Abstract

Quimioprevenção apresenta uma estratégia importante para a gestão médica do cancro colorectal. A maioria dos medicamentos utilizados para o tratamento do cancro colo-rectal induz danos no ADN-alquilação, que é reparada primariamente pela via de reparação de excisão de bases (BER). Assim, o bloqueio da via BER é uma opção atraente para inibir a propagação do cancro colorectal. Usando um

in silico

abordagem, foi realizada uma tela baseada na estrutura de encaixe pequenas moléculas Onto β DNA polimerase (Pol-beta) e identificou uma potente composto anti-Pol-β, NSC-124854. Nosso objetivo foi examinar se NSC-124854 poderia aumentar a eficácia terapêutica do agente de alquilação do ADN, a temozolomida (TMZ), bloqueando BER. Primeiro, determinamos a especificidade do NSC-124854 para Pol-β examinando

in vitro

atividades de APE1, Fen1, DNA ligase I, e Pol-dirigiu-β de nucleotídeo único (SN) – e longa-patch (LP) -BER. Em segundo lugar, temos investigado o efeito de NSC-124854 sobre a eficácia da TMZ para inibir o crescimento de reparação de emparelhamentos incorrectos (MMR) -deficient e linhas celulares de cancro do cólon MMR-proficientes utilizando ensaios clonogénicos in

in vitro

. Em terceiro lugar, nós exploramos o efeito do NSC-124854 em TMZ-induzida

in vivo

tumor inibição do crescimento de xenoenxertos de cólon MMR-deficientes e MMR-proficientes implantadas em ratinhos SCID homozigotos do sexo feminino. Nossos dados mostraram que NSC-124854 tem alta especificidade para Pol-β e bloqueou Pol-β-dirigidos atividades SN e LP-BER em

in vitro

sistema reconstituído. Além disso, NSC-124854 efetivamente induzidos a sensibilidade do TMZ para células cancerígenas do cólon MMR-deficientes e MMR-proficientes tanto

in vitro

cultura de células e modelos de xenotransplante

in vivo

. Os nossos resultados sugerem uma nova estratégia potencial para o desenvolvimento do inibidor altamente específico com base na estrutura, para a prevenção da progressão do tumor do cólon

citação:. Jaiswal AS, Banerjee, S, R Aneja, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) DNA polimerase β como um novo alvo para quimioterápico Intervenção do cancro colorectal. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10.1371 /journal.pone.0016691

Autor: Ben Ko, Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 04 de outubro de 2010; Aceito: 03 de janeiro de 2011; Publicação: 02 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Jaiswal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nacional de Câncer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA (R01 CA-097031 e CA-100247). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum ea segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. No ano de 2010, estima-se que 102.900 novos casos colorretal serão diagnosticados e 51,370 mortes ocorrerá somente nos Estados Unidos. Embora nas últimas duas décadas, um avanço considerável foi feito nas opções de tratamento, a taxa de mortalidade desta doença não é muito melhorada. Portanto, novas terapias são necessárias para melhorar o prognóstico desta doença. Durante muitos anos, a primeira escolha da droga quimioterapêutica para o cancro colorectal tem sido 5-fluorouracilo (5-FU). É usado principalmente como terapia neoadjuvante com radiação e em combinação com vários outros fármacos quimioterapêuticos, tais como mitomicina, cisplatina, oxaliplatina, Camptosar, Eloxatin, Avastin, Erbitux, e Vectibix para o tratamento de cancro colorrectal metastizado que se torna [2]. Estas drogas dar melhores resultados em doses mais elevadas, mas causar efeitos secundários graves, incluindo a morte de células saudáveis ​​de revestimento da boca, a mucosa do tracto gastrointestinal, os folículos de cabelo, a medula óssea e causar lesões do fígado e hipertensão [3].

as mutações no

polipose adenomatosa coli (APC)

gene é um evento precoce na polipose adenomatosa familiar (FAP), um síndroma em que existe uma predisposição hereditária para o cancro do cólon [4], [5]. A maioria das mutações de o

APC

gene ocorrem na região de mutação do cluster (MCR) e resultar na produção de uma proteína truncada. Este truncamento compromete várias funções de APC, que está envolvida na instabilidade cromossómica e funcionamento anormal da via de Wnt-sinalização, a regulação do ciclo celular, a estabilização do citoesqueleto microtubular, interacções célula-célula e ADN Rep y [6] – [14]. Estudos recentes sugerem que o APC nuclear, através de uma região (aminoácidos 1441-2077) que é truncado na maioria dos tumores colorectais, coopera no recrutamento de DNAPKcs à cromatina ADN danificado e melhora a resposta precoce de quebras de cadeias duplas (DSB ) reparação do ADN [15]. A APC também interage directamente com o ADN genómico, preferencialmente com sequências ricas em A /T [16], o que implica um papel para a APC na replicação de ADN [17]. Tem sido sugerido que a APC através da sua extremidade C-terminal (aminoácidos 2140-2421) interage com o DNA e regula negativamente a evolução do ciclo celular através da inibição da replicação do ADN por interacção directa com ADN [17]. Nós mostramos anteriormente que o tratamento com agentes de alquilação de ADN aumenta o nivel de PCA em células de cancro colorrectal [14]. Além disso, demonstramos que a APC interage com β DNA polimerase (Pol-β) e flap-endonuclease 1 (Fen1) e bloqueia Pol-dirigiu-β único nucleotídeo (SN) – e de longa patch (LP) reparo de excisão -base (BER) actividades de afectar a capacidade de resposta celular à quimioterapia [14], [18]. Com base nestes estudos, parece que a interacção de APC com Pol-β e outras proteínas BER pode ser um alvo apropriado para intervenção quimioterapêutica de crescimento do cancro colo-rectal.

O uso de agentes de alquilação de ADN como drogas quimioterapêuticas está com base na sua capacidade para desencadear uma resposta morte celular [19], e a sua eficácia terapêutica é determinada pelo equilíbrio entre a danos no ADN e reparação. As lesões induzidas por danos no DNA-alquilação são reparados pelo RIC, O

6-metilguanina ADN-metiltransferase (MGMT) e reparação incompatibilidade vias (MMR). Muitos tumores do cólon se tornam resistentes a agentes de alquilação de ADN, devido a sobre-expressão de MGMT ou MMR-deficiência [20]. As células deficientes em MGMT são incapazes de processar a O

6meg durante a síntese de DNA, e se não for reparado, a G: C para G: mutação de transição T ocorre [21]. Em estudos anteriores, o papel da via BER também tem sido implicado na resistência celular a TMZ [22], [23], o que depende de a expressão do gene específico e BER actividade [24]. Nos últimos anos, os fármacos anti-cancerígenos que têm sido desenvolvidas principalmente como alvo o MGMT e vias MMR [25], [26]. Uma vez que os cancros colo-rectais MMR deficientes em constituir um maior risco de resistência a drogas para a alquilação de ADN, devido a sobre-expressão de MGMT ou MMR-deficiência [27] – [29], que é crítico para descobrir uma estratégia quimioterapêutico que pode ser útil para o tratamento de MMR ambos deficientes e MMR-proficientes tumores colo-rectais. Curiosamente, embora BER é responsável pela reparação de 70%, 5% e 9% do N

7-metilguanina (MEG), n

3-Meg e N

3-metiladenina (MEA) lesões , respectivamente, induzida pela droga-alquilação do ADN temozolomida (TMZ; NSC-362856) [23], [30], [31], a utilidade potencial da via BER bloqueio não tenha sido completamente explorada. Assim, com a combinação de agentes de bloqueio BER e tratamento TMZ, o resultado clínico de eficácia quimioterapêutica da TMZ pode ser melhorada. Estudos anteriores também suportam que os danos induzidos pela alquilação do DNA é reparada principalmente pela via BER [26], [27]. No passado, a BER via tem sido utilizada como um alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos, mas a implicação clínica destes fármacos ainda está em estudo [31] – [36].

TMZ tem sido utilizado com sucesso sendo para o tratamento do melanoma metastático e glioblastoma multiforme, este último em associação com radioterapia [37], [38], mas foi mostrado ser menos eficaz no tratamento de outras doenças malignas. A Fase II estudo clínico de TMZ em pré-selecionados cânceres do trato aerodigestivo avançados, incluindo neoplasia colorretal, foi recentemente concluído pela Schering-Plough, Kenilworth, NJ, mostrando apenas uma resposta parcial ao tratamento (https://clinicaltrials.gov/CT2 /show /NCT00423150). Em uma fase anterior eu estudo clínico de TMZ, foi também observada uma resposta parcial do fármaco no cancro colo-rectal metastático, sugerindo resistência tumor considerável para o tratamento [39]. Para vencer a resistência dos TMZ, um estudo clínico de Fase II foi realizada na qual lomeguatrib foi combinado com TMZ, mas os resultados não foram muito significativa [40]. Assim, existe uma necessidade urgente do desenvolvimento de uma nova estratégia através da qual a eficácia da TMZ pode ser aumentada para o tratamento de cancros colo-rectais.

Uma vez que a maioria dos fármacos quimioterapêuticos causam danos no ADN e resistência devido à activação do via (s) de reparação do ADN, proteínas de segmentação destes via (s) para bloquear a sua actividade pode ser uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos fármacos com uma eficácia mais elevada para ambos os tumores resistentes à quimioterapia e sensíveis. Nos últimos anos, o design virtual baseada em estrutura e a estrutura tridimensional de uma interacção droga-alvo com inibidores de baixo peso molecular foi utilizado para orientar a descoberta de drogas racional [41]. A concepção de fármacos assistida por computador pode encontrar novos compostos de chumbo e ajudou na optimização estrutura para testes biológicos e farmacológicos [42] – [44]. No presente estudo, foi realizada de acoplamento molecular com base na estrutura de Pol-β no local onde polipose adenomatosa coli (APC) e interage blocos Pol-β-dirigida BER [14], [45], [46]. O acoplamento molecular baseada na estrutura é considerada uma abordagem adequada para o desenvolvimento de novas drogas, uma vez que esta abordagem é apontado a proteína específica e via específica [47]. Com base nos esforços silico, identificámos um pequeno peso molecular inibidor altamente potente, NSC-124854 {[5- (4-amino-6-iodo-2-oxo-5,6-di-hidropirimidin-1-il) -3- hidroxi-oxolan-2-il] ácido methoxyphosphonic}, que interage especificamente com Pol-β e blocos-Pol-β-dirigida de um único nucleótido (SN) – e a longo remendo (LP) -BER. Aqui nós apresentamos dados que descrevem que NSC-124854 pode melhorar a eficácia da TMZ em células cancerígenas do cólon MMR-deficientes e proficientes

in vitro Comprar e

in vivo

modelos. Propomos que estes resultados pré-clínicos irá estabelecer um novo paradigma para a gestão clínica do cancro do cólon.

Resultados

Triagem de pequenas moléculas para inibir a atividade de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigido

Para identificar um composto anti-Pol-β potente, foi utilizado um

in silico

abordagem de acoplamento molecular baseado em estrutura de alto rendimento e selecionados aproximadamente 140.000 compostos de moléculas pequenas (peso molecular 500 daltons) quanto à sua capacidade para interagir com o local de ligação de APC-Pol-β (Fig. 1

Um

) [48]. Os 22 maiores compostos moleculares pequenos pontuação foram solicitados a partir do Programa de Desenvolvimento Therapeutics (DTP) do National Cancer Institute (NCI) para avaliação funcional. Foi realizada a triagem inicial dos compostos para determinar a sua capacidade para inibir a síntese de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigida. Foi utilizado um

in vitro

sistema de ensaio reconsitiuted nestes estudos. Foram triados 22 compostos de pontuação superior e os dados de 12 compostos é mostrado aqui (Fig 2

A Restaurant -.

C

). Entre 22 pequenas moléculas, NSC-21371 e NSC-91855 síntese de deslocamento de cadeia inibido Pol-β-dirigida a 125 concentração? M (Fig 2

B

;. Comparar pista 3 com pistas 9-13 e 19-23 , respectivamente). Estes pequenos compostos moleculares não afetou a atividade de incorporação de 1-nt (produto 24-mer) de Pol-β em qualquer concentração testada. No entanto, NSC-124854 inibiu Pol-β-dirigida atividade de deslocamento de cadeia a 5 concentração? M, enquanto que as concentrações mais elevadas de NSC-124854 revogada completamente a formação de Strand-deslocamento produtos (Fig 2

A

;. Comparação de pista 3 com pistas 4-8, respectivamente). Quando a concentração de NSC-124854 foi posteriormente aumentada para 50 pM ou mais, a incorporação de 1-NT (24-mer produto) actividade de Pol-β foi completamente bloqueada, como mostrado pela acumulação de produtos da incisão 23-mer e a falta de um produto incorporação -nt, reflectindo uma perda completa de actividade Pol-β (Fig. 2

um

, comparar pista 3 com 4-8, respectivamente). Estes resultados sugerem que o NSC-124854 é um inibidor mais potente da actividade Pol-β entre todos os compostos testados.

Painel

Um

mostra a interacção previsto de NSC-124854 com base na estrutura de cristal de Pol-β. Pol-β é mostrado em ouro e cadeias laterais previsto para formar contatos com NSC-124854, Asp17 e Arg89, são retratados com ouro para o carbono, azul para o azoto e vermelho para o oxigênio. Os resíduos de bolso de ligação da APC, Thr79, Lys81, Arg83 de Pol-β são mostradas como esferas coloridas cinza para o carbono, azul para o azoto e vermelho para o oxigênio. contatos polares são representadas como linhas tracejadas amarelas entre NSC-124854 e resíduos de Pol-beta Lys81 e Arg89. A figura foi feita com PyMOL. Painel

B

retrata as interacções-Pol-beta ligando previsto com base na orientação de encaixe molecular posou de NSC-124854. Interações mediadas por ligações de hidrogênio (verde) e por contactos hidrofóbicos (cinza) são mostrados. NSC-124854 e Pol-β são mostradas em preto para o carbono, azul para o azoto e vermelho para o oxigênio. ligações inter-atômicas de NSC-124854 são mostrados na magenta. ligações inter-atômicas de Pol-β são mostrados em ouro. As ligações de hidrogênio são indicadas por linhas tracejadas entre os átomos envolvidos, enquanto os contatos hidrofóbicos são representados por um arco com raios que irradia para as NSC-124854 átomos entram em contato. Os átomos de Pol-beta contactadas são mostrados com raios irradiando para trás. A figura foi feita com HBPLUS e ligplot.

Para determinar o efeito dos compostos sobre o bloqueio de Pol-β-atividade, que reuniu

in vitro

ensaio de síntese de deslocamento de cadeia com purificada precut APE1

32 P-rotulados 63-mer F-DNA e Pol-β. Painel

A

(NSC-124854, NSC-143995, NSC-160172 e NSC-263659),

B

(NSC-10730, NSC-21371, NSC-43656 e NSC-91855) e

C

(NSC-274937, NSC-351093, NSC-668472 e NSC-674711) mostram o efeito de pequenas moléculas na síntese de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigida. Em cada painel, pista 1 mostra 63-mer

32 P-rotulados F-DNA, a pista 2 mostra o produto 23-mer após APE1 incisão, pista 3 mostra 1-nt incorporação (24-mer) e produtos de deslocamento de cadeia. As pistas 4-8, 9-13, 14-18 e 19-23 mostram a actividade de deslocamento de cadeia de Pol-β incubadas com 0, 5, 10, 25, 50 e 125 pM, respectivamente, dos compostos indicados. Os dados são representativos de duas experiências.

pequena molécula inibidora, NSC-124854, especificamente atividade blocos Pol-β

Nós ainda determinado se NSC-124854 é um inibidor específico da polí- actividade β ou também pode bloquear a actividade de outras enzimas Ber. Em primeiro lugar, determinou o IC

50 de NSC-124854 para a síntese de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigida. Este experimento foi o mesmo como descrito na experiência de rastreio, excepto que escolheu concentrações mais baixas para determinar o IC

50 de NSC-124854. Nós quantificada os produtos de síntese de deslocamento de cadeia (Fig. 3

Um

, pistas 3-10, respectivamente) e representados graficamente como percentagem de mudança de bloqueio NSC-124854-mediada de actividade Pol-β (Fig. 3

B

). O tratamento com NSC-124854 mostrou uma diminuição dependente da dose na actividade de síntese de deslocamento de cadeia com um IC

50 de 5,3 uM (Fig. 3

B

). Estes resultados sugerem que o NSC-124854 tem um forte efeito inibidor sobre a síntese de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigida.

Para determinar a afinidade de NSC-124854 para o bloqueio da actividade de deslocamento de cadeia Pol-β-dirigida , determinou-se a sua IC

50 em um sistema de ensaio reconstituído como descrito em na Figura 2. Painel

um

mostra o autorradiograma da actividade de deslocamento de cadeia. A pista 1 mostra

32 P-rotulados 63-mer F-DNA, a pista 2 mostra o produto 23-mer após APE1 incisão, e a pista 3 mostra a atividade de deslocamento de cadeia de Pol-β. As pistas 4-10 mostra o efeito de 0,5-20 uM de NSC-124854 sobre a actividade Pol-β. Painel

B

mostra o IC

50 dados. NSC-124854 inibiu Pol-β-dirigida actividade de deslocamento de cadeia de um modo dependente da dose com um IC

50 de 5,3? M. Os dados são do representante de duas estimativas independentes.

Em seguida, verificou-se se NSC-124854 pode inibir a atividade de outras enzimas da via BER como apurínico /apymidinic endonuclease 1 (APE1), Fen1 e DNA ligase I. os resultados mostraram que NSC-124854 não inihibit as atividades dessas enzimas (Fig 4

a Restaurant -.

C

, respectivamente). A partir destes resultados, concluiu-se que o efeito inibidor de NSC-124854, foi altamente específica para Pol-β e não afectou a actividade de outras enzimas Ber.

Painel

Um

mostra o efeito de NSC-124854 sobre a atividade APE1. APE1 (10 nM) foi incubado com diferentes concentrações de NSC-124854 (0,5-20 uM, pistas 3-9, respectivamente) e

32P-marcado com 63-mer M-ADN. As faixas 1 e 2 mostram sem cortes

32 P-rotulados 63-mer F-DNA e produtos de incisão 23-mer, respectivamente. Painel

B

mostra o efeito do NSC-124854 sobre a atividade Fen1. Fen1 (10 nM) foi incubado com diferentes concentrações de NSC-124854 (0,5-20 uM, pistas 3-9, respectivamente) e

32P-marcado com 51-mer agitou-ADN. A pista 1 mostra a posição de 51-mer oligonucleótido marcado e a pista 2 mostra o produto 11-mer aba clivado. Painel

C

mostra o efeito de NSC-124854 sobre a actividade da ADN-ligase I. ADN-ligase I (5 nM) foi incubado com diferentes concentrações de NSC-124854 (0,5-20 uM, pistas 3-9, respectivamente) seguido da adição de 2,5 nM de

32P-ADN marcado entalhado 63-mer. A pista 1 mostra 23-mer oligonucleótido marcado (produto cortado) e a pista 2 mostra 63-mer produto ligado. Os dados são representativos de duas experiências independentes

pequena molécula inibidor NSC-124854 blocos single-nucleotídeos (SN) -. E longo patch (LP) atividades -BER num reconstituído

in vitro

ensaio

com base na análise de ancoragem molecular, NSC-124854 é previsto para formar polares (uniões H) interacções com os resíduos de aminoácidos Arg89 Lys81 e e uma interacção não-polar (van der Waals) com a resíduo de aminoácido Asp17 na superfície de Pol-β [48], [49]. Estes resíduos estão em estreita proximidade da APC vinculativo bolso (resíduos de aminoácidos Thr79, Lys81 e Arg83) (fig. 1

B

). Estes contactos previstos sugerir vários contactos directos entre NSC-124854 e Pol-β, o que pode, possivelmente, imitam a interação da APC com Pol-β. Uma vez que estes dados sugerem que o NSC-124854 em combinação com TMZ como uma possível estratégia de tratamento quimioterápico para câncer colorretal, que realizou um estudo para determinar a eficácia e as limitações desta estratégia.

Embora determinada a especificidade do NSC- 124.854 para a actividade Pol-β como mostrado na Fig. 3 e 4, que era necessária para examinar o efeito deste composto, quando o sistema completo de BER SN e LP-BER é montado. Estas experiências irá fornecer evidências bioquímicas para a potência do NSC-124854. Nós usamos 63-mer

32 P-rotulados U-DNA como substrato (Fig. 5

A

) para SN-BER. Desde Fen1 é necessária para a actividade de Lp-BER e pode estimular Pol-β actividade para a síntese de deslocamento de cadeia [50], [51], adoptámos mesma estratégia para determinar o efeito de NSC-124854 em LP-RIC (Fig. 5

B

). Após APE1 incisão, um produto de 23-mer esperado foi gerado (Fig 5

C

;. Comparar faixa 1 com a 2). Os resultados mostraram eficientes incorporação 1-nt (produto 24-mer) pela Pol-β, que foi ligado com DNA ligase I para gerar 63-mer produto reparado (Fig. 5

C

, pista 5). A adição de Fen1 estimulou a actividade Pol-β para a síntese de deslocamento de cadeia (Fig. 5

C

, pista 4), que também foi ligado com ligase de ADN I para gerar 63-mer produto reparado (Fig. 5

C

, pista 6). A adição de NSC-124854 bloqueado Pol-dirigida-β 1-NT (produto 24-mer, na ausência de Fen1) adição (Fig. 5

C

, comparar pista 3 com 7), bem como Strand- síntese de deslocamento na presença de Fen1 de um modo dependente da dose (Fig. 5

C

, comparar pista 4 com pistas 8-11, respectivamente). Além disso, a reparação completa por Sn- e LP-ber sub-percursos, após a adição de ADN-ligase I foi também bloqueada pelos NSC-124854 de um modo dependente da dose (Fig. 5

C

, comparar pistas 12 -15 e 16-19, respectivamente).

Painéis

a e B

representam os protocolos da SN e LP-BER, respectivamente. Painel

C

mostra a autoradiogram descrevendo o efeito de concentrações variadas de NSC-124854 sobre as atividades SN e LP-Ber. A pista 1 mostra 63-mer

32P-marcado L-ADN, a pista 2 mostra o produto 23-mer após APE1 incisão, a Pista 3 mostra um nt incorporação por Pol-β, pista 4 mostra os produtos de deslocamento de cadeia após a adição de Fen1. As pistas 5 e 6 mostram o produto 63-mer ligado de atividades SN e LP-Ber, respectivamente. Pista 8-19 mostra o efeito de NSC-124854 no bloqueio de 1-NT (24-mer produto) incorporação. Lanes 8-11 retratam bloco NSC-124854-mediada da síntese de deslocamento de cadeia. Além disso, pistas 12-15 e as pistas 16-19 mostram o efeito da NSC-124854 no bloqueio de SN e actividades LP-BER de um modo dependente da dose. Dados é uma representativos de três experiências diferentes.

A expressão do tipo selvagem APC faz com que a resistência ao tratamento TMZ que é abolida pelo tratamento com NSC-124854

Em estudos anteriores, demonstraram que a APC interage com Pol-β e Fen1 e blocos SN e actividades LP-ber [14], [45], [46], [52] – [54]. Também demonstramos que as células HCT-116 (expresso do tipo-selvagem APC) são mais sensíveis a methylmethane sulfonato (MMS) e tratamentos TMZ do que HCT-116-APC (KD) células (APC bateu-se com pSiRNA) [36], [45], [46]. No presente estudo, determinou-se a sensibilidade do TMZ na presença de NSC-124854 a várias linhas celulares de cancro do cólon (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + ch3, Caco-2, HT29, SW480, LoVo e RKO) utilizando um ensaio clonogénico [18], [36], [46]. O IC

50 resultados demonstraram que todas as linhas celulares testadas mostraram uma sensibilidade mais elevada para o tratamento de combinação de NSC-124854 com TMZ (Tabela 1). A IC

50 dados mostraram que NSC-124854 foi capaz de aumentar o efeito inibidor do crescimento de TMZ para ambas as linhas celulares HCT-116 e HCT-116-APC (KD); No entanto, o efeito foi maior no HCT-116 do que no HCT-116-APC (KD) de células (Tabela 1). Estes resultados confirmam os resultados anteriores de que a APC do tipo selvagem pela inibição da via BER aumenta a sensibilidade de drogas alkylaying-ADN [36], [46], [54]. No entanto, outras linhas celulares que expressam qualquer um de tipo selvagem ou truncada da APC, tais como RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) e HT29 (110 e 200 kDa) não mostram uma correlação directa do papel do APC na sensibilidade destes fármacos. Estes resultados sugerem que outros do que mutações em fatores genéticos do

gene APC

pode também desempenhar um papel na determinação da sensibilidade do NSC-124854 e TMZ a diferentes células cancerígenas do cólon. Um dos parâmetros críticos para esta sensibilidade diferencial é controlado pelo estado de actividade diferencial MMR, o qual é discutido abaixo.

tratamento de combinação de NSC-124854 aumenta efeito inibidor do crescimento de TMZ na MMR e deficiente células MMR-proficientes cancro do cólon

proteínas MMR estão envolvidos na resposta quimioterapêutico de células de câncer de cólon e de defeitos na proteína (s) MMR está presente no câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) [55]. Duas das proteínas MMR são mais comumente mutado em cancros humanos, MLH1 e MSH2. MMR células deficientes são frequentemente resistentes aos agentes de alquilação do ADN [55]. Para determinar o papel da MMR na combinação de efeito NSC-124854 com TMZ sobre a inibição do crescimento, utilizou-se diversas linhas celulares de cancro do cólon MMR-proficientes e MMR-deficiente. HCT-116, HCT-116-APC (KD), e RKO linhas de células são deficientes em MMR devido à falta de expressão de hMLH1, uma enzima chave desta via de [56], enquanto as células LoVo são MMR deficiente devido à ausência de expressão MSH2 [57]. A-116 HCT + ch3 célula foi feita MMR-proficientes através da introdução de uma única cópia do cromossomo 3 abrigar o

hMLH1

gene [58]. TMZ é conhecido por causar resistência a MMR células deficientes em [26]. Em estudos anteriores, tem sido sugerido que a ruptura de via BER pode abolir a resistência a drogas causada por deficiência de MMR-[59]. No presente estudo, determinou-se o tratamento da TMZ sensibiliza células MMR-proficientes comparativamente mais do que as células MMR-deficientes, e se o bloqueio da BER via pela NSC-124854 pode abolir a resistência TMZ para células MMR-deficientes. Como esperado, as linhas celulares de MMR-proficientes SW480 (IC

50 108,1 ± 3,2 uM), HCT-116 + CH3 (IC

50 130,7 ± 4,3 uM) e Caco-2 (IC

50 449,2 ± 42,4 mM), exceto HT29 (IC

50 962,7 ± 62,7 mM) mostrou uma maior sensibilidade ao TMZ, em comparação com MMR deficiente em linhas de células HCT-116 (IC

50 739,0 ± 25,9 mM), HCT-116- APC (KD), (IC

50 877,7 ± 49,2 uM), LoVo (IC

50 838,8 ± 53,1 uM) e RKO (IC

50 1572,6 ± 89,9 uM) (Tabela 1). Além disso, o tratamento de combinação de NSC-124854 reduziu ainda mais o IC

50 de TMZ por duas vezes em todas as sete linhas de células, independentemente do seu estado de actividade MMR (Tabela 1). Estes resultados sugerem que o tratamento de combinação de NSC-124854 com TMZ pode ser uma estratégia quimioterapêutico útil para a gestão de ambos os tumores MMR-deficientes e MMR-proficientes colorretais.

Combinação de NSC-124854 com TMZ pode ser usado como uma abordagem potencial quimioterápico para aumentar o crescimento do tumor do cólon

in vivo

para verificar ainda mais o

in vitro

resultados da eficácia do tratamento de combinação de NSC-124854 e TMZ com um alvo bem caracterizados e específica de Pol-β para reduzir as doses de TMZ que podem eliminar os efeitos colaterais e, simultaneamente, abolir o MMR-resistência, foi realizada uma

in vivo

estudo xenotransplante utilizando imunodeficientes combinados graves ( SCID, sem células T e B funcionais) do rato, como descrito na Figura 6

Um

. A nossa escolha para os ratos do sexo feminino foi baseada em estudo recente descreve que os estimados novos casos de câncer de cólon em 2009 foi previsto para ser maior no sexo feminino em relação ao masculino [60]. Nós escolhemos uma dose de 20 mg /kg de peso corporal de TMZ para estas experiências, que é 10- e 4 vezes mais baixa do que a dose máxima tolerada em ratinhos e humanos, respectivamente [61] – [65]. Além disso, a dose de 10 mg /kg de peso corporal para NSC-124854 é mais de 20 vezes menor do que o seu IC

50 em cultura (Tabela 1). Apesar de não ter determinado a dose máxima tolerada (MTD) do NSC-124854 em ratos, a concentração escolhida é muito na gama mais seguro.

Painel

A

mostra a representação esquemática do protocolo experimental. Painel

B

mostra a mudança no volume do tumor no 42

ND dia da experiência. Os dados apresentados são a média ± DP de quatro a seis animais em cada grupo. *, Significativamente diferente do controlo;

†, significativamente diferente do NSC-124854. P . 0,05

Estas drogas foram administradas por via intraperitoneal (.

i.p

) durante cinco dias consecutivos. A inibição do crescimento dos tumores foi monitorizado até 42 dias. Os resultados mostraram um aumento no volume do tumor no grupo de controlo de uma maneira dependente do tempo para todas as linhas celulares,

ie

, HCT-116, HCT-116-APC (KD) e HCT-116 + CH3. O volume do tumor atingiu um máximo de 1,120 mm

3 a 42 dias de implantação de xenoenxerto, que é mostrado na Figura 6

B

. O crescimento do tumor não tratado no HCT-116 xenoenxerto foi maior do que HCT-116-APC (KD) e 116-CH3 HCT + células. O efeito anti-tumoral de TMZ sozinho foi significativamente diferente em HCT 116 + células CH3 (MMR-proficientes) e foi menos pronunciado no HCT-116 e HCT-116-APC (KD) de células (Fig. 6

B

). O tratamento com NSC-124854 sozinho também diminuiu o crescimento de tumores com todas as linhas de células, que foi mais pronunciada quando foi combinada com TMZ (Fig. 6

B

). Estes resultados sugerem que o tratamento de combinação de NSC-124854 aumenta a eficácia terapêutica de TMZ igualmente bem tanto em modelo de tumor de xenoenxerto de MMR-deficiente e MMR-proficientes

In vivo

. Para determinar a tolerância das drogas, nós gravado o peso corporal dos animais duas vezes por semana até ao fim da experiência. Os resultados mostraram um ganho de peso corporal semelhante nos de controlo e grupo tratado de animais com NSC-124854 e TMZ sozinho ou em combinação (dados não mostrados). Assim, verifica-se que as doses de 10 mg /kg de peso corporal para NSC-124854 e 20 mg /kg de peso corporal para TMZ foram bem tolerados e não causou quaisquer efeitos secundários adversos óbvios nos nossos animais experimentais.

discussão

Em estudos anteriores, Pol-β tem sido utilizado como um alvo para o desenvolvimento de fármacos quimioterapêuticos [23], [34], mas não chegaram para além do nível pré-clínico. A eficácia dos compostos anteriores tem sido menos eficaz, porque eles exigem concentrações muito elevadas para conseguir a citotoxicidade desejado

in vitro

e eles não foram testados sistematicamente

in vivo

. Além disso, eles foram principalmente direcionados para bloquear SN-BER. A utilização de TMZ para o tratamento de outras de glioblastoma e melanoma malignas tem sido limitada, especialmente para o tratamento de tumores colorrectais, devido ao efeito menos pronunciado sobre a supressão do crescimento de tumores [39], [40]. No presente estudo, utilizou-se abordagem molecular com base na estrutura para identificar pequenas moléculas que podem imitar a interacção de APC com Pol-β e BER bloco Pol-β-dirigida que pode ser utilizado como um alvo quimioterapêutico. A nossa estratégia de acoplamento molecular no bolso APC-ligação de Pol-β foi identificar uma pequena molécula que pode bloquear ambas as atividades SN e LP-BER e demonstrar citotoxicidade tanto em

in vitro

e

In vivo

ensaios em concentrações mais baixas

Notavelmente, se for bem sucedida, a estratégia proposta vai ser altamente eficaz na prevenção de ambos os cancros colo MMR-proficientes e MMR-deficiente.; esta é de importância porque os cancros colo-MMR deficientes constituir um maior risco de resistência a drogas de alquilação de ADN, devido a sobre-expressão de MGMT ou MMR-deficiência [27] – [29]. As células deficientes em MGMT são incapazes de processar a O

6meg durante a síntese de DNA, e se não reparados, um G: C para G: mutação de transição T ocorre [27]. O G: incompatibilidade T é então reparado por MMR caminho [28]. No entanto, se o O

6meg não for reparado antes da etapa de re-síntese de MMR, a timina é susceptível de ser re-inserida oposto à lesão. Acredita-se que o ciclo repetitivo dos resultados MMR fúteis para uma geração de lesões terciárias, mais provavelmente ADN gapped.