, de exões. Estas análises foram realizadas utilizando os parâmetros padrão. Os dados foram vistos usando Genome Estúdio Software (Illumina). A análise avançada para quantificação com o algoritmo de normalização Quantile foi realizada utilizando software Avadis NGS (version1.5, Strand Scientific Intelligence Inc., San Francisco, CA).

isolamento do RNA e síntese de cDNA

total o ARN foi extraído de células nativas e de CSC de todos os diferentes histotipos incluídos no estudo usando o NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). Na coluna ADNase digestão foi realizada seguindo as instruções do fabricante. A pureza total de ARN foi quantificada utilizando um Espectrofotómetro Nanodrop (NanoDrop Technologies). O ARN total (0,5 mg) foram sujeitos a transcrição reversa para ADNc em 20 uL de volume final, utilizando-MuLV da transcriptase reversa e inibidor de RNase (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando hexâmeros aleatórios. Para cada amostra, 3 réplicas biológicas foram processados.

qRT-PCR

qRT-PCR foi realizada usando um instrumento de Luz Cycler e o sistema universal de sonda da biblioteca (Roche Applied Science, Monza ). Sonda e primers foram selecionados por meio de um software de desenho de ensaio baseado em web (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), e foram ainda mais controlado usando Oligo Software Análise Primer. Apenas iniciadores abrangendo uma junção exão-exão e a produção de um amplificado por PCR com um comprimento entre 70 e foram seleccionados 150 pares de bases. Todos os iniciadores desenhados foram analisados ​​pelo BLAST para verificar a sua especificidade (National Center for Biotechnology Information). Todos os ADNc foram diluídos a 1:10, e 10 ul foram utilizadas como modelo e incluído em 20 ul de volume total de reacção de qRT-PCR. O protocolo de amplificação foi: 95 ° C durante 10 min; 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 1 s durante 45 ciclos; 40 ° C durante 30 s. Cada ensaio incluiu uma em branco. A Tabela 1 fornece uma lista de todos os HKG, sequências iniciadoras, sondas e incluídos neste estudo. Para a avaliação da expressão de c-Myc (NM_002467.4), KLF4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) e OCT3 /4 (NM_002701.4), foram utilizados os seguintes iniciadores: c-Myc-F 5′-gctgcttagacgctggattt-3 ‘, c-Myc-R 5′-taacgttgaggggcatcg-3′, a sonda 66; KLF4-F 5’-ccatctttctccacgttcg-3 ‘, KLF4-R 5′-agtcgcttcatgtgggagag-3′, sonda 7 ;. Nanog-F 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘, nanog-R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3, a sonda 69; OCT3 /4-F 5’-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 ‘, OCT3 /4-R 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3’, sonda 60. Para a finalidade de normalização, a expressão relativa da KLF4, c-Myc, Nanog e OCT3 /4 foram normalizados pelo ACTB gene de referência ou para a média geométrica de YWHAZ e GAPDH para o CSC e células nativas da MG-63, ou para a média geométrica de PPIA e HMBS para CSC e células nativas de ACHN e MDA-MB-231. A expressão relativa dos marcadores de células-tronco foi calculada utilizando o modelo ΔΔCt [25].

NormFinder análise

Programa NormFinder é um applet VBA [23] com base em uma abordagem de estimativa de variância , que classifica a HKG candidato com base na sua avaliação da estabilidade, e atribui um valor de estabilidade para cada gene candidato, usando uma abordagem baseada em modelo. De acordo com os requisitos NormFinder, os valores Ct foram transformados em quantidade relativa, usando o menor valor de Ct como calibrador. Segundo a análise, o valor da estabilidade menor foi topo do ranking. Nós agrupamos todos os dados em 3 grupos distintos: 1) todos os dados do CSC de tumores diferentes; 2) todos os dados a partir de células nativas de tumores diferentes; 3) todos os dados de diferentes tumores com CSC e células nativas reunidos. Para o terceiro grupo de dados, além de CSC e células nativas obtidos a partir de todos os tumores que se reuniram, também considerado CSC e células nativas obtidos a partir do tipo de tumor único, a partir do sarcoma ou de carcinoma. Todos os resultados foram obtidos a partir de 3 séries de repetições

GeNorm análise

GeNorm v 3.0 [22] disponível em QBASE + [26] (Biogazelle, Universidade de Ghent, na Bélgica, http:. //Www. .qbaseplus.com) foi usada para avaliar a estabilidade da HKG candidato. GeNorm calcula toda a possível variação em pares média entre os genes candidatos e fornece uma medida da estabilidade de expressão (M) de cada gene. Um M-valor abaixo de 1,5 indica HKG estável. O gene de referência candidato com o menor valor de M foi considerada como tendo a expressão mais estável. GeNorm classifica genes de referência candidatos com base na sua estabilidade de expressão, passo a passo e realizando a exclusão do gene com o mais alto valor M (o gene expressa pelo menos estável), e recalcula valores M para os restantes genes. Usamos também GeNorm para verificar se um único HKG é suficiente para uma normalização adequada. Com efeito, GeNorm fornece o número óptimo de genes de referência necessárias para a normalização precisas. V valores inferiores ao valor de corte de 0,15 indicado o número óptimo de genes necessários para a normalização dos dados. Da mesma forma que a análise realizada com NormFinder, agrupamos todos os dados e os resultados em 3 grupos diferentes. Todos os resultados foram obtidos a partir de 3 séries de repetições.

Coeficiente de análise de variação

estabilidade de expressão génica avaliada pelo coeficiente de variação (CV) foi calculado dividindo o desvio padrão (DP) de limiar ciclos (TC) pelo valor médio de CT. Como na análise realizada com NormFinder e GeNorm, agrupamos todos os dados em 3 grupos diferentes, e os resultados foram obtidos a partir de 3 séries de repetições.

Posto de agregação

As análises realizadas pela três métodos descritos mostrou algumas diferenças na classificação estabilidade da HKG. Por isso, identificamos os genes mais estáveis, considerando o valor mais baixo da média matemática do método NormFinder, geNorm e CV classifica para cada gene.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada com StatView ™ 5.0.1 software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para a caracterização de CSC e células nativas de MG-63, MDA-MB-231 e ACHN, os dados foram considerados como não normalmente distribuída, e foram usadas teste não paramétrico de Mann-Whitney. Os resultados foram registados como média ± erro padrão da média (SEM). desvio padrão (SD) de valores limiares do ciclo delta (ΔCt) foi calculado como desvio padrão combinado (SDpooled). HKG variação expressão na CSC e células nativas foi avaliada com o Wilcoxon Signed Rank Test emparelhado. Para todas as análises, foram consideradas significativas diferenças com a

p

valores ≤ 0,05.

Resultados

controle de qualidade RNA e caracterização de CSC

estabelecida culturas esfera de linhas celulares disponíveis comercialmente a partir de 3 de sarcoma e 2 histotipos diferentes de carcinoma (MG-63 para OS, RD para RS, a-673 para ES, MDA-MB-23 para o BC e ACHN para RC), e de um biópsia ES fresco (ES4540). A análise espectrofotométrica confirmou a pureza das amostras, com um A

260 /

280 razão de 2,08 ± 0,06, indicando ARN puro livre de proteína, e uma A

260/230 razão de 1,98 ± 0,21, indicando que o ARN total foi extraído com fenol e isento de etanol.

as características stemness semelhante para todas as culturas CSC incluídos neste estudo foram anteriormente caracterizados [16,27], com a excepção de cscMG-63, cscMDA- MB-231, e cscACHN para o qual a capacidade de crescimento na forma de agregados (Figura 1) flutuante, e a expressão do mRNA para KLF4, c-Myc, Nanog, e OCT3 /4 marcadores stemness [28] foram aqui confirmado.

imagens representativas de células nativas aderentes e CSC esferas flutuantes observadas por microscópio óptico invertido para as diferentes linhas de células (barra de escala 100? M, painel da esquerda), e a expressão de genes de marcadores de células estaminais por qRT-PCR (painel da direita). Normalização para ACTB. Para cscMG-63, c-Myc ** p = 0,0019, KLF4 p = NS, Nanog ** p = 0,0010, OCT3 /4 * p = 0,0265. Para cscMDA-MB-231, c-Myc ** p = 0,0011, KLF4 * p = 0,0130, Nanog ** p = 0,0011, OCT3 /4 * p = 0,0325. Para cscACHN, c-Myc p = NS, KLF4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. Para ACHN aderente, OCT3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12)

Em particular, no cscMG-63 nós encontramos uma tendência de aumento da expressão de KLF4. (Fig 1; n = 12; p = ns), e um significativamente maior expressão de c-Myc (** p = 0,0019), Nanog (** p = 0,0010), e OCT3 /4 (* p = 0,0265). CSC a partir de células MDA-MB-231 altamente expressam todos os marcadores stamness do que a cultura aderente (Fig 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; c-Myc ** p = 0,0011; Nanog ** p = 0,0011; OCT3 /4 * p = 0,0325), ao passo que as culturas esfera de ACHN expressaram níveis consistentes de ARNm para KLF4 e Nanog (Fig 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; Nanog * p = 0,0130), e nenhuma expressão diferente para c-Myc . Em cscACHN, a expressão do OCT3 /4 marcador é menor do que a cultura nativa aderente (Fig 1; * p = 0,0130). Os genes stemness foram normalizados por ACTB, um dos HKG mais comumente usado.

perfil de expressão do candidato genes HKG

Quinze genes de referência candidato (Tabela 1) foram selecionados por meio da análise da literatura pesquisa em estudos sobre as células estaminais e as células tumorais normal com análise de qRT-PCR.

Foram selecionados os genes que pertencem a diferentes classes funcionais ou caminhos, a fim de reduzir a probabilidade de incluir nos genes co-regulados de análise. O perfil de transcrição dos genes selecionados foi preliminar analisada por Illumina Genome Analyzer sequenciamento. A análise de sequenciação profunda revelou que os genes putativos de referência foram expressos de forma estável, com a excepção de G6PD (Tabela 2, Figura 2A).

(A) mapa de calor que mostra a expressão relativa de genes seleccionados em células nativas e CSC da MG-63, HOS, e SAOS-2. (B). perfil transcricional do limiar do Ciclo de valores (TC) de candidatos genes HKG na CSC e linhas de células nativas. As caixas representam os quartis inferior e superior do intervalo limite ciclo com a mediana indicado, barras verticais representam o th 10

e 90

th percentis. Em ambos CSC e as linhas de células aderentes, 18S rRNA foi o gene mais altamente expresso (menor valor de Ct), enquanto G6PD foi o menos gene expresso (maior valor Ct).

Nós usado apenas MG-63 como representante da histotipo oS para a seguinte análise de qRT-PCR para confirmar os dados obtidos por sequenciação de profundidade. Para comparar os níveis de mRNA de transcrição diferentes foram utilizados os valores ciclos de limite (TC). valor de Ct é a intersecção entre uma curva de amplificação e uma linha de limiar, e está inversamente correlacionada com a quantidade do gene alvo presente na reacção de PCR [29]. Os 15 genes de referência candidato exibiu uma ampla gama de níveis de expressão. A distribuição dos valores medianos e percentis Ct para cada gene é mostrado na trama Blox da Fig 2B. genes de referência foram expressos em menos CSC em comparação com células nativas. As menores diferenças na expressão genética entre CSC e linhas celulares nativas, expressa como ΔCt, foram detectados por B2M, TBP e SdhA, ao passo que a maior ΔCt foram calculados para ACTB, TUBB PGK1 e (Tabela 3). Ao realizar o Wilcoxon Signed Rank Test emparelhado para cada gene para avaliar a diferença entre CSC e células nativas obtidas a partir das mesmas células de origem, encontramos uma diferença significativa na expressão HKG entre CSC e as células nativas para cerca de metade da HKG examinados ( tabela 3).

Determinação da estabilidade de expressão do gene de arrumação

estabilidade HKG expressão foi avaliada usando NormFinder VBA applet, o software GeNorm, e calculando e comparando o coeficiente de variação ( CV) em três grupos diferentes: em (1) CSC ou (2) células nativas, com o objectivo de identificar os genes mais estáveis ​​dentro de subtipos de células específicos, e (3) nas células CSC e nativas reunidas, com o objectivo de identificar os genes mais estáveis ​​para serem considerados como genes de referência para a comparação da expressão do gene entre CSC e células nativas.

os valores de estabilidade para valores NormFinder e M para GeNorm são parâmetros de estabilidade que são inversamente correlacionadas com a expressão estabilidade da HKG. Todos os 15 genes candidatos de referência teve um valor de M menor do que o valor limite de 1,5 (Tabela 4), a qual indicou que todo pode ser considerado como aceitável em termos de estabilidade [22].

1) a HKG mais estável da CSC. Usando o NormFinder VBA Applet, o 3 mais estável HKG resultou GAPDH, PGK1 e HMBS (da primeira para a terceira estável), enquanto que o menos estável foram RPL13a, B2M e GUSB. Usando o software GeNorm, identificamos YWHAZ, GAPDH e TBP como a HKG mais estável, ao passo que os genes menos estáveis ​​foram ACTB, GUSB e B2M. CV método também salientado que a utilização de ACTB devem ser evitados, enquanto que, como para GeNorm e analisa NormFinder, a utilização de PGK1 e YWHAZ é recomendado. Uma comparação do ranking produzido pelos três abordagens revelaram diferenças consoante o tipo de algoritmo aplicado. O número mínimo de genes de referência necessárias para a normalização foi determinada por cálculo GeNorm de variação de pares (coeficiente de variação, V) entre um dado número de genes e a inclusão de um gene adicional, e o número ideal de gene de referência foi calculada como 3 (V3 /4 0,114, Fig 3A). Em conclusão, para análise de mRNA isolado a partir de CSC a expressão do gene, o fator de normalização ideal deve ser calculada como a média geométrica dos alvos de referência YWHAZ, GAPDH e PGK1.

O número mínimo de genes necessários para a normalização de dados foi avaliada por variação emparelhados (Vn /n 1) em (a) CSC, (B) células nativas, (C) na CSC e linhas celulares nativas de todos os tumores, (D) a partir do sarcoma e (C) a partir de carcinomas. Um coeficiente de variação (V) inferior a 0,15 indica o número óptimo de genes necessários para a normalização dos dados. V2 /3 0,15 indica que 2 genes são necessários para a normalização de dados

2) A HKG mais estável em células aderentes nativas.. NormFinder análise revelou que 18S rRNA, TBP, e PPIA foram os três melhores HKG, enquanto RPL13a, G6PD, e ACTB foram piores em termos de estabilidade de expressão. Da mesma forma, identificado GeNorm PPIA e rRNA 18S como os dois HKG mais estável, seguido por GAPDH, ao passo que os genes menos estáveis, de modo a partir da última classificados, foram G6PD, RPL13a, e ACTB. O método sugerido CV HMBS, TBP e YWHAZ como os três genes mais estáveis. O cálculo GeNorm do coeficiente de variação V sugeriu que o número óptimo de genes de referência foi de 2 (V2 /3 0,146; Fig 3B), e a adição de um gene terceira referência resultou num pequeno efeito na normalização (abaixo do valor de cut-off de 0,15). Em conclusão, para a célula nativa, de acordo com as análises, o fator de normalização ideal deve ser calculada como a média geométrica dos PPIA e TBP.

3) Finalmente foi realizada a análise da CSC e as células agrupadas nativas em todos tumores (a), no sarcoma (B) e carcinoma (C).

(3A) em CSC e células nativas de todos os tumores, NormFinder identificado GAPDH, TBP, e PPIA como os três HKG mais estável, enquanto ACTB, RPL13a e GUSB foram o menos estável. PPIA e GAPDH foram também confirmados por análise GeNorm, juntamente com 18S rRNA. Mais uma vez, ACTB foi o último gene no estabilidade para a análise GeNorm, juntamente com B2M e da G6PD. A avaliação CV sugerido TBP, B2M, e SdhA (Tabela 4), ao passo que ACTB, tubb e 18S rRNA foram as menos estáveis. GeNorm recomendado o uso de 4 HKG para análise da expressão do gene preciso (V 0,15 quando se compara um factor de normalização com base nos 4 ou 5 alvos mais estáveis; Fig 3C). Consequentemente, o fator de normalização deve ser calculada como a média geométrica de TBP, PPIA, HMBS e YWHAZ ou GAPDH.

(3B) Em CSC e as células nativas do sarcoma, o GAPDH software NormFinder identificado, YWHAZ e 18S rRNA como os genes mais estáveis, em vez de G6PD, RPL13a e B2M foram o menos estável. GAPDH e YWHAZ foram identificados como o melhor HKG também pela análise GeNorm, enquanto ACTB e RPL13a estavam entre os últimos genes classificados. O método CV mostrou que HMBS, TBP, e SdhA tinha a melhor posição do ranking (Tabela 5). O número ideal de metas de referência é de 2 (V2 /3 0,143, Fig 3D). Em conclusão, o fator de normalização ideal pode ser calculada como a média geométrica do cumprimento dos objectivos de referência YWHAZ e GAPDH.

(3C) A análise da estabilidade HKG no carcinoma revelou que PPIA, HMBS e RPL13a foram o HKG mais estável para NormFinder. GeNorm também confirmou PPIA e RPL13a como alvos mais estáveis ​​por GeNorm, seguido de rRNA 18S, ao passo que o método sugerido CV B2M, TBP e G6PD (Tabela 5). O cálculo do coeficiente de GeNorm V sugeriu que dois HKG são suficientes para a normalização (V2 /3 0,084, Figura 3E). Em conclusão, o fator de normalização ideal, nesse caso deve ser calculada como a média geométrica de dois dos seguintes genes, PPIA, HMBS ou RPL13a, que têm o mesmo valor de classificação geral.

Validação da HKG identificado em a CSC modelo

na avaliação da expressão do gene, o uso de HKG suboptimal pode gerar resultados errados ou pode esconder uma diferença na expressão genética. Isto é particularmente importante para os genes que mudam ligeiramente entre duas populações de células, como células nativas e CSC.

Analisou-se a expressão dos genes c-myc stemness, KLF4, nanog, e OCT3 /4 que eram anteriormente normalizada para ACTB (Fig 1), com as células de alto escalão HKG para CSC e nativas identificadas, em sarcoma e carcinoma, respectivamente (GAPDH e YWHAZ para sarcoma, e PPIA e HMBS para o carcinoma). Alguns dos genes relacionados com a haste considerados mostrou uma robustez melhorada da análise estatística realizada com a normalização com o HKG mais estável, no que diz respeito com ACTB. Em particular, como mostrado na figura 4, verificou-se que a normalização do Nanog para a média geométrica da HKG mais estável resultou em *** p = 0,0007 para cscMG-63 e ** p = 0,0043 para cscACHN, enquanto que com a normalização ACTB obtivemos ** p = 0,0011 e p = 0,0130 *, respectivamente. Em cscMG-63, por cMyc obtivemos *** p = 0,0003 com a nova análise, no lugar de ** p = 0,0019 com a normalização para ACTB.

O efeito da normalização expressão do gene com óptima HKG foi investigado na CSC e células nativas da MG-63 e ACHN. (A) para a linha de células de osteossarcoma, a expressão dos marcadores de células estaminais e nanog cMyc foram avaliados e normalizados para a média geométrica da GAPDH e YWHAZ. *** P = 0,0007 para Nanog, *** p = 0,0003 para o c-Myc. (B) Para a linha de células de carcinoma ranal, a expressão de Nanog e cMyc foi normalizada para a média geométrica dos PPIA e HMBS. ** P = 0,0043 para Nanog. (N = 6).

Discussão

A expansão do conceito de CSC tem atraído muita atenção, ea caracterização da CSC tem liderado o caminho para novos potenciais para terapias anti-câncer. CSC são um subconjunto minoritário de células tumorais de iniciação envolvidos em várias fases do processo de pró-tumorigénica, de iniciação do tumor [30], para quimiorresistência [31] e recaída [32]. CSC pode ser isolado a partir de linhas celulares e amostra de tecido com o método do sistema esfera [12], com base na capacidade de CSC para crescer como colónias esféricas em condições de flutuação independente de ancoragem. Até o momento, este é considerado um método de valor inestimável para obter culturas CSC-enriquecido. Recentemente, isolado CSC de sarcomas músculo-esquelético, ambos da linha celular e biópsia fresca [16,27].