Sumário

a invasão de células do cancro, um dos eventos cruciais para o crescimento local e disseminação metastática de tumores, possuem um amplo espectro de mecanismos, especialmente a expressão alterada de metaloproteinases de matriz. GAS-500 é um romance flavonóide sintetizado com actividade anti-cancro forte, cujo mecanismo molecular exacto permanece incompletamente compreendida. Este estudo foi desenhado para examinar os efeitos da LFG-500 sobre a metástase do tumor usando

in vitro

e

in vivo

ensaios. GAS-500 poderia inibir a adesão, migração e invasão de células MDA-MB-231 células de carcinoma da mama humano. Enquanto isso, reduziu as actividades e expressão de MMP-2 e MMP-9 por meio de supressão da activação transcricional de NF-kB em vez de AP-1 ou STAT3. Além disso, GAS-500 reprimido induzido TNF-α invasão celular através da inibição de NF-kB e subsequente actividade de MMP-9. Além disso elucidação do mecanismo revelou que a PI3K /AKT mas não MAPK via de sinalização foi envolvido no efeito inibitório da LFG-500 na activação do NF-kB. LFG-500 também poderia suprimir a metástase pulmonar de células de melanoma murino B16F10

in vivo

. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que LFG-500 poderia bloquear a invasão de células do cancro por meio de infra-regulação da via PI3K /AKT /via de sinalização de NF-kB, que proporciona novos dados para a actividade anti-cancro de biogás-500.

citação: Li C, Li F, K Zhao, Yao J, Cheng Y, Zhao L, et ai. (2014) LFG-500 inibe a invasão das células cancerosas através de Down-Regulação da PI3K /AKT /NF-kB via de sinalização. PLoS ONE 9 (3): e91332. doi: 10.1371 /journal.pone.0091332

editor: Zhe Zhang, Xuzhou Medical College, China

Recebido: 01 de novembro de 2013; Aceito: 09 de fevereiro de 2014; Publicação: 11 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da China (No. 21072232), o Programa de Projetos de Estado Key Laboratório de Medicamentos Naturais, Universidade Pharmaceutical China (No. JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303, SKLNMZZJQ201302), a Fundação de Ciência Natural da província de Jiangsu (Sem . BK2011620, BK20130220), o Programa de Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa inovativa em University (IRT1193), a Science Projeto de Tecnologia Major (No. 2013ZX0 9103-001-007, 2012ZX09304-001), o projecto financiado pela China de Pós-Doutorado Science Foundation (2013M 541.733), os projectos previstos Jiangsu para fundos de pesquisa de pós-doutorado (1301015B) e da Fundação de Ciência Natural do Superior Instituições de educação da província de Jiangsu (13KJB350007). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Ativação invasão e metástase, a marca fundamental de câncer [1], tem sido amplamente reconhecida como a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer. membranas basais excessiva e degradação da matriz extracelular (ECM) é crucial para a invasão tumoral e metástase [2]. As metaloproteinases de matriz (MMPs), uma família de endopeptidases dependentes de zinco, estão associadas com a invasão de células de tumor e a metástase [3], [4]. MMPs segregadas-tumorais pode hidrolisar componentes da matriz extracelular nos tecidos circundantes do tumor, o que facilita a invasão de células tumorais através da membrana basal para órgãos distantes e metástase resultante em [5]. Entre as MMPs, a MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa) e MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) têm um papel central na degradação da ECM [6]. Por conseguinte, eles são abundantemente expressa em vários tumores malignos [7]. Portanto, as MMPs e as suas vias reguladoras são considerados como alvos promissores para fármacos anti-cancro e agentes quimioterapêuticos [8].

É geralmente demonstrado que a proteína-quinase fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /AKT e mitogen- activada (MAPK) vias de sinalização regulam a metástase em uma variedade de células cancerosas [9], [10]. A activação de factores de transcrição a jusante, incluindo activador de proteína 1 (AP-1), a STAT3, e factor nuclear-kB (NF-kB) são relatados para estimular a expressão de MMP a nível transcricional [11]. Especialmente, o NF-kB, o factor de transcrição extremamente importante em células de cancro, tem sido implicada em muitos indicativos do desenvolvimento de cancro, incluindo da proliferação independente de factor de crescimento, a apoptose prevenção, ilimitado replicativa potencial e tecido invasão e metástase [12], [13] . proteínas NF-kB compreende uma família de factores de transcrição estruturalmente relacionados, incluindo p50 (NF-κB1), p65 (RelA), c-Rel, p52, e RelB. Entre estes factores, única p65, RelB, e c-rel contêm domínios de transactivação potentes dentro de sequências C-terminais ao domínio de homologia Rel (RHD), que contém as regiões de ligação ao ADN e de dimerização. Activado NF-kB está presente no núcleo onde se liga a sequências de ADN específicas denominadas elementos de resposta e regula a transcrição de genes alvo. Enquanto no citoplasma, o NF-kB é mantido num estado inactivo, que se complexa com as proteínas IkB inibitórios. NF-kB pode ser activada através da via dependente de IKK clássica levando a translocação nuclear de heterodímeros p50 /p65 [14].

Os flavonóides são um grupo de compostos ricos em sementes, frutas de citrinos, chá, azeite de oliva, e vinho tinto. Nos últimos anos, os efeitos anti-tumorais de flavonóides tem sido amplamente reconhecida e estudada, em especial a sua potente actividade anti-metástases [15], [16]. De acordo com estudos anteriores, os flavonóides poderiam inibir a formação e secreção de MMP invadopodia [17] e impedir a migração de células por cima-regulação da expressão de transgelin [18]. As múltiplas ações são atribuíveis à sua estrutura poli-fenólica. No entanto, os flavonóides têm biodisponibilidade oral muito baixa devido ao seu extenso metabolismo de primeira passagem, que seria mais provável acontecer os seus grupos hidroxilo. Portanto, com base na estrutura de flavonóides, LFG-500 (C

30H

32N

2O

5, Fig. 1A), foi concebido para melhorar a biodisponibilidade oral e evitar o metabolismo de flavonóides no seu hidroxilo grupos através da introdução de uma piperazina e um grupos benzilo. Estas substituições também deu GAS-500 melhor solubilidade lipídica, o que torna mais fácil para entrar no espaço intracelular. Nosso estudo anterior demonstrou que LFG-500 induziu apoptose através de espécies reactivas de oxigénio (ROS) via -mitochondrial mediada em células HepG2 [19]. Uma vez que a metástase é extremamente importante na progressão do cancro, que é essencial para investigar o efeito de biogás-500 sobre a metástase do cancro e do mecanismo envolvido. As consequentes descobertas podem fornecer novas evidências da atividade anti-câncer do LFG-500, bem como flavonóides.

(A) Estrutura química da LFG-500. (B) Efeito inibidor de biogás-500 no crescimento de células MDA-MB-231 durante 24 h. ensaio de MTT foi empregue. (C) ensaio de exclusão de azul de tripano de corante de GAS-500 no crescimento de células MDA-MB-231. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de GAS-500 durante 24 h. (D) LFG-500 (8 uM) não tem qualquer influência sobre o tamanho e a forma das células normais (× 200, a barra de escala representa 30 um). (E) Efeito inibidor de biogás-500 sobre a adesão de células MDA-MB-231 para a fibronectina. A suspensão de células (100 ul, 2 x 10

5 células /ml) foi adicionada a placas pré-revestidas de fibronectina e incubados a 37 ° C durante 1 h. Em seguida, o meio de cultura foi cuidadosamente aspirado. Cada poço foi lavado três vezes com PBS. ensaio de MTT foi adoptado para determinar o número de células aderentes. (F) LFG-500 inibe a migração celular. monocamada de células foi ferido por uma ponteira 200 mL amarelo seguido de tratamento com várias concentrações (2, 4 e 8 mm) de LFG-500 para 24 h. O número de células na zona desnudada foi quantificada sob um microscópio invertido. As linhas brancas indicam a borda da ferida. As células migraram através das linhas brancas foram contados em seis campos aleatórios de cada tratamento. Fotografias da ferida de células tratadas com o LFG-500, × 100 (esquerda). Quantificação das células que migraram (direita). (L) LFG-500 inibe a invasão da célula. Fotografias da célula invadida coradas pelo HE, 200x (esquerda). Quantificação das células invadidas (direita).

* P Art 0,05 ou

** P

. 0,01 representa a diferença significativa em relação ao grupo controle

Materiais e Métodos

ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade Pharmaceutical China. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Materiais

LFG-500 (99,1% de pureza), fornecido pelo professor Zhiyu Li (China Pharmaceutical University, China), foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração de 10 mM como a solução de primário. A solução foi armazenada a -20 ° C, e diluiu-se com meio antes de cada experiência. Os controlos foram tratados com a mesma quantidade de DMSO (0,1%) como utilizado em experiências correspondentes. Para

in vivo

estudo, solução LFG-500 foi preparado pela Escola de Farmácia de China Pharmaceutical University. Dacarbazina (DCTC, Nanjing empresa farmacêutica, China), foi adoptado como o controlo positivo, que foi dissolvido em NaCl a 0,9% antes da utilização. Fibronectina e Matrigel foram adquiridos a BD Biosciences (Bedford, MA, EUA) [20]. Os anticorpos para a MMP-9 (H-129) (SC-10737), MMP-2 (H-76) (SC-10736), c-Jun (D) (SC-44), c-Fos (4) (SC -52), NF-kB p65 (C-20) (SC-372), lamina A (133A2) (SC-56137), IKKα /β (H-470) (sc-7607), IgG (H-270) (SC-66913), a GFP (FL) (sc-8334), P-ERK1 /2 (177 Thr /Thr 160) -R (sc23759-R), a JNK (D-2) (sc-7345), P- JNK (G-7) (sc-6254), p38 (H-147) (sc-7149), p-p38 (Thr 180) (SC-101758), AKT1 /2/3 (H-136) (SC- 8312), β-actina (SC-130301), e proteína A-agarose (sc-2001) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos para a STAT3 (T721) (BS-1336), p-STAT3 (S727) (BS-4180), p-STAT3 (Y705) (BS-4181), ERK1 /2 (L352) (BS1112), PI3K p85α /γ (Y463) (BS-3006), e p-AKT (S246) (BS-4286) foram adquiridos a Bioworld (St. Louis Park.nneapoli, MN, EUA). Os anticorpos para P-IKKα /β (Ser176 /180) (16A6) (# 2697), IκBα (44D4) (# 4812), e p-IκBα (Ser32) (14D4) (# 2859) foram de Cell Signaling Technology, Inc . (Beverly, MA, EUA). MTT, azul de tripano, gelatina, paraformaldeído, formaldeído, glicina, Triton X-100, DAPI, Tris, NaCl, Hepes, KOH, KCl, EDTA, NP-40, PMSF, NaF, SDS, DTT, e NaHCO

3 foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

Animais

Homem ratinhos C57BL /6 (6-8 semanas de idade), pesando 20-25 g foram obtidos a partir da Shanghai animais de Laboratório Center (Xangai, China). Os animais foram mantidos num ambiente de temperatura e humidade controladas com um 12: 12-h ciclo de luz /escuro. Alimento e água estavam disponíveis

ad libitum

. Todos os procedimentos experimentais e cirúrgicos animais eram estritamente realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

cultura celular

MDA-MB-231 (uma linha de células de carcinoma da mama humano) e B16F10 (uma linha de células de melanoma murino altamente metastático) foram adquiridos a partir da Cell Bank do Instituto Xangai de Biologia celular (Xangai, China). MDA-MB-231 e B16F10 As células foram cultivadas em L15 de Leibovitz e meio DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), respectivamente, ambas as quais contêm soro de bovino fetal a 10% (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA ), 100 U /mL de penicilina (Beyotime, Nantong, China), e 100 ug /ml de estreptomicina (Beyotime, Nantong, China). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 95% ar /5% de CO

2 a 37 ° C.

colorimétrico MTT ensaio

As células (10

4 /poço) foram semeadas em Falcon placas de 96 poços (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) durante 24 h e, em seguida, expostas a diferentes concentrações de GAS-500. Após incubação durante 24 h, 20 uL de 5 mg /ml de MTT foi adicionado ao meio, e as células foram incubadas a 37 ° C durante mais 4 h. Em seguida, o meio de cultura foi rejeitado e 100 mL de DMSO foi adicionado a cada poço para dissolver o precipitado. A absorvância (A) foi medida a 570 nm utilizando um leitor automatizada Microplated ELx800 (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT, EUA). velocidade de inibição de crescimento celular (I%) foi calculada pela seguinte equação: onde A

tratados e A

controlo eram a absorvância média de três experiências em paralelo a partir de grupos tratados e de controlo, respectivamente. IC

50 foi tomada como a concentração que causou 50% de inibição do crescimento de células e foi calculada pelo método logit.

tripano de corante azul de exclusão ensaio

Depois de exposta à GAS-500 em as concentrações indicadas, durante 24 h, as células foram colhidos e misturados com 0,4% de azul de tripano. Em seguida, ambos imaculada (viável) e coradas células (não viáveis) foram contados separadamente com uma câmara de contagem de células (Qiujing, Xangai, China) sob o microscópio. (CX21; Olympus, Tóquio, Japão)

celular avaliação morfológica

As células foram semeadas em placas de cultura de células de 6 poços (Corning, Nova Iorque, NY, EUA) e tratou-se com GAS-500 (8 uM), durante 24 h. No final da incubação, a morfologia das células foi monitorizada utilizando um microscópio de luz invertido (IX51, Olympus Corp., Tóquio, Japão).

A adesão celular ensaio

ensaio de adesão celular foi realizada como descrito [ ,,,0],20], com modificações. placas de 96 poços foram revestidas com fibronectina (5 ug /ml) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, bloqueadas em BSA (1%) durante 1 h. células privadas de soro foram expostas a GAS-500 (2, 4, ou 8 mM) durante 24 horas antes da sementeira. As células alvo foram recolhidas e suspensas em meio isento de soro. As células (2 x 10

5 /ml) foram semeadas em placas revestidas com fibronectina e em seguida incubadas a 37 ° C durante 1 h. As células não aderentes foram removidas por lavagem suave com PBS. Em seguida, o ensaio de MTT colorimétrico foi utilizado para analisar a capacidade de adesão de células.

cicatrização de feridas ensaio

As células foram semeadas em placa de 6 poços e deixou-se crescer a 80% de confluência. Subsequentemente, monocamada celular foi riscada com uma ponta de pipeta (Axygen, Union City, CA, EUA) para criar um intervalo estreito ferida semelhante. Pouco tempo depois do ferimento, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com o LFG-500 (2, 4, ou 8 mM). As placas foram fotografadas em 0, 12 e 24 h usando um microscópio de luz invertida. O número de células que migraram foi quantificada por contagem manual e seis campos escolhidos aleatoriamente foram analisadas para cada poço [21].

invasão celular ensaio

sistema de câmara de Transwell (10 mm de diâmetro, 8 de poro tamanho com membrana de policarbonato, Corning Costar, Cambridge, MA) revestidas com matrigel foi empregado para examinar a capacidade invasiva de células de cancro in

in vitro

como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, as câmaras Transwell foram inicialmente revestidos com Matrigel (40 ug /100 uL /​​câmara) a 37 ° C durante 1 h. As células tratadas com ou sem GAS-500 (2, 4, ou 8