Sumário

fatores de transcrição de stress-inducible desempenhar um papel fundamental na adaptação celular ao meio ambiente para manter a homeostase e integridade do genoma. Factor de activação de transcrição 3 (ATF3) é induzida por uma variedade de condições de stress e inflamatórias e é sobre-expresso em muitos tipos de células cancerosas. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes funções pleiotrópicas de ATF3 permaneceram indescritíveis. Aqui nós empregues sistemas de análise para identificar alvos de todo o genoma de ATF3 que seja induzida por um agente de alquilação metanossulfonato de metilo (MMS) ou sobre-expressa numa linha celular de tumor de próstata LNCaP. Mostramos que ATF3 e associada a cancro é recrutado para 5,984 e 1,423 alvos, respectivamente, no genoma humano induzida por stress, 89% dos quais são comuns. Notavelmente, os alvos ATF3 são altamente enriquecido para não somente motivos ATF /CRE mas sites também de ligação de vários outros fatores de transcrição de stress-inducible indicando uma extensa rede de factores de resposta de estresse na regulação da transcrição de genes alvo. Uma análise mais aprofundada dos efeitos de ATF3 knockdown nestes alvos revelou que ATF3 induzida pelo stress regula os genes em vias metabólicas, do ciclo celular, apoptose, adesão celular, e a sinalização de insulina, incluindo, p53, Wnt, e vias de VEGF. ATF3 associada a cancro está envolvido na regulação de conjuntos distintos de genes em processos tais como a sinalização de cálcio, Wnt, p53 e das vias de diabetes. Notavelmente, ATF3 induzida pelo estresse liga-se a 40% das metas de p53 e ativa genes pró-apoptóticos tais como TNFRSF10B /DR5 e BBC3 /PUMA. ATF3 associado a um cancro, por contraste, reprime estes genes pró-apoptóticos para além CDKN1A /p21. Tomados em conjunto, os nossos dados revelam uma extensa rede de fatores de transcrição de stress-inducible e demonstrar que ATF3 tem oposição, efeitos celular dependente do contexto em genes alvo p53 em resposta a danos do DNA e desenvolvimento de câncer

Citation:. Tanaka Y, Um Nakamura, Morioka MS, Inoue S, Tamamori-Adachi M, Yamada K, et al. (2011) Análise de Sistemas de ATF3 em resposta ao estresse e Câncer revela efeitos opostos sobre os genes pró-apoptóticos na via p53. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10.1371 /journal.pone.0026848

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Agosto, 2011; Aceito: 04 de outubro de 2011; Publicação: 26 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tanaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas para SK (18012015, 18055008 e 21590302) e uma subvenção para Y.T. (20510183) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, no Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os factores de transcrição desempenham papéis importantes na regulação temporal da expressão do gene na estimulação sérica de células humanas [1], [2]. Cellular adaptação a diversas condições de stress ambiental também é regulada por factores de transcrição que coordenadamente modular a expressão de genes envolvidos na manutenção da homeostase celular e integridade genética. Tal sistema desempenha um papel importante não só para a sobrevivência de células normais, mas também a resistência de células de cancro para metabólica e tensões genotóxicos. Um passo crucial para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes respostas ao estresse é a identificação de genes-alvo de cada fator de transcrição. Estudos em levedura empregando a expressão do gene de perfil [3], [4] e análise de sistemas mais recentemente por imunoprecipitação da cromatina de factores de transcrição [5] revelaram um redes de todo o genoma de factores de transcrição que regulam a expressão de genes que orquestram ciclo celular, a transcrição do gene, a síntese de proteínas, e a reparação de ADN em resposta a MMS. Nos mamíferos, o supressor tumoral p53 desempenha um papel central na resposta a danos no ADN por meio de controlo transcricional de várias centenas de genes [6], [7]. Importante, apenas um pequeno subconjunto de alvos de p53 são activadas sob condições específicas [8], indicando que quer a ligação de p53 a alvos [9] – [11] ou trans-activação potencial das proteínas p53 [12], [13] pode ser afectada por moléculas acessórias.

ATF3 é um membro da família do ATF /CREB de zíper de base-leucina (b-ZIP) tipo factores de transcrição [14] e é um sensor de tensão altamente versátil para uma ampla gama de condições incluindo hipóxia, hyponutrition, estresse oxidativo, estresse ER, e várias tensões genotóxicos [15], [16], bem como as reacções inflamatórias [17], [18]. ATF3 também é activada por estimulação com soro e a jusante de c-Myc [19], e é frequentemente sobre-expressa em vários tumores, incluindo os da próstata [20], da mama [21], e linfomas de Hodgkin [22]. É importante ressaltar que várias linhas de evidência indicou uma ligação estreita entre ATF3 e sinalização p53 vias. Assim, ATF3 é induzido a jusante de p53 a um dano do ADN e funciona como um efector de morte celular mediada por p53, [6], [23] – [25]. Além disso, ATF3 potencia p53 por ligação directa e inibindo a sua ubiquitilation, o que implica que ATF3 pode modular a actividade de p53 [26], [27]. Além disso, ATF3 parece conferir um feedback negativo para a via p53 por-down regulação

TP53

expressão gênica [28], recapitulando a regulação por feedback similar de genes de citocinas inflamatórias por ATF3 [17]. Corroborando tal modelo feedback negativo, um estudo recente demonstrou que ATF3 é induzida por ciclosporina, um supressor imunológico e promove o câncer de pele por-down regulação

TP53

[29]. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que ATF3 interage com a via de p53 quer como um efector a jusante de morte celular mediada por p53 e como um regulador positivo e negativo da sinalização de p53.

A alteração na interacção entre ATF3 e factores de transcrição tais como p53 em diferentes tipos de células e /ou condições ambientais podem, em conta a parte de efeitos distintos de ATF3 sobre destino celular (ou seja, pró-apoptótica ou a promover o crescimento de células não transformadas ou células malignamente transformadas, respectivamente) [21]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório também descreveu funções pleiotrópicas de ATF3 sob várias condições de estresse [18], [19], [25], [28], [30]. Aqui realizamos análise de sistemas de alvos ATF3 e identificaram milhares de locais de ligação ATF3 no genoma. Mostramos que ATF3 constitui uma rede de transcrição extensivamente sobreposição com outros factores de transcrição indutível de stress e regula o ciclo celular, morte celular, adesão, e várias vias de sinalização, incluindo p53. Notavelmente, ATF3 se liga a 40% dos alvos conhecidos de p53 e regula a morte celular por apoptose por meio de co-activação de um subconjunto de genes pró-apoptóticos salientar resposta enquanto reprimir os mesmos alvos nas células cancerosas que expressam constitutivamente ATF3. mecanismos de comutação possíveis entre funções ATF3 pró-apoptóticos pró-sobrevivência e serão discutidos.

análise

Resultados

Sistemas identifica milhares de alvos ATF3 no genoma humano

Para identificar genômico objectivos de ATF3, análise de imunoprecipitação da cromatina foi realizada utilizando a linha celular HCT116 do cólon humano cancro estimulado pela MMS e linha celular de cancro da próstata LNCaP que expressa constitutivamente ATF3. Como relatado anteriormente [24], MMS tratamento de células HCT116 induzida a expressão transiente de ATF3 atingindo um pico às 6 horas após a estimulação (fig. 1a), enquanto que o aumento dos níveis de proteínas ATF3 foram detectados após 3 horas e atingiu um nível máximo em 12 horas de estimulação (fig. 1B). Foi preparado ADN genómico a partir de células HCT116, quer tratadas com MMS durante 6 horas ou células LNCaP não tratados, imunoprecipitadas com anticorpos anti-ATF3, e hibridado com RefSeq HG18 matrizes promotor telha humanos de NimbleGen. Posteriormente, detecção de pico foi realizada por análise baseada no Modelo de matrizes de 2 cores (MA2C) o pacote [31], que revelou uma inesperada grande número de alvos ATF3 em um corte de 0,2% FDR (Fig. S1A e S1B) . Foram identificados 5,984 e 1,423 alvos de ATF3 em células HCT116-tratados MMS e células LNCaP, respectivamente, 1269 (isto é, 89%) dos quais foram cortados entre os dois modelos. (Fig. 1C). Nós não detectou alvos no cromossomo Y de HCT116 consistente com a sua origem feminina. Foram também identificadas com sucesso treze alvos ATF3 que tinham sido previamente mostradas para ser regulada por ATF3 em vários tipos de células.

(a) a análise de RT-PCR de ATF3 em células HCT116 tratados com 50 ng /ml de MMS. (B) Análise de transferência de Western de proteínas em células HCT116 ATF3-tratados MMS. (C) metas comuns e únicas de ATF3 em células HCT116 e células LNCaP.

Motivos de fatores de transcrição associado ao estresse estão sobre-representados nas metas ATF3

ATF3 poderiam ser recrutados para seus alvos, quer directamente por ligação de uma sequência de reconhecimento de consenso TGACGTCA ou, alternativamente, através da interacção com outros factores de transcrição, incluindo um grande número de proteínas b-ZIP [14], [32]. Para avaliar se o ATF /motivo CRE ou quaisquer outros motivos do factor de transcrição são enriquecidos Entre os alvos potenciais ATF3, o número de promotores nos alvos ATF3 contendo, pelo menos, uma batida de um determinado motivo na base de dados TRANSFAC foi analisada pela P-Combinar algoritmo (Fig. S2). A Tabela 1 resume o enriquecimento de um determinado motivo tal como representado pelo número de promotores em alvos ATF3 contendo o motivo subtraída ao número de promotores de gene de um conjunto de fundo contendo o mesmo motivo. Como esperado, /sítios de ligação CRE ATF foram os motivos mais enriquecidos em alvos ATF3 (

p

-valor para alvos específicos de HCT116: 3,76 × 10

-40 a 4,34 × 10

-22,

p

-valor para alvos comuns de HCT116 e células LNCaP: de 0 a 4,20 × 10

-6). Além disso, a distância física entre as sequências de ATF /CRE preditos da verificação motivo e ATF3 picos da análise chip foi dentro de um intervalo de algumas centenas de pares de bases (isto é, perto da resolução da análise ChIP) para a maioria dos objectivos ATF3 (Fig . 2). Em contraste, não houve tal associação entre o BRCA1 não relacionado e motivos GATA1 e picos ATF3 (Fig. 2). Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que a maioria dos picos da análise ATF3 chip pode ser explicada por ligação directa de ATF3 motivos de ATF /CRE.

Distribuição de distância física entre o ATF /CRE, BRCA1, e GATA1 motivos em alvos ATF3 de picos ATF3 identificadas por análise de chip. picos ATF3 em grande parte coincidentes com ATF motivos /CRE, mas não mostram nenhuma associação com BRCA1 e GATA1 motivos não relacionados.

Curiosamente, a verificação motivo também revelou que os locais de ligação de outros fatores de transcrição de stress-inducible foram altamente sobre-representados nas metas ATF3 em resposta a danos no DNA (Tabela 1). Estes principais reguladores incluídos de estresse ER (DDIT3, NF-E1), hipoxia (HIF-1a), o estresse UV (USF2, RFX1), o estresse oxidativo (c-ETS), e danos no DNA (NF-Y, E2F, EGR- 1, FOXJ2, SP1). É de notar, os membros da família b-zip (AP-1, DDIT3, e USF2) têm um potencial para heterodimerizar com ATF3 [33] e SP1 tem sido relatado para interagir fisicamente com ATF3 [34]. Por isso, é possível que ATF3 é recrutado para um subconjunto de suas metas indiretamente através da associação com outros fatores de transcrição de stress-inducible.

ATF3 regula processos biológicos distintos na resposta ao estresse e no cancro

Tendo estabelecido potenciais alvos de ATF3 no genoma, seguinte, teve como objetivo identificar os genes cuja expressão é regulada pela ATF3. Para este fim, avaliamos o impacto da ATF3 knockdown por siRNA (Fig. 3A) sobre padrões de expressão gênica em 0, 6, 12, e 24 horas após a estimulação por MMS usando Agilent Whole Human Genome Microarray. Após a normalização de arrays usando um grupo de casa mantendo genes (Fig. S3A), dois terços dos genes (ou seja, 28,872 sondas fora de 43.925) foram encontrados para ser expressa acima dos níveis de fundo em células HCT116 (Fig. S3B). Em contraste, 90% dos alvos ATF3 foram expressos acima dos níveis de fundo, o que sugere que ATF3 preferencialmente associa com genes transcritos activamente. A nível global, a comparação de sinais (log

2 ratio) entre as células knockdown controle e revelou um impacto limitado de ATF3 infra-regulação no transcriptoma (Fig. S3B e S3C).

(A) HCT116 As células foram transfectadas com ARNsi para ATF3 (siATF3) ou mexidos siRNA (siControl) e tratou-se com MMS para 0, 3, e 6 horas. Quantidade de proteínas ATF3 foi analisado por Western blot com β-actina como um controlo de carga. MMS induz ATF3 aos 3 e 6 horas após a estimulação, o que é significativamente bloqueadas por siATF3. representação (B) Calor mapa dos níveis de expressão de genes em 0, 6, 12, e 24 horas após a estimulação MMS para alvos conhecidos de ATF3 (painel superior) ou fatores de transcrição que motivos de ligação estão sobre-representados nas metas ATF3 (painel inferior). Sinais são normalizados contra aqueles no momento 0 de siControl e níveis relativos ou relação entre siATF3 /siControl são codificados por cores de 2

-2,5 a 2

2.5.

Uma análise mais aprofundada do chip -identified alvos de ATF3 indicaram que a expressão de genes de 6-30% foram afectados por ATF3 knockdown abaixo de 0,8 vezes ou superior a 1,2 vezes a diferentes pontos de tempo após a estimulação MMS. Para identificar os processos biológicos regulados por ATF3, mapeamento via foi realizada utilizando DAVID [35] para um subconjunto de metas ATF3 quer jusante ou up-regulada por ATF3 knockdown (modificado teste exato de Fisher

p

-valor 0,1). Conforme resumido na Tabela 2, ATF3 induzida pelo stress associada com vários processos celulares, tais como as vias metabólicas (açúcares, aminoácidos, lípidos), processos anabólicos e catabólicos (esteróide e biossíntese de folato, ubiquitilation, do ciclo da ureia), a geração de energia (ciclo de TCA , fosforilação oxidativa), ciclo celular, apoptose, adesão, citoesqueleto, e vias de sinalização (ErbB, p53, insulina, Wnt, VEGF).

em seguida, para identificar potenciais alvos de ATF3 no cancro-associado ATF3, realizamos knockdown ATF3 e perfil de expressão utilizando células LNCaP (Fig. S4). análise de mapeamento via de subconjuntos de genes seja regulada para baixo ( 0,8 vezes) ou sobre-regulada ( 1,2 vezes) por knockdown de ATF3 está resumida na Tabela 3. constitutivamente expresso ATF3 em células LNCaP parecia estar envolvida em biológica processos bastante diferentes daquelas em respostas ao estresse, incluindo a adesão celular, diabetes mellitus, e sinalização (ErbB, p53, Wnt, cálcio) com pouca associação com processos metabólicos. Tomados em conjunto, estes dados indicam que as vias metabólicas, do ciclo celular, apoptose, e a sinalização de insulina e de VEGF são os alvos exclusivos da ATF3 induzida pelo stress, enquanto que a diabetes mellitus e a sinalização de cálcio, mas não do ciclo celular e apoptose, são alvos exclusivos de ATF3 expressa em células cancerosas. A eventual ligação entre ATF3 e via de diabetes como encontrado em nosso estudo é consistente com um estudo recente mostrando que ATF3 ativados nas células adiposas obesos contribuir para a resistência à insulina através de infra-regulação da adiponectina e um transportador de glicose GLUT4 [36].

DNA ATF3 induzida por danos ativa um subconjunto de genes pró-apoptóticos da via p53

Identificação da via p53 como um alvo potencial de ATF3 nos levou a analisar melhor regulação dos genes-alvo p53 por ATF3 . Primeiro analisamos o número de alvos p53 previamente conhecidas [6] também são alvos de ATF3 em nosso ensaio ChIP. Descobrimos que ATF3 induzida por estresse foi recrutado para um máximo de 40% (isto é, 97/244) de alvos p53, o que implica para a primeira vez que uma grande fração dos alvos p53 pode ser transcricionalmente co-regulados por ATF3. Em seguida, avaliamos o impacto da ATF3 knockdown na expressão das metas comuns de ATF3 e p53 em vários momentos após a estimulação das células HCT116 por MMS. Como ilustrado por mapa de calor na Fig. 4A (proporção de sinais em siControl e siATF3), a maioria deles são ligeiramente para baixo-regulado por knockdown ATF3 incluindo genes pró-apoptóticos tais como BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 e TNFRSF10B /DR5.

(A) representação mapa de calor dos níveis de expressão de genes a 0, 6, 12 e 24 horas após a estimulação MMS para alvos comuns de ATF3 e p53. Sinais são normalizados contra aqueles no momento 0 de siControl e níveis relativos ou a razão entre siATF3 /siControl são codificados por cores de 2

-2,5 a 2

2.5. Os genes são agrupados de acordo com os padrões de expressão após a estimulação MMS: um, fortemente ativadas; b, fortemente reprimida, c, fracamente ativado; d, mista; e, fracamente reprimido. A maioria dos genes são fracamente regulada pelo knockdown ATF3, enquanto DNMT1 é uma exceção que é up-regulada por knockdown ATF3. (B) Análise de RT-PCR quantitativo de ATF3 e alvos pró-apoptóticos de p53. Os níveis de expressão em células siATF3-transfectadas (barras hash) são indicados em relação aos do controlo (barras abertas). micrografia de contraste (C) Fase de células HCT116 após o tratamento com 50 MMS ng /ml para 12 horas na presença de siControl ou siATF3. (D) Número de células HCT116 vivo após o tratamento com 50 MMS ng /mL para 0, 8, 12, e 24 horas, na presença de siControl (círculos abertos) ou siATF3 (círculos fechados). (E) Activação de caspase 3, tal como medido pelos seus produtos clivados. células HCT116 foram transfectadas com siControl ou siATF3 e tratada com 50 MMS ng /ml para 0, 3, 6 e 12 horas. Os extractos celulares totais foram submetidas a análise de mancha de Western utilizando anticorpos contra ATF3, β-actina, a caspase 3, caspase e 3. A seta indica a caspase 3 clivada do peso molecular previsto.

Para avaliar ainda mais a função do ATF3 na expressão do gene alvo p53, foi realizada análise de RT-PCR quantitativo de genes pró-apoptóticos em células MMS estimulados pré-transfectadas com ARNsi de controlo ou siATF3. Como mostrado na Fig. 4B, ATF3 knockdown provocaram uma diminuição significativa indução de TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5, BBC3 e /PUMA por tratamento MMS. Em seguida analisou-se efeitos de ATF3 ectopicamente expressa em genes alvo p53 utilizando os repórteres de luciferase ancorando promotores proximal com um motivo de ATF /CRE tal como representado na Fig. 5A. A co-transfecção de células HCT116 com os repórteres de luciferase e vectores de expressão ATF3 resultou na activação significativa de TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, e DDIT4 (Fig. 5B), consistente com os dados de microarray mostrando que knockdown ATF3 causada expressão atenuada destes genes (Fig. 4A). Em contraste, o gene de vimentina, que foi reprimida por tratamento MMS (Fig. 4A), não foi significativamente activado por expressão ectópica de ATF3 (Fig. 5B).

(A) A construção repórter da luciferase contendo-DR5 um fragmento do promotor de DR5 -1226 (sítio PstI) a 1 (codão AUG), que foi subclonado em PicaGene VGP-B2. motivos ATF /CRE (ATF) e motivo p53 (p53) são indicados. (B) luciferase ensaios de repórter duplo para TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4 e VIM. As células HCT116 foram transfectadas com cada repórter e estimuladas com 50 ng /ml de MMS de 12 horas. Firefly actividade de luciferase foi normalizada pela actividade de luciferase CMV-Renilla. (C) ensaio de luciferase duplo usando tipo selvagem ou ATF3

– /-. Fibroblastos de rato embrionárias (MEF)

Para elucidar a função de ATF3

in vivo

, aproveitamos de ratos ATF3 deficiente estabeleceu recentemente em nosso laboratório ([37]). Fibroblastos de rato embrionárias foram transfectadas com os repórteres DR5-luciferase e estimuladas com MMS. Curiosamente, a perda de ATF3 provocaram uma diminuição significativa dos níveis de actividade de promotor basal de DR5 como se mostra na fig. 5C, sugerindo que a expressão basal de DR5 foi dependente ATF3. Além disso, a activação induzida por DR5 MMS de promotor foi reduzido aproximadamente para metade, no ATF3

– /- células em comparação com células de tipo selvagem, o que implica que a activação induzida por danos no ADN de DR5 foi parcialmente dependente ATF3. Tomados em conjunto, estes deficitária e ganhar de função estudos demonstram que ATF3 ativa selecionar alvos de p53.

DNA ATF3 induzida por danos sensibiliza células à morte celular

Para avaliar a importância biológica da cruz -Fale entre ATF3 e p53, que próxima analisaram o efeito do knockdown ATF3 sobre a viabilidade celular, após estimulação por MMS. Como representado na Fig. 4C e 4D, havia um número maior de células transfectadas com HCT116 siATF3 do que as transfectadas com ARNsi de controlo após o tratamento MMS. Essa diferença no número de células podem reflectir quer o aumento do crescimento celular ou diminuição da morte celular. Para abordar esta questão, analisamos ativação de caspase 3, uma característica da morte celular por apoptose, por Western blot. Como representado na Fig. 4E, de knockdown ATF3 causou redução na activação da caspase 3, tal como avaliado pela produção de caspase clivada 3. Estes dados são consistentes com a activação mediada por ATF3 de genes pró-apoptóticos (Fig. 4B, a Fig. 5) e sugerem fortemente que o DNA ATF3 induzida por danos contribui para a morte celular induzida por stress através de co-activação de um subconjunto de genes alvo p53.

ATF3 associada a cancro promove a proliferação de células e inibe a apoptose

Curiosamente, knockdown de ATF3 em células LNCaP causou aumento da p21 (Fig. 6A) concomitante com a redução do crescimento das células (Fig. 6B). Estes achados são consistentes com relatórios anteriores sugerindo um papel de ATF3 na proliferação celular no cancro [20], [22], [38] e o crescimento celular induzida por c-Myc [19]. Além disso, a análise de corrente das vias reguladas por ATF3 em células LNCaP (Tabela 3B) indicou que mais de 13 genes na via de p53 pode ser activado por ATF3. Para avaliar o efeito de ATF3 na morte celular mediada por p53, realizou-se análise de RT-PCR quantitativa de genes pró-apoptóticos em via p53. Como ilustrado na Fig. 6C, ATF3 knockdown causou aumento da regulação da FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /PUMA, e CASP10 bem como CDKN1A /p21, o que sugere que ATF3 regula negativamente a morte celular induzida por p53 e aumenta a proliferação celular através da inibição de expressão de p21.

(a) análise de transferência de Western de ATF3 e p21 em células LNCaP transfectadas com siControl ou siATF3 com β-actina como um controlo de carga. (B) Número de células viáveis, a 0, 3, e 5 dias após a transfecção com siControl (círculos abertos) ou siATF3 (círculos fechados). (C) RT-PCR quantitativo de análise de genes pró-apoptóticos em via p53 e p21 após a transfecção. Níveis de expressão em siATF3 (barras hash) em relação aos de siControl (barras abertas) são indicados.

Discussão

Nós mostramos que o DNA ATF3 induzida por danos liga-se a quase um terço os promotores de RefSeq humanos. A identificação de um número tão grande de alvos não é excepcional, desde E2F1 e MYC são conhecidas por serem recrutados para 20000 e 17.000 alvos, respectivamente, no genoma humano [39], e INO4 levedura tem sido relatado para se ligar a 1.078 alvos após estimulação MMS [5]. O número de alvos de ATF3 associada a cancro era menor do que a do ADN ATF3 induzida por dano, reflectindo talvez ambos os níveis mais elevados e uma maior dobra-indução de ATF3 em resposta MMS do que os obtidos por knockdown de ATF3 em células LNCaP (dados não mostrados) . No entanto, o ensaio foi notavelmente consistente desde 89% de alvos em células LNCaP também foram encontrados em células HCT116-tratados MMS, e Onze dos 41 alvos ATF3 anteriormente conhecidas, incluindo EGR1 [40] e HIF-2A [30] pode ser identificado. Um levantamento de dados ATF3 ChIP-seq do banco de dados ENCODE (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) também indica que proporções significativas de alvos ATF3, ou seja, 37,6% (768/2041 ) em células K562 (leucemia), 71,9% (742/1032) em HepG2 (fígado), e 76,2% (809/1062) em H1-células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias), são compartilhados com 2711 alvos em GM12878 (linfoblastóides), que podem ser considerados figuras conservadoras dadas variações de qualidade dos dados ChIP-seq (que afeta a sensibilidade de detecção de pico) ea diferença de tipos de tecidos.

em particular, as ligações locais de vários outros fatores de transcrição induzida por danos no DNA (NF- Y, E2F, YY1 /NF-E1, FOXJ2, SP1), a irradiação UV (USF2, RFX1) e estresse oxidativo (c-Ets) foram significativamente sobre-representados nas metas ATF3 (Tabela 1), indicando uma extensa rede de estes fatores de resposta ao estresse (Fig. S6). Uma possível explicação para tal coincidência de factores de transcrição relacionados com o stress é que ATF3 pode sinergizar com estes factores de transcrição para modular a expressão do gene alvo. Alternativamente, os alvos ATF3 identificadas por análise ChIP podem incluir ligação indireta de ATF3 através da interação com outros fatores de transcrição induzida pelo estresse. Com efeito, ATF3 é um membro de uma grande família de factores de transcrição bZIP tipo, incluindo os identificados no presente estudo (ou seja, AP-1, DDIT3, e USF2), que formam hetero-dímeros homo- e com diferentes afinidades para variantes do consenso ATF /CRE motivo [32]. Além disso, Sp1 encontrada na análise actual é conhecido por interage fisicamente com ATF3 [33], [34]. serão necessários mais estudos para determinar o papel dos factores de transcrição de stress-induzível, especialmente aqueles que não tem sido conhecido por interagir com ATF3 antes, em ligação de ATF3 para alvejar genes

.

O presente estudo indica que o impacto de ATF3 em cada expressão do gene alvo não é tudo-ou-nada efeitos. Pelo contrário, os efeitos de ATF3 em muitas mas seleccione genes, tais como aqueles envolvidos no ciclo celular e a morte celular, em conjunto elevou-se a resultados biologicamente significativa como a morte celular por ATF3 em resposta ao stress (Fig. 4C-E) ou o crescimento celular para associada a cancro ATF3 (Fig. 6B). Além disso, nosso estudo knockdown mostra que apenas 6-30% dos potenciais alvos de ATF3 foram diretamente regulada por ATF3 de acordo com relatórios anteriores que mostram que apenas 25% das metas p53 [6], 26% dos alvos STAT1 [41], e 11% das metas do fator de transcrição de levedura são afetados por silenciamento de genes [5]. Vários mecanismos têm sido propostos para o p53 para explicar por que apenas um subconjunto de alvos potenciais para responder manipulações de p53, incluindo estados epigenética de genes alvo, promotor de ocupação com polimerases de ARN e recrutamento de co-factores essenciais [42]. Mecanismos semelhantes podem ser responsáveis ​​por efeitos de genes selectivos de ATF3. Alternativamente, múltiplas formas de complexos ATF3, como hetero-dímeros com diferentes proteínas Bzip, pode subjazem efeitos diferenciais de ATF3 sobre genes alvo.

Nos últimos anos, um número crescente de estudos têm indicado que ATF3 tem funções pleiotrópicas dependendo do contexto celular. Importante, o nosso estudo revelou que ATF3 induzida pelo estresse e ATF3 associada ao cancro têm efeitos opostos sobre p53 e Wnt vias: via p53 é ativado em resposta ao estresse (Fig. S5) consistentes com a função do ATF3 na morte celular mediada por p53 [6 ], [23] – [25], ao passo que via Wnt é ativada no câncer como previamente relatado em um estudo em ratos transgénicos ATF3 desenvolver tumores mamários [43]. Pode-se argumentar que a diferença de origens genéticas e /ou tipos de tecidos entre as células HCT116 e células LNCaP poderia ter influenciado a função de ATF3. Com efeito, ATF3 parece desempenhar papéis distintos em diferentes tecidos: ATF3 actua como um supressor tumoral no cancro colorrectal [24], [44], enquanto que é oncogénica no cancro da próstata [20], cancro da mama [21], o cancro da pele [29] , e linfoma de Hodgkin [22]. Nossas descobertas em células HCT116 (cólon) e células LNCaP (próstata) são consistentes com essa hipótese.

Alterações da função reguladora do ATF3 é destacado por nossa conclusão de que ATF3 é necessária tanto para a ativação e repressão do pro genes -apoptotic como BBC3 /PUMA e TNFRSF10B /DR5 em resposta ao estresse e câncer. De nota, os efeitos opostos de ATF3 sobre a expressão da ciclina D1 foram documentados anteriormente: ATF3 se liga a AP-1 motif e ativa ciclina D1 em células de rato hepatoma estimulado por mitogénio [45], ao passo que se liga a ATF site /CRE e reprime ciclina D1 em fibroblastos de rato estimuladas por soro [46]. Na literatura, existem amplas precedentes de fatores de transcrição que têm funções opostas dependentes do contexto no desenvolvimento do cancro ([47] e referência nele). KLF4, por exemplo, p21 activa e reprime p53 ambos os quais são suprimidos por Ras activado resultante em paragem do crescimento na ausência de Ras ou transformando fenótipo na presença de Ras. Alternativamente, um estudo recente demonstrou que a Kruppel-like factor de 5 (KLF5) é necessária para a transcrição MYC na proliferação de células epiteliais, mas é essencial para a repressão mediada por TGFb de MYC [48]. ligação do elemento de KLF5 inibidora TGFp na presença ou na ausência de TGF-p Diferencial foi proposta como um mecanismo dos efeitos opostos. serão necessários mais estudos para determinar se as combinações de ATF3 e outros fatores de transcrição pode mudar a função de ATF3 em alvos específicos.

A resistência das células tumorais a várias condições de estresse permanece uma questão importante. No entanto, o nosso conhecimento sobre o papel dos mecanismos de resposta ao estresse celular em resistência ao câncer à hipoxia [49] ou agentes quimioterapêuticos [50] é ainda limitada. A nossa descoberta de que ATF3 tem efeitos opostos sobre os genes pró-apoptóticos sugere que os cuidados devem ser tomados para aumentar ou bloquear a função de ATF3 em uma nova abordagem para a terapia do cancro. Ainda mais a compreensão do mecanismo de comutação da função ATF3 como um activador da transcrição ou repressor pode ajudar a desenvolver estratégias para manipular selectivamente um subconjunto de genes alvo ATF3 para auxiliar o tratamento de quimioterapia de cancros resistentes.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todo o trabalho animal foi aprovado e conduzido de acordo com as orientações das Comissões de Experimentação animal e Experiências de DNA recombinante de Tokyo Medical and Dental University (Licença nº 2010-205).

Os plasmídeos

repórteres de luciferase para DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], e vimentina [54] estavam presentes amáveis ​​do Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural University, Japão), Dr. Kazuhiro Daino (Instituto Nacional de Ciências radiológicas, Japão), Dr. Jian Yu (The Johns Hopkins Oncology Center, EUA), e Dr. Susan Rittling (The Forsyth Institute, EUA), respectivamente. O repórter luciferase DR5 foi reconstruído por subclonagem de um fragmento do promotor DR de PstI (-1226) para o códon de agosto no vetor PicaGene PGV-B2 (Toyo B-Net Co., Ltd, Japão). O vector de expressão pCI-ATF3 foi descrito anteriormente [55].

cultura celular

células de carcinoma colorrectal humano HCT116 e células do carcinoma da próstata LNCaP foram obtidas de American Type Culture Collection (EUA). Quarenta e oito horas antes da estimulação pelo MMS, meio de cultura de células HCT-116 foram substituídos com meio contendo 0,25% de FCS. Vinte e quatro horas mais tarde, as células HCT116 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou por siATF3 utilizando X-tremeGENE siARN Transfection Reagent. ON-TARGETplus siRNA piscina SMART de Dharmacon foi usado para knockdown de ATF3.