Sumário

células-tronco cancerosas (CSCs) são responsáveis ​​pela progressão do cancro, metástase e recorrência. Até à data, os marcadores específicos de CSCs permanecem desconhecidas. O objetivo deste estudo foi identificar novos biomarcadores de CSCs gástrico para o diagnóstico clínico utilizando a tecnologia proteômica. células CSC-SP, como células OCUM-12 /SP, células OCUM-2MD3 /SP, e seus pais OCUM-12 e células OCUM-2MD3 foram usadas neste estudo. Os lisados ​​de proteína de cada linha celular foram analisados ​​utilizando Qstar Elite cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem, acoplado com etiquetas isobáricas para a tecnologia de quantificação relativa e absoluta. proteínas candidatas detectados pela tecnologia proteômica foram validados por análise imuno-histoquímica de 300 cancros gástricos. Com base nos resultados de LC-MS /MS, oito proteínas, incluindo RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, e KRT18, foram regulados positivamente em ambos os-12 OCUM células /SP e OCUM-2MD3 /SP células quando comparadas com as suas células-mãe correspondentes. análise de RT-PCR indicaram que o nível de expressão

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, e

CK18

foi alta em OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP, em comparação com o controlo de OCUM-12 pai e OCUM-2MD3. Estas proteínas foram significativamente associados com a profundidade avançada invasão, metástase linfonodal, metástases à distância, ou estágio clínico avançado. expressão RBBP6, DCTPP1, HSPA4 e ALDOA em particular foram significativamente associados com um prognóstico pobre nos 300 pacientes com câncer gástrico. RBBP6 estava determinado a ser um fator prognóstico independente. A capacidade de estimulação de motilidade de OCUM-12 células /SP e células /SP OCUM-2MD3 foi inibida pela

RBBP6

siRNA. Esses achados podem sugerir que as oito proteínas, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA e KRT18, utilizando análise proteômica comparativa, eram percebidos como potenciais marcadores CSC de câncer gástrico. Das proteínas candidatas oito, RBBP6 foi sugerido para ser um biomarcador de prognóstico promissor e um alvo terapêutico para câncer gástrico

Citation:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et ai. (2014) Comparativo Proteomics Análise de Células Estaminais câncer gástrico. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

editor: Anita B. Hjelmeland, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2014; Aceito: 16 de setembro de 2014; Publicação: 07 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Morisaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. números de acesso para dados de proteínas estão incluídos como UniProt /Swiss-Prot na Tabela 2.

Financiamento: Este estudo é parcialmente financiado pelo KAKENHI (Grant-in-Aid para a Investigação Científica, nºs 22390262, 23390329 e 26293307. ), pelo Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento do Centro Nacional de Câncer (23-a-9), e por Priority Fund Research da Universidade de Osaka City. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro de células estaminais (CSCs) são definidos como uma subpopulação único em tumores que possuem a capacidade de iniciar o crescimento do tumor e manter a auto-renovação [1]. Tem sido proposto que eles podem causar a linhagem heterogénea de células cancerosas que constituem o tumor, bem como desempenham um papel importante na progressão maligna de carcinoma, tais como metástases distantes, recorrência, e quimiorresistência [2] – [4]. CSCs foram inicialmente identificados na leucemia mielóide aguda [5], mas foram recentemente relatada a existência de uma grande variedade de cancros, incluindo o cancro [6] gástrico. A identificação de marcadores CSC pode abrir um novo ponto de vista terapêutico com base na segmentação selectivamente essa população pequena de células [7], [8]. Recentemente, foi relatado que os CSCs possivelmente fazer exprimir os seus próprios marcadores únicos, tais como aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], e CD133 [12]. No entanto, muitos dos marcadores publicados não são exclusivos de CSCs. Quantitativa perfil de expressão de proteínas permite a identificação eficiente de valores de expressão diferenciais precisas e reprodutíveis de proteínas [13]. etiquetas isobáricas de quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) combinada com cromatografia multidimensional líquida (CL) e análise de espectrometria de massa tandem (LC-MS /MS) está a emergir como uma poderosa metodologia na busca de marcadores tumorais [14]. Nós relatado anteriormente que as células população lateral (SP) são capazes de se auto-renovar e produzir as células não-SP, e que as células cancerosas em frações SP possuem alto potencial de tumorigenicidade, metástases à distância [3], e chemoresistance [2]. Isto sugere que as células de SP do câncer gástrico possuem propriedades semelhantes a células-tronco do câncer. Portanto, o objetivo deste estudo foi detectar um romance CSC marcador (s) de câncer gástrico, comparando os proteomas entre as células-mãe e as células-tronco SP semelhantes a células que têm sido conhecidos por possuir uma população CSC rica [15].

Materiais e Métodos

culturas de células

Duas linhas celulares de cancro gástrico, OCUM-2MD3 [16] e OCUM-12 [17], foram utilizados neste estudo. Estas linhas celulares foram derivadas de cancro gástrico do tipo difuso. A condição da cultura foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Nikken, Quioto, Japão) com 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilina e estreptomicina e piruvato de sódio 0,5 mM, e incubou-se a 37 ° C. linhas celulares /SP OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 eram células SP que foram avaliados através de uma análise de citometria de fluxo utilizando a Hoechst 33342 a partir de suas linhas de células-mãe, e OCUM-2MD3 OCUM-12, respectivamente. Triagem foi realizado três vezes para estabelecer uma população estável de células enriquecida em SP. Após a três meses período de incubação pós-triagem, OCUM-12 células /SP (6,5%) e células /SP OCUM-2MD3 (12,2%) ainda representava uma percentagem elevada da fração SP, em comparação com pai OCUM-12 (3,2% ) e OCUM-2MD3 (6,3%), as células (Figura S1). Subsequentemente, estas células enriquecida-SP com uma população estável, foram as linhas celulares utilizadas para a análise, conforme relatado anteriormente [18].

espécimes de tecidos humanos e de informações do paciente

As amostras de tecido foram obtidas a partir de 300 pacientes diagnosticados com operações permitidas câncer gástrico em Osaka University City. A Tabela 1 mostra as características clínico-patológicas dos 300 pacientes com câncer gástrico. Havia 208 do sexo masculino e 92 do sexo feminino, com a idade média de 64 anos (variação, 28-85 anos) no momento da operação. Os diagnósticos foram confirmadas por pelo menos duas pessoas. O estadiamento foi determinado de acordo com a classificação japonesa de carcinoma gástrico (14

th edition) [19]. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Osaka City University Ética (Osaka, Japão). consentimento informado por escrito do doador foi obtido para o uso desta amostra em investigação.

identificação de proteínas e quantificação por Qstar Elite LC-MS /MS

As células cancerosas (60 ug cada ) foram homogeneizados e, em seguida, lisadas usando 100 ul de tampão T-PER de lise (Thermo Scientific) ou 500 ul da 9 M de ureia, 2% e tampão de lise CHAPS com um inibidor de protease. Subsequentemente, o lisado celular foi, em seguida, tratada por ultra-sons. Após precipitação com acetona, as concentrações de proteína foram medidas pelo BCA Protein Assay (Pierce, IL, EUA). Redução, alquilação, a digestão, e subsequente etiquetagem péptido de 50 ug de proteína em cada amostra foram realizadas utilizando o kit de AB Sciex iTRAQ Reagente multi-Plex (AB Sciex, Concord, ON, Canadá) [20]. As amostras marcadas foram iTRAQ-carregado num cartucho de permuta catiónica ICAT (AB Sciex). Os péptidos foram eluídos como seis fracções (1 ml de solução de KCL 10, 50, 70, 100, 200, e 350 mM), e o sobrenadante de cada uma foi evaporada dentro de uma centrífuga de vácuo. As amostras foram então dessalinizado e concentrado utilizando cartuchos Sep-Pak Luz C18 (Waters Corporation, Milford, MA), evaporadas a uma centrífuga de vácuo, ressuspenderam-se em 20 ul de 0,1% (v /v) de ácido fórmico, e subsequentemente aplicada sobre Qstar Elite LC -MS /MS. Cada amostra foi executado durante 150 minutos. Os dados de MS /MS foi pesquisada contra a base de dados Swiss Protein (humano) utilizando o software ProteinPilot (versão 2.0, AB Sciex) com tripsina definido como o enzima de digestão e methanethiosulfinate metilo como a modificação de cisteína. A fim de remover visitas redundantes e quantificação comparativo, os resultados da pesquisa obtidos foram ainda processados ​​por um software ProteinPilot utilizando o algoritmo Paragon. Isto resultou no conjunto mínimo de proteínas identificadas justificáveis. Todos os dados relatados foi usada com um limite de corte de 95% de confiança. quantificação relativa dos peptídeos foi calculada como o quociente dividindo a intensidade iTRAQ repórter. Os rácios de péptidos que suportam a existência de uma proteína se a média para a quantificação relativa de proteína. Posteriormente, foi realizada a análise de análise ProteinPilot e Ingenuity via (IPA) (Ingenuity sistema, Mountain View, CA). Após a realização de um teste t simples de um dos rácios de proteína em média calculada em relação a 1 para avaliar a validade das alterações de expressão de proteínas, um valor de p foi relatada. rácios de proteína com um valor de p inferior a 0,05 foi considerado de confiança. Deve ser conhecido que em 90% das corridas experimentais iTRAQ feito anteriormente, os desvios padrão das proporções de proteína, que resultam de variações técnicas, foram registadas como sendo inferiores a 0,3. Portanto, a expressão muda maior do que 1,2 vezes ou menos de 0,8 vezes dos níveis de expressão normalizados foram considerados como estando fora do intervalo de variabilidade técnica. Também foi realizada uma análise não-rotulados, e detectou a presença de proteínas apenas dentro OCUM-12 células /SP e células /SP OCUM-2MD3, mas não no interior das células-mãe [21]. Cada amostra foi executado duas vezes. O aplicada LC-MS /MS análise juntamente com a tecnologia iTRAQ ter sido classificado como um método quantitativo para a expressão da proteína de confiança, sendo ainda mais sensível do que o Western blot que depende do tipo de anticorpos aplicados [22].

IPA e selecção de proteínas candidatas

o banco de dados do IPA é utilizado principalmente no domínio da ontologia proprietária, contendo até 300.000 artigos biológicos, incluindo genes, proteínas moleculares e processos celulares. Portanto, o IPA foi empregue para a análise de proteínas funções molecular, localização. Além disso, obteve-se informação pormenorizada sobre as funções e localizações celulares das proteínas identificadas. Com base nos resultados de LC MS /MS e as análises do IPA, proteínas que foram observadas a ser sobre-expresso em linhas de células de SP, quando comparado com a sua frequência correspondente de expressão em linhas de células-mãe, foram seleccionados como candidatos a biomarcadores para células SP de câncer gástrico. A identificação de proteínas que interagem de redes, bem como grupos funcionais e vias foi gerado pelo IPA, e a análise depende das associações previamente caracterizados.

quantitativo em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR )

células cancerosas gástricas foram cultivadas. E o ARN celular total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Carlsbad, CA). O ADNc foi preparado a partir de 2 ug de ARN utilizando iniciadores aleatórios (Invitrogen). Para determinar as mudanças de dobragem em cada gene, RT-PCR foi realizada no ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), com ensaios de expressão de genes disponíveis comercialmente (Applied Biosystems) para

RBBP6

(

vinculativo retinoblastoma proteína 6

; Hs00544663),

HSPA4

(

proteína de choque térmico 70 kDa 4

; Hs00382884),

HSPA9

(

proteína de choque térmico de 70 kDa 9

; Hs00269818),

GLG1

(Golgi glicoproteína 1; Hs00939452),

DCTPP1

(

dCTP pirofosfatásica 1