Abstract

Purpose

silenciamento induzido por metilação do

PRSS3

tem sido mostrados para ser significativamente associada com o câncer de bexiga invasivo e expressão do

C16orf74

locus do gene foi mostrado para correlacionar positivamente com

PRSS3.

o objetivo do estudo foi avaliar a relação entre

C16orf74

nível de expressão e progressão na não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC).

Materiais e Métodos

C16orf74

níveis de mRNA foram examinadas por reais análise transcriptase reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) de 193 amostras de tumor de pacientes com NMIBC primária -time reversa. dados de expressão foram analisados ​​em termos de parâmetros clínicos e experimentais. curvas e modelos de regressão multivariada de Cox Kaplan-Meier, respectivamente, foram usadas para determinar a sobrevivência livre de progressão e identificar parâmetros preditivos independentes de progressão.

Resultados

análise utilizando curvas de Kaplan-Meier revelou prolongado sobrevida livre de progressão de alta

C16orf74

-expressors em comparação com baixo-expressores (p 0,001). análise de regressão multivariada de Cox revelou que o baixo

C16orf74

níveis de expressão de mRNA são um fator de risco significativo para a progressão da doença em pacientes com primário NMIBC (HR: 10,042, CI: 2,699-37,360, p = 0,001)

Conclusões

a diminuição da expressão de

C16orf74

correlaciona-se significativamente com a progressão na NMIBC primário.

C16orf74

nível de expressão representa um marcador potencialmente útil para prever a progressão em pacientes NMIBC primários

Citation:. Kim WT, Yun SJ, Parque C, Kim IY, Lua SK, Kwon TG, et al . (2010) Identificação de

C16orf74

como um marcador de progressão na Primária não-músculo invasivo cancro de bexiga. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10.1371 /journal.pone.0015260

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de Agosto de 2010; Aceito: 02 de novembro de 2010; Publicação: 21 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa Básico de pesquisa da ciência por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0.001.730). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mais de 90% dos cancros da bexiga são carcinomas de células transicionais, ea maioria são papilar, bem ou moderadamente diferenciado não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC) [1] – [2]. Após a ressecção endoscópica, a recorrência do cancro ocorre na maioria (50-70%) de doentes com NMIBC [3]. Aproximadamente 20% desses pacientes, subsequentemente, detectar a progressão da doença para o músculo do cancro da bexiga invasivo (MIBC), após um tratamento adequado, incluindo ressecção transuretral (TUR), e terapia intravesical com epirrubicina, mitomicina-C, ou de Bacillus de Calmette-Guerin (BCG) [1] – [2]. Assim, a recorrência frequente após TUR e progressão do câncer subsequente são problemáticos para pacientes e urologistas igualmente. Quase 25% dos pacientes com câncer de bexiga recém-diagnosticados têm CINM, ea grande maioria destes casos são de alto grau histológico. Quase 50% dos pacientes com MIBC já oculta metástases distantes no momento do diagnóstico [1] – [2]

Um número de marcadores tumorais potenciais foram identificadas para o cancro da bexiga, mas poucos têm demonstrado eficácia no. termos de previsão de recorrência da doença e progressão. No entanto, vários estudos recentes têm sugerido que os genes supressores de

p53

,

RUNX3

,

RASSF1A

, e

PRSS3

estão intimamente associados com o desenvolvimento e progressão do cancro da bexiga [4] – [7]. Especificamente,

RASSF1A

e

PRSS3

metilação do promotor está associada com o estágio do tumor avançado [7], o que sugere que esses genes podem estar associados à progressão do cancro da bexiga.

PRSS3

por sua vez, foi mostrado para ser associado positivamente com o

C16orf74

expressão [8].

O

C16orf74

(MGC17624) locus do gene está ligado 16q24.1 cromossoma, e a sua função ainda não foi caracterizado. Os resultados de vários estudos genômicos têm indicado que

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está envolvido em processos inflamatórios. factor de necrose tumoral (TNF) -α é um regulador chave da cascata inflamatória em doenças inflamatórias crónicas e em pacientes com doença inflamatória,

C16orf74

está fortemente associada com uma resposta anti-TNF [9].

C16orf74

é um gene regulado hipoxia [10] – [11]. Winter et al. [10] relatou que

C16orf74

nível de expressão do RNA mediano é um fator prognóstico independente para sobrevida livre de recorrência do câncer de cabeça e pescoço.

C16orf74

também foi mostrado para ser regulada em linfáticos metástases-positivos em pacientes com carcinoma de células escamosas língua oral [12], e correlacionar positivamente com

expressão PRSS3

no cancro da mama [8 ].

recentemente, nós relatamos a identificação de um classificador gene relacionado à progressão que teve forte valor preditivo em termos de evolução das doenças em NMIBC [13]. Nesse estudo,

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foi um dos oito genes candidatos identificados para prever a progressão da doença em NMIBC, sugerindo uma potencial relação entre o câncer de bexiga e

C16orf74

. No presente estudo, avaliou-se a relação entre o

C16orf74

e resultados NMIBC usando dados de uma população estudo anterior, bem como os novos casos, todos com longo prazo de seguimento.

Resultados

1. As características basais

A média de idade dos 193 indivíduos com NMIBC primário foi 64,1 ± 14,0 anos, eo período médio de acompanhamento foi de 44,9 meses. Setenta e um pacientes (36,8%) apresentou recorrência e 20 (10,4%) progressão experimentada. Outras características basais dos pacientes são apresentados na Tabela 1.

2. O valor de

C16orf74

nível de expressão de mRNA como um marcador de prognóstico para a progressão

A relação entre

foi analisada C16orf74

nível de expressão de mRNA e tempo de progressão. Utilizando uma curva ROC, foi determinado um valor de corte (11,7784) para a progressão, com a maior sensibilidade combinada (53,2%) e especificidade (85%). O tempo para progressão foi significativamente diferente entre os

C16orf74

grupos de expressão de mRNA altas e baixas, em que o tempo para a progressão na alta

C16orf74

grupo expressão foi significativamente maior do que o grupo de expressão baixa (p 0,001) (Fig. 1). Na análise univariada de regressão de Cox de diversas variáveis ​​clínico-patológicos (idade, sexo, tamanho do tumor, número, grau, palco, a terapia intravesical, e

C16orf74

níveis de expressão de mRNA), idade, terapia intravesical e

C16orf74

níveis de expressão de mRNA foram fatores de risco significativos para a progressão (p = 0,031, p = 0,034 e p 0,001, respectivamente). Na análise de regressão de Cox multivariada, a idade e baixa

C16orf74

níveis de expressão de mRNA foram fatores de risco significativos para a sobrevida livre de progressão em pacientes com primário NMIBC (HR: 1.049, CI: 1,005-1,094, p = 0,030; e HR : 10,042, CI: 2,699-37,360, p = 0,001, respectivamente) (Tabela 2). Na análise multivariada de regressão de Cox em pacientes com terapia intravesical, idade e baixos níveis de expressão de mRNA C16orf74 foram fatores de risco significativos para a sobrevida livre de progressão em pacientes com NMIBC primária com a terapia intravesical (HR1.055, CI: 1,005-1,108, p = 0,031; e HR: 14,170, CI:. 2,719-73,837, p = 0,002, respectivamente)

Discussão

a tripsina é um membro da família de serina-protease codificada por três trypsinogen genes, incluindo

PRSS1

,

PRSS2

e

PRSS3

codificam trypsinogen I, trypsionogen II, e tripsinogênio IV (também conhecido como mesotrypsinogen), respectivamente [14] – [16] . Este enzima tem sido conhecido como um potente enzima proteolítica que podem destruir o tecido [17] – [18]. Existem relatórios na literatura do papel de tripsina ou PRSS3 em progressão tumoral, com alguns estudos atribuindo um papel positivo [19] – [23], enquanto outros têm relatado que a tripsina ou PRSS3 desempenha um papel supressor de tumores. A expressão de PRSS3 é reduzida em bexiga, do esófago, e cancros gástricos, e perda de expressão PRSS3 é devido ao silenciamento epigenética por hipermetilação do promotor [7], [24] – [25]. Em particular, silenciamento de

PRSS3

por metilação do promotor foi significativamente associada com o estágio do tumor invasivo no cancro da bexiga [7].

A expressão de

C16orf74

foi mostrado para correlacionam-se positivamente com o

PRSS3

. Hockla et ai. [8] relatou que

C16orf74

é baixo regulada por knockdown de

PRSS3 Comprar e regulada por mesotrypsin tratamento. Até o momento, não houve relatos de uma associação de

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com cancro da bexiga, exceto quando indicado em um trabalho anterior dos autores [13]. Aqui, analisamos a relação entre os níveis de expressão de mRNA de

C16orf74

e progressão na NMIBC primário. redução da expressão de

C16orf74

foi significativamente associada com a progressão da doença em pacientes NMIBC, sugerindo que

C16orf74

tem um papel supressor tumoral, similar ao

p53, RUNX3

e

PRSS3

, na progressão da doença. Até à data, a função de

C16orf74

é desconhecido, e estudos adicionais são necessários para definir o caminho preciso pelo qual

C16orf74

progressão influências no NMIBC primário.

Geralmente, clínica e os parâmetros patológicos, tais como o grau do tumor, estágio do tumor, invasão linfática, tamanho do tumor, CIS, papilar ou arquitetura de tumor sólido, e multifocalidade foram considerados parâmetros prognósticos úteis para progressão da doença em NMIBC. Desses fatores, em geral, o grau do tumor, estágio e presença de CIS são considerados os mais importantes. No estudo atual, a terapia intravesical foi um fator de risco para a progressão na análise univariada. No entanto, é possível que os pacientes que receberam terapia intravesical foram em um grupo clinicamente alto risco de recorrência ou progressão, ao invés de que o tratamento afectado progressão [26]. Vários marcadores moleculares também foram avaliados quanto à progressão da doença. Recentemente, vários estudos identificaram genes relacionados com a progressão putativos em NMIBC usando análise de expressão gênica [27] – [29]. Wang et al. [27] propôs um painel de 57 genes para ajudar a prever a progressão na NMIBC. Birkhahn et ai. [28] relatou que

HRAS

,

VEGFR3

, e

VEGF

níveis de expressão foram relacionados à progressão com sensibilidade de 81% e 94% de especificidade. Eguchi et ai. [29] relataram que a perda de 8p23.3 é um marcador para prever a progressão e recorrência em NMIBC. Anteriormente, nós identificamos um candidato relacionadas com a progressão classificador gene que teve forte valor preditivo em termos de evolução das doenças em NMIBC [13]. Embora

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é um único marcador molecular dentro deste candidato classificador gene relacionado à progressão, foi suficiente para predizer o risco de progressão na NMIBC com uma taxa de risco forte de mais de 10 em análise multivariada.

no presente estudo, investigamos os níveis de

C16orf74 expressão mRNA

em tecidos NMIBC primária humanos em uma população relativamente grande com um longo prazo de seguimento, juntamente com vários fatores de risco clínicos conhecidos, incluindo a idade , tamanho do tumor, número de tumores, t-categoria, o grau do tumor, a terapia intravesical e [30] – [31]. Estes aspectos do desenho do estudo dão força para os resultados, e sugerem fortemente que

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pode ser um preditor clinicamente útil de progressão na NMIBC primário.

Em conclusão, diminuição da expressão de

C16orf74

foi significativamente associada com a progressão na NMIBC primário, eo nível de

C16orf74

expressão era um determinante prognóstico independente para a progressão do tumor.

C16orf74

pode desempenhar um papel fundamental na progressão da NMIBC. Assim,

C16orf74

nível de expressão representa um marcador útil para prever a progressão em pacientes NMIBC primários.

Materiais e Métodos

1. Ética Declaração

O Comitê de Ética da Universidade Nacional de Chungbuk aprovou este protocolo, e consentimento informado por escrito foi obtido de cada sujeito. Recolha e análise de todas as amostras foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade Nacional de Chungbuk.

2. Pacientes e Amostras de Tecido

amostras primária NMIBC de pacientes com carcinoma de células transicionais verificou-histologicamente obtidas no nosso instituto foram utilizados para o estudo atual. Os pacientes com carcinoma concomitante

in situ

(CIS) ou um período de acompanhamento de curto prazo (menos de 6 meses), e aqueles que foram submetidos a cistectomia radical ou para os quais não havia coleta de dados incompletos, foram excluídos para tornar o população de estudo mais homogênea. Um total de 193 amostras NMIBC primários foram analisados.

Todos os tumores foram macrodissected, normalmente dentro de 15 minutos de ressecção cirúrgica. Cada amostra de cancro da bexiga foi confirmada por análise patológica de uma parte da amostra de tecido em secções congeladas frescas a partir de espécimes TUR, e foi então congelada em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Um segundo TUR foi realizada 2-4 semanas após a ressecção inicial, quando uma amostra de cancro da bexiga não incluem muscular adequado ou quando de tumores de grau elevado foi detectado [32]. Os doentes que tinham um tumor T1, vários tumores, tumores grandes (≥3 cm de diâmetro), ou de alto grau Ta NMIBC recebeu um ciclo de tratamento intravesical (BCG ou mitomicina-C) [26], [32]. Se um paciente recusou terapia intravesical, não foi administrada após RTU. A resposta ao tratamento foi avaliada por cistoscopia e citologia urinária. Os pacientes que estavam livres da doença no prazo de 3 meses após o tratamento foram avaliados a cada 3 meses para os primeiros 2 anos e depois a cada 6 meses depois [26], [32]. Os tumores foram encenado e classificados de acordo com a classificação de 2002 TNM e do sistema 1973 de classificação da OMS, respectivamente [32] – [33]. Recorrência foi definida como a recorrência de NMIBC primária com um menor ou mesmo estágio patológico, e progressão foi definida como doença com um estágio TNM maior sobre a recidiva.

3. extracção de ARN e a construção de ADNc

O ARN foi isolado a partir de tecido utilizando 1 mL de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e homogeneização em um tubo de vidro de 5 mL. O homogeneizado foi transferido para um tubo de 1,5 ml e, em seguida, misturados com 200 ul de clorofórmio. Após incubação durante 5 min a 4 ° C, o homogeneizado foi centrifugado durante 13 minutos (min) a 13000 ×

g

a 4 ° C. A fase aquosa superior foi transferida para um tubo limpo e, em seguida, foram adicionados 500 mL de isopropanol. A mistura foi incubada durante 60 min a 4 ° C, e, em seguida, o tubo foi submetido a centrifugação durante 8 min a 13000 ×

g

, 4 ° C. A fase aquosa superior foi rejeitado e misturado com 500 ul de etanol a 75%, e, em seguida, centrifugada durante 5 min a 13000 ×

g

, 4 ° C. Depois da remoção da camada aquosa superior, o sedimento foi seco a temperatura ambiente, dissolvida em dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com água, e, em seguida, armazenada a -80 ° C. A qualidade e a integridade do RNA foram confirmados por electroforese em gel e coloração com brometo de etídio de agarose, seguido de inspecção visual sob luz ultravioleta. O ADNc foi preparado a partir de 1 ug de ARN total utilizando um kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

4. PCR em tempo real

em tempo real a amplificação por PCR foi realizada utilizando um instrumento Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Austrália) para quantificar a expressão de

C16orf74

. Os ensaios de PCR em tempo real foram efectuadas em tubos de micro-reacção (Corbett Research, Mortlake, Austrália) utilizando SYBR Premix EX Taq (Takara BIO INC., Otsu, Japão). Os iniciadores utilizados para a amplificação foram

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(179 pares de bases) sentido (5′-AAT GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 ‘) e anti-sense (5’-TTT CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 ‘). A reacção de PCR foi realizada num volume final de 10 ul que consiste em 5 ul de tampão 2 X SYBR pré-mistura EX Taq, 0,5 ul de cada um de 5 ‘e 3’ do iniciador (10 pmol /uL), e 1 ul da amostra ADNc. O produto foi purificado com um kit QIAquick Extraction (Qiagen, Hilden, Alemanha), quantificada com um espectrofotómetro (Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA), e então sequenciado com um sequenciador de fluorescência a laser automatizado (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI). Dez diluições em série de uma concentração conhecida do produto (a partir de 100 pg /mL a 0,1 pg /mL) foram usados ​​para estabelecer a curva padrão para a PCR em tempo real. O tempo real condições de PCR foram como se segue: 1 ciclo por 20 segundos (seg) a 96 ° C, seguido de 40 ciclos de 2 segundos a 96 ° C para desnaturação, 15 segundos a 60 ° C para emparelhamento, e 15 segundos a 72 ° C para extensão. O programa de fusão foi realizada a 72-95 ° C com uma velocidade de aquecimento de 1 ° C por 45 seg. Os dados espectrais foram capturadas e analisadas utilizando Rotor-Gene Real-Time Software Análise 6.0 Build 14 (Corbett Research, Mortlake, Austrália). Todas as amostras foram realizadas em triplicado.

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH)

foi analisada como uma expressão do gene de referência do RNA e o gene endógeno foi normalizado para a expressão de

GAPDH

.

5. A análise estatística

Para normalizar a distribuição altamente enviesada dos níveis de expressão de mRNA de

C16orf74

, os dados foram log natural transformado e depois voltar transformado para a interpretação dos resultados [34]. características de operação do receptor (ROC) foram usadas para determinar o ponto de corte do nível de ARNm que produziu a maior sensibilidade e especificidade combinada para a progressão. Usando esses valores, os pacientes foram classificados em

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grupos de expressões altas ou baixas. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar o tempo de progressão, e as diferenças foram avaliados através de estatísticas de log-rank. O valor prognóstico da

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em termos de progressão foram analisados ​​utilizando modelos de regressão de risco proporcional multivariada de Cox. A análise estatística foi realizada usando SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL), e um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

.