Sumário

biogênese centro de ferro-enxofre é executado por sistemas de montagem de proteínas distintas. Os mamíferos têm dois sistemas, o sistema mitocondrial Fe-S montagem cluster (ISC) e o sistema de montagem citosólica (CIA), que estão ligados por um mecanismo desconhecido. Os membros humanos da família de proteínas NEET 2Fe-2S, nutrientes privação autofagia factor-1 (NAF-1) e mitoNEET (MNT), estão localizados na interface entre a mitocôndria e o citosol. Estas proteínas têm sido implicadas na proliferação de células cancerosas, e pode transferir os seus agrupamentos 2Fe-2S a uma proteína apo-aceitador padrão. Aqui nós relatamos o primeiro 2Fe-2S receptor de cluster fisiológica para ambas as proteínas NEET como Anamorsin humana (também conhecida como inibidor-1 citocina induzida apoptose; CIAPIN-1). Anamorsin é uma proteína de transferência de electrões contendo dois locais de ligação ao centro de ferro-enxofre, que é necessário para a montagem citosólica centros Fe-S. Mostramos, utilizando espectroscopia de UV-Vis, que tanto NAF-1 e MNT pode transferir os seus agrupamentos 2Fe-2S a Apo-Anamorsin com constantes de velocidade de segunda ordem semelhantes às de outras proteínas de transferência 2Fe-2S humanos conhecidos. Uma interacção proteína-proteína directa das proteínas NEET com apo-Anamorsin foi detectada utilizando biolayer interferometria. Além disso, a espectrometria de massa de electrospray de holo-Anamorsin preparado por transferência de cluster mostra que ele recebe tanto dos seus clusters 2Fe-2S dos NEETs. Propomos que MNT e NAF-1 pode fornecer rotas paralelas que ligam o sistema ISC mitocondrial e da CIA. 2Fe-2S grupos montados nas mitocôndrias são recebidos por proteínas NEET e quando necessário transferido para Anamorsin, ativando a CIA

Citation:. Lipper CH, Paddock ML, Onuchic JN, Mittler R, Nechushtai R, Jennings PA ( 2015) câncer relacionado ao NEET proteínas de transferência 2Fe-2S Clusters para Anamorsin, uma proteína necessária para citosólico ferro-enxofre Cluster Biogenesis. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10.1371 /journal.pone.0139699

editor: Yaakov Koby Levy, Weizmann Institute of Science, ISRAEL

Recebido: 14 de maio de 2015; Aceito: 15 de setembro de 2015; Publicação: 08 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lipper et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi financiado pelo NIH GM101467 atribuído a PAJ, a Israel Science Foundation – ISF 865/13 concedido ao RN, e os fundos da University of North Texas. Academia de Artes e Ciências concedido a RM. Trabalho no Centro de Física Biológica Teórica foi patrocinada pela National Science Foundation (Grants PHY-1427654 e MCB-1214457) e pela Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução clusters de

ferro-enxofre (Fe-S) são cofatores antigos encontrados nas proteínas de todos os reinos da vida. As proteínas contendo grupos enxofre de ferro executar numerosas funções críticas, incluindo a transferência de electrões no metabolismo oxidativo, fotossíntese, metabolismo de nucleótidos, síntese de co-factores de proteínas, e são essenciais para a replicação do ADN e de reparação do ADN [1, 2]. Biossíntese de aglomerados de Fe-S ocorre por sistemas de montagem de proteínas complexas que incluem proteínas de andaime, acompanhantes, proteínas de transferência de electrões e de cisteína desulfurases [3]. Em mamíferos, existem dois conjuntos distintos de Fe-S máquinas de montagem de cluster: o sistema de montagem de centro de ferro-enxofre mitocondrial (ISC) e do sistema da montagem centro de ferro-enxofre citosólica (CIA). A CIA fornece clusters de Fe-S para citosólicas e nucleares proteínas, incluindo aqueles envolvidos na replicação e reparação do ADN [4]. O sistema ISC mitocondrial tem sido relatada como sendo necessária para a activação do sistema citosólica [5, 6]. No entanto, a natureza exacta da ligação entre os dois sistemas continua a ser desconhecido. Existem várias doenças humanas associadas a defeitos de Fe-S biogênese, incluindo Ataxia de Friedreich, anemia sideroblástica, síndrome de disfunção mitocondrial múltipla e câncer [3, 7].

As proteínas NEET humanos são um recém-descoberto nova classe de proteínas 2Fe-2S. Eles são as únicas proteínas ferro-enxofre conhecido, localizados em ou perto da membrana mitocondrial externa, que são, na interface entre a mitocôndria e citosol. A melhor caracterizada destes são mitoNEET (MNT, CISD1) e factor-1 em nutrientes privação de autofagia (NAF-1, miner1, Eris, CISD2) (revisto em [8]). mnt localiza-se na membrana exterior mitocondrial-(OMM) e NAF-1 no retículo endoplasmático (ER) e a associada à membrana mitocondrial (MAM) do ER [9-11]. NAF-1 no MAM está intimamente ligado à OMM, através do seu complexo com IP

3R, que está diretamente amarrado ao VDAC proteína OMM poros por Grp75 [9, 12]. Estas proteínas NEET estão envolvidos em várias doenças humanas, incluindo câncer, diabetes, fibrose cística, síndrome de Wolfram 2, neurodegeneração e atrofia muscular [8, 13-18]. estruturas cristalinas mostram que tanto MNT e NAF-1 são homodímeros com cada protomer coordenar um cluster 2Fe-2S com um 3Cys incomuns: coordenação 1His [19, 20]. A coordenação invulgar conjunto de Fe-S por três ligandos Cys e um ligando não-Cis foi encontrado em proteínas de transferência de centros Fe-S [21]. Nós demonstramos a capacidade de proteínas NEET para transferir seus clusters 2Fe-2S e apo-ferredoxina, a proteína padrão-ouro utilizado para experiências de transferência de cluster Fe-S [22, 23].

A localização subcelular da NEET proteínas na interface do citosol e as mitocôndrias, bem como a sua função de transferência de cluster, levou-nos a investigar se conectar o sistema de ISC mitocondrial para o sistema de CIA. A proteína citosólica 2Fe-2S Anamorsin (também conhecido como inibidor-1 de citocina induzida apoptose; CIAPIN-1) é uma proteína de transferência de electrões que é necessário para um passo inicial de montagem do cluster Fe-S pelo sistema de CIA [24-26]. Neste estudo identificamos Anamorsin como receptor de cluster primeiro conhecido directo fisiológico 2Fe-2S tanto para MNT e NAF-1. Similar aos nossos achados anteriores com ferredoxina, a transferência só ocorre quando o cluster está nas oxidados [2Fe-2S]

2 + Estado e é inibida pela mutação do seu ligando para Cys. A taxa de transferência de cluster para Anamorsin de MNT ou NAF-1 é comparável com as de outras proteínas de transferência de cluster 2Fe-2S humanos conhecidos. Mostramos, usando biolayer interferometria, que ambos os NEETs formar uma interação direta proteína-proteína com Anamorsin. Além disso, relatamos que as proteínas NEET transferir diretamente aglomerados 2Fe-2S para ambos os sítios de ligação de cluster Anamorsin que permitam a reconstituição completa do holo-Anamorsin. Porque holo-Anamorsin é necessária para a biossíntese de grupos Fe-S pelo sistema CIA, 2Fe-2S transferência cluster para Apo-Anamorsin sugere que as proteínas NEET têm um papel essencial na regulação /activação do conjunto de agrupamento pelo sistema de CIA.

Procedimentos experimentais

Expressão e purificação de proteínas

Os domínios solúveis de NAF-1 (resíduos 57-135) e mNT (resíduos 33-108) foram expressas e purificadas como descrito anteriormente [19, 23]. As proteínas purificadas NEET contêm ≥ 98% de ocupação cluster. O ADNc que codifica Anamorsin plasmídeo humano (Abgent) foi amplificado por PCR e subclonado em um-a pET28 (+) vector (Novagen) entre os locais de restrição Ndel e Xhol. O vector adiciona um 6x His-tag e um local de clivagem da trombina para o N-terminal do gene. BL-21 Codon Mais de células (DE3) RIL (Stratagene) foram transformadas com o pET28-A (+) – Anamorsin construir. As culturas foram cultivadas em meio LB contendo como descrito anteriormente [27]. 750 uM de FeCl

3 foi adicionado à cultura 30 minutos antes da indução com IPTG. As células foram sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em 20 mM de Tris-HCl a pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazole 5 mM. As células ressuspensas foram lisadas usando um homogeneizador EmulsiFlex-C5 (Avestin) e centrifugou-se. O sobrenadante contendo marcada com His Anamorsin foi ligado a agarose Ni-NTA (Qiagen) de resina, lavou-se com o tampão de ressuspensão e eluída com o mesmo tampão com imidazole 300 mM. Anamorsin eluído foi diluído em 25 mM de Tris-HCl a pH 7,1 contendo DTT 5 mM e adicionalmente purificado utilizando uma coluna de 5 mL de permuta aniónica HiTrap Q HP (GE Healthcare). A proteína foi eluída por um gradiente de NaCl de 150-500 mM em 25 mM Tris-HCl pH 7,1 e 5 mM DTT. Para Apo-Anamorsin, o cluster 2Fe-2S foi removido pelo método descrito por Kennedy e Beinert [28]. Os mutantes de sítio único aglomerado de Anamorsin (C1 e C2) foram concebidos, substituindo cada um dos ligandos de fragmentação 4Cys com Sor por mutagénese dirigida ao local.

cinética de transferência de espectroscopia de absorção de UV-VIS

Absorção os espectros foram registados 300-800 nm num espectrofotómetro Cary 50 (Varian) com uma unidade de controlo de temperatura para 37 ° C, utilizando um comprimento de trajectória cuvete de 1 cm. Os espectros foram obtidos em condições aeróbicas, a menos que indicado de outra forma. A proporção de absorvância a 423 nm (característica do cluster 2Fe-2S (s) de Anamorsin) a 458 nm (NEET 2Fe-2S cluster de assinatura do pico) foi monitorizada como uma progressão de transferência de cluster. A extensão da reacção de transferência de agrupamento é determinada e representada graficamente descrito anteriormente [23] usando a equação: Transferência de andamento (%) = (R

obs-R

inicial) /(R

Final-R

inicial) x100%, onde R

inicial é a razão de absorvâncias 423/458 nm no tempo 0, R

obs é o rácio 423/458 nm num determinado momento, e R

final é o IS a proporção 423/458 nm para a transferência completa. R

inicial para a transferência de NAF-1 e MNT é 0,78. R

valores iniciais para a transferência de NAF-1 mutante H114C e MNT H87C mutante são 0,93 e 0,90, respectivamente. A razão de absorvâncias 423/458 nm de holo-Anamorsin purificado, C1 e C2 mutante mutante (1,04, 1,03, 0,99, respectivamente) foram utilizados como os valores para a transferência completa (r

sub finais). Para as reacções de transferência, Apo-Anamorsin foi pré-incubada com DTT 2,5 mM, durante 60 minutos, para assegurar a redução dos seus grupos de cisteína tiol. As medidas cinéticas foram realizadas utilizando-se concentrações equimolares de NAF-1 ou MNT para Apo-Anamorsin (um NEET com dois aglomerado 2Fe-2S por Anamorsin) em 50 mM de Bis-Tris pH 7,0, NaCl 100 mM, DTT 2,5 mM, a menos que indicado de outra forma indicado. O Apo-Anamorsin e DTT foram pré-incubados durante 60 min antes da adição da proteína NEET.

Biolayer interferometria

cinética da interacção Apo-Anamorsin com NAF-1 ou MNT foi medida numa octeto instrumento Red96 (ForteBio). Apo-Anamorsin foi biotinilada por incubação durante 30 minutos com EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina (Thermo Scientific) a uma proporção de 2: 1 molar de reagente de biotinilação para proteína, em seguida, o tampão foi trocado utilizando uma coluna PD10 dessalinização (GE Healthcare) em mM de bis-tris 50, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20, 0,5 mg /ml de BSA, 5 mM de DTT, pH 7,0. 3,5 uM biotinilado foi imobilizado Anamorsin para biossensores estreptavidina (ForteBio). Os biossensores carregadas foram equilibrada no mesmo tampão sem DTT. Associação foi medido ao longo de 900 segundos. A associação é determinada pela mudança de comprimento de onda (nm). Após associação, dissociação foi determinado por transferência a ponta biossensor para tamponar sem proteína NEET por um período de 1800 segundos. Controlos para a ligação não específica para cada concentração NEET foram executados sem carga para o biossensor e subtraídos dos dados de ligação correspondentes. Os dados foram ajustados para uma 1: modelo 1 para a ligação a apo-Anamorsin a 2 e: Modelo ligando heterogêneo 1 para a ligação a holo-Anamorsin usando o software Octet. Os dados foram plotados usando Kaleidagraph (Synergy Software).

Preparação de Anamorsin transferência pós-cluster para a espectrometria de massa e interferometria biolayer

25 um apo-Anamorsin em 50 mM de Bis-Tris pH 7,0 e NaCl 100 mM foi pré-incubada com DTT 2,5 mM, durante 60 minutos. 27,5 uM NAF-1 foi em seguida adicionada e a mistura de reacção foi incubada num agitador orbital a 37 ° C durante 3,5 horas. Após a reacção de holo-Anamorsin foi purificada a partir de 1-NAF usando uma coluna de 1 ml de permuta aniónica HiTrap Q HP. A proteína foi eluída por um gradiente de NaCl de 150-500 mM em Tris-HCl 25 pH 7,5. As amostras para espectrometria de massa eram tampão trocado em amônio 10 mM de acetato de pH 7,5 tampão usando rápidas colunas rotação de proteína (Roche).

Electrospray ionização espectrometria de massa

amostras Anamorsin em acetato de amónio 10 mM pH 7,5, com uma concentração de ~ 1 mg /mL foram diluídas 100 vezes em 50% de metanol com ácido acético a 0,5% e injectado num sistema Quattro Ultima Triplo Quadrupolo (Waters). Os espectros foram adquiridos em modo de ião positivo com uma gama de m /z de 500-2000. deconvolução de massa foi realizada utilizando a ferramenta MassEnt1 no pacote de software MassLynx.

Resultados

NAF-1 ou MNT pode transferir seus clusters oxidados 2Fe-2S e apo-Anamorsin

Anamorsin tem dois sítios de ligação 2Fe-2S, cada um com um 4-Cys ligadura aglomerado ferredoxina-like que difere da dos NEETs (3Cys: 1His). Esta diferença de ligação dá-se um espectro de absorvência de UV-Vis que é distinta daquela dos NEET proteínas, predominantemente na região de 400-500 nm. Nesta região Anamorsin tem picos de absorção a 423 e 458 nm, enquanto que tanto NAF-1 e MNT ter apenas um pico a 458 nm (Figura 1). Nós determinamos o coeficiente de extinção molar do pico de cluster Anamorsin 2Fe-2S em 458 nm para ser 5800 M

-1cm

-1 por cluster, enquanto a dos NEETs é de 5000 M

-1cm

-1 por cluster [29]. Nós utilizamos a razão de 423 nm a 458 nm para monitorizar a transferência de cachos 2Fe-2S a partir de MNT-1 ou NAF para apo-Anamorsin. Como ocorre transferência esperamos que o pico de 423 nm a subir, e assim um aumento do rácio 423/458. Em contraste perda do aglomerado de solução iria resultar na perda completa de absorvência visível na região de 400-800 nm [19]. Para preparar a proteína de 2Fe-2S estudos de transferência de aglomerado, as cisteínas livres de Apo-Anamorsin são reduzidos por pré-incubação com DTT durante 60 minutos para assegurar que eles estão prontos para a ligação de cluster. A primeira verificação sobre a iniciação de transferência mostra um espectro de NEET oxidado, o que indica que a maior parte do DTT é oxidado. Reduzido DTT irá reduzir os aglomerados NEET [30], que inibe a transferência de [23]. Subsequentemente, foi adicionado 1-NAF MNT ou de pré-reduzida de apo-Anamorsin e a reacção de transferência de agrupamento foi monitorizado por espectrofotometria de UV-Vis. A estequiometria de NAF-1 ou apo-MNT a Anamorsin foi escolhido para fornecer um conjunto 2Fe-2S por Anamorsin como foi anteriormente relatado que tanto a agrupar os sítios de ligação não pode ser reconstituído simultaneamente [24, 27]. Sob condições oxidantes transferência procede tanto NAF-1 e MNT, sem perda de clusters para a solução e os dados estão bem adaptados a uma única fase exponencial (Fig 2). NAF-1 transferência passou a conclusão enquanto mnt transferida ~ 80% dos seus clusters mostrando transferência eficiente de qualquer proteína NEET para Anamorsin. Scans seleccione pontos de tempo pode ser visto na Fig S1. Redução de DTT foi mostrado em alguns casos medeiam a transferência do cluster [31]. Para testar se este foi o caso para NEET-Anamorsin, DTT foi removido a partir de Apo-Anamorsin seguinte 60 min de incubação com este agente. O DTT livre apo-Anamorsin é facilmente capaz de receber os clusters NEET (S2 ​​FIG). Isto indica que a transferência de cluster NEET-Anamorsin é um evento exclusivamente mediada por proteína.

A. estruturas (Top) cristal de MNT (código PDB: 2QH7,), NAF-1 (código PDB: 3FNV); cluster de NEET 2Fe-2S (Médio) com 3-Cys: 1His coordenação; espectros (Inferior) Absorção de MNT 25 mM e NAF-1. B. Estrutura (Superior) cristal do domínio N-terminal de Anamorsin (código PDB: 2YUI) com um esquema adicional de o aglomerado desestruturado 2Fe-2S domínio de ligação; cluster (Médio) Representante Anamorsin 2Fe-2S com a coordenação de 4-Cys (de ferredoxina, código PDB: 1RFK); (Inferior) Absorção espectro de 43 mM Anamorsin isolado do

E

.

coli

.

A reação de transferência de cluster 2F-2S foi monitorado por espectroscopia de absorção UV-Vis. O progresso da transferência foi representada graficamente em função do tempo. transferência de Cluster de NAF-1 (A) e MNT (B) para Apo-Anamorsin ocorre apenas quando o cluster 2Fe-2S é oxidado e não quando reduzidos com ditionito de sódio 10 mM. A substituição da coordenação Sua resíduo com Cys (H114C para NAF-1 e H87C para MNT) inibe mas não abole transferência. Todos os vestígios apresentados foram obtidos com 25 um NAF-1 ou MNT (50 uM aglomerados 2Fe-2S) e 50 uM de Apo-Anamorsin em 50 mM de bis Tris, NaCl 100 mM, DTT 2,5 mM, pH 7,0 a 37 ° C.

Nós ainda testado se a transferência de cluster 2Fe-2S das proteínas NEET para apo-Anamorsin era dependente do estado de oxidação do cluster como encontramos em estudos anteriores com a transferência de cluster para apo-ferredoxina [22, 23]. O espectro de NEET reduzida tem dois picos distintos (S3 FIG), ao contrário do espectro de traços característicos da redução Anamorsin [27]. Quando o cluster NEET 2Fe-2S é pré-reduzido com ditionito de sódio não haverá transferência de Apo-Anamorsin foi observado (Fig 2). Esta descoberta mostra que NEET transferência de cluster para Anamorsin requer oxidado aglomerados 2Fe-2S como nós encontrados anteriormente para a transferência a partir de proteínas NEET para apo-ferredoxina, bem como observado para a transferência do ISCU proteína de montagem de ferro-enxofre para apo-Fd [32] .

Nós ainda analisada a importância do único Sua ligando de mNT e NAF-1 para a transferência de agrupamento eficiente. Substituição das coordenadoras Seus resíduos com Cys no NAF-1 (H114C) e em MNT (H87C) inibiu transferência para apo-ferredoxina [22, 23, 33, 34]. Os espectros de NAF-1 mutante H114C e MNT H87C mutante pode ser visto na Fig S4. Do mesmo modo, descobrimos que a transferência de cluster para Apo-Anamorsin também foi inibida em mais de 10 vezes na destes mutantes (Figura 2).

As taxas de transferência de proteínas NEET são semelhantes às das proteínas de transferência de aglomerado humanas conhecidas

Transferência de aglomerados 2Fe-2S a apo-aceitadores de proteínas tem sido descrito como sendo de segunda ordem [32, 35]. Nós portanto testado transferência aglomerado de MNT-1 ou NAF para apo-Anamorsin em diferentes concentrações de dímero os doadores NEET (3,13 uM, 6,25 uM, 12,5 uM e 25 uM). A taxa observada para cada concentração (K

obs) era linearmente dependente da concentração de proteína NEET (Figura 3). A segunda constante da taxa de ordem aparente (

k

2) para cada foi determinada a partir da linear se encaixa ao k

valores obs. O

k

2 valores calculados para NAF-1 e MNT são 600 ± 90 M

-1 min

-1 e 460 ± 60 M

-1 min

-1, respectivamente, que são semelhantes aos medidos para avaliar constantes a 2Fe-2S proteínas de transferência de cluster ISCA humana e ISCU [32, 35] (Tabela 1). taxas de transferência de algumas proteínas de transferência 2Fe-2S são reforçadas por chaperones dependentes de ATP. ISCU de

Azotobacter vinelandii

na presença do sistema cochaperone HSCA /HscB e necessários cofactores transferências com uma constante de velocidade relataram que é apenas ligeiramente maior do que aquelas das proteínas NEET [36] (Tabela 1). Uma semelhança adicional entre os ISCU NEETs e é o requisito para a oxidação do cluster 2Fe-2S de transferência [32]. Tomados em conjunto, a transferência NEETs tão eficazmente quanto ISCU e são susceptíveis de funcionar de um modo semelhante.

NAF-1 (A) e MNT (B) de transferência para Apo-Anamorsin foi monitorizada por espectroscopia UV-vis absorção para uma série de concentrações NEET. Para cada concentração a proporção NEET NEET um dímero por 2 apo-anamorisn foi mantida. A constante de velocidade, k

obs, é determinada a partir do ajuste dos dados a um aumento exponencial e é representada graficamente em função da concentração de NAF-1 (C) ou MNT (D). A inclinação da linha de melhor ajuste foi utilizado para determinar constantes de velocidade de segunda ordem aparente (

k

2) para NAF-1 e MNT, que são 600 ± 90 M

-1 min

-1 e 460 ± 60 M

-1 min

-1, respectivamente.

Aqui demonstramos que os clusters 2Fe-2S são transferidos para Anamorsin das proteínas NEET. Para endereçar a possibilidade de que os NEETs são simplesmente fornecedores de ferro e de sulfureto por meio de um mecanismo de libertação e de captura, foi realizada a transferência na presença de EDTA (um quelante de ferro que sequestra o ferro livre e, assim, inibe a montagem de cluster). Enquanto o ferro livre e sulfeto podem espontaneamente formar clusters em Anamorsin [24, 27], EDTA abole a montagem. Todavia, a transferência de cada um dos NEETs para Apo-Anamorsin prossegue eficientemente na presença de EDTA (Fig S5). Portanto, o papel dos NEETs neste processo está além do simples fornecimento de ferro e sulfeto e interação direta é necessária para a transferência eficiente.

NAF-1 ou MNT ligam diretamente para apo-Anamorsin

Para investigar o potencial de interação proteína-proteína entre proteínas NEET e Anamorsin empregamos biolayer interferometria (BLI). Ambos NAF-1 e MNT ligado diretamente ao imobilizado apo-Anamorsin. As curvas de associação e de dissociação são mostrados na figura 4. On (

k

ON) e desliga-taxas (

k

off) medido para cada interação são mostrados na tabela 2. as taxas de sobre-NAF para-um e mNT diferem por um factor de dois, enquanto que a taxa de dissociação de NAF-1 é de aproximadamente 18 vezes mais rápido do que o de mNT. Também foi avaliada a ligação de holo-NEETs a holo-Anamorsin (Fig S6).

sensorgramas para a ligação de holo-NAF-1 (A) e de holo-MNT (B) para biotinilado Apo-Anamorsin imobilizados para biossensores revestidas com estreptavidina são mostrados. A associação foi seguido por 900 segundos (aumento do sinal), seguido por 1800 segundos de dissociação (decomposição de sinal). Os dados foram digno de um modelo one-to-one (curvas de preto). On e off-taxas foram determinados a partir dos acessos para cada concentração NEET-Anamorsin (mostrado na Tabela 2).

NEET proteínas pode transferir para cada um dos locais de ligação de cluster Anamorsin

Anamorsin tem dois locais de ligação de cluster 2Fe-2S e

in vitro

química reconstituição mostrou que cada site do cluster pode ser reconstituída mas a ligação do cluster eram mutuamente exclusivas [27]. Referimo-nos à primeira site como C1 eo segundo como C2 (Fig 5A). Anamorsin mutantes que contêm apenas um único local de ligação de aglomerados foram produzidos no qual todos os quatro resíduos de cisteína a partir de outro local foram substituídas por serinas para testar a possível transferência preferencial de MNT-1 ou NAF para apo-Anamorsin. O espectro de absorvância para cada mutante pode ser visto na Fig S7. Como se mostra na figura 5, cada mutante Anamorsin recebidos agrupamentos de cada proteína doador NEET mostrando pouca preferência por transferência, quer os locais aceitadores C1 ou C2

Anamorsin mutantes contendo um único sítio de ligação do cluster são mostrados.; o outro local de agrupamento foi interrompido por substituição de todos os resíduos de Cis por Ser. (A) Esquema de Anamorsin-C1 (verde) e Anamorsin-C2 (magenta) são mostrados. 2Fe-2S transferência aglomerado de NAF-1 (B) ou MNT (C) a cada único de ligação de apo-Anamorsin mutante aglomerado foi monitorizada por espectroscopia de absorção de UV-Vis. Vestígios foram obtidos com 25 mM NAF-1 ou MNT (50 aglomerados uM 2Fe-2S) e 50 mM apo-Anamorsin.

NAF-1 homodímeros podem fornecer ambos os grupos 2Fe-2S para Anamorsin

Tendo em conta os resultados acima, decidimos testar se uma única homodímero NEET poderia fornecer conjuntos 2Fe-2S a ambos os locais aceitadores C1 e C2 de um único apo-Anamorsin. transferência de Cluster foi medido para NAF-1 com o conjunto estequiométrica de doadores aos locais aceitadores (50 mM NAF-1 dímeros e 50 mm apo-Anamorsin) (Fig 6A). Estamos focados em NAF-1 porque só NAF-1 mostrou transferência completa com excesso de apo-Anamorsin (Fig 2). Transferência de ~ 1,5 2Fe-2S clusters por Anamorsin foi descoberto, surpreendentemente, mostrando que pelo menos metade das proteínas Anamorsin aceites dois grupos após a incubação com NAF-1. Observou-se sem perda de cluster para solução (amplitude espectral). À medida que os dados são bem adaptados a uma única fase exponencial, ambos os grupos são transferidos em passos cineticamente indistinguíveis. A explicação mais simples é que ambos os grupos são transferidos num único evento de ligação, embora possam ser ligeiramente a diferentes taxas, devido à composição de aminoácidos diferentes em torno dos dois locais de ligação de fragmentação Anamorsin. A transferência incompleto pode ser devido à formação de ligações dissulfureto intramoleculares em apo-Anamorsin ou possivelmente devido a cisteína cadeias laterais modificadas de Apo-Anamorsin. O primeiro foi sugerido anteriormente por transferência incompleta de ISCU para Apo-ferredoxina [32]. Para confirmar a formação de sequência de transferência de holo-Anamorsin totalmente ocupado de NAF-1 foi utilizado com ionização por electrospray espectrometria de massa (ESI-MS). A holo-Anamorsin formado por uma reacção de transferência com NAF-1 foi purificada a partir de NAF-1 utilizando cromatograf ia de permuta aniónica. O resultante complexo de holo-Anamorsin foi analisada por ESI-MS. Além disso, adquirimos ESI-MS espectros para apo-Anamorsin e Anamorsin como foi purificada a partir de

E

.

coli

. Os espectros resultantes são mostrados na figura 6B. A massa prevista para o Apo-Anamorsin é construir 35.614 Da e a massa esperada de um cluster 2Fe-2S é de 176 Da. Nós achamos que o Anamorsin purificada a partir de

E

.

coli

é predominantemente contém um único cluster, enquanto a maior fração de Anamorsin pós-transferência contém dois clusters 2Fe-2S; anteriormente reconstituição química relatou ocupação cluster para ser mutuamente exclusivas [27]. Este resultado mostra a necessidade de transferência direta para ativar Anamorsin.

(A) 2Fe-2S transferência de 50 mM diméricas NAF-1 a 50 um apo-Anamorsin (dois clusters 2Fe-2S por Anamorsin) (mostrados na vermelho) é comparado com 25 uM NAF-1 a 50 um Apo-Anamorsin (um aglomerado 2Fe-2S por Anamorsin) (mostrados a azul). Transferência é quase completa para o um cluster 2Fe-2S por amostra Anamorsin e é cerca de 75% completo para o cluster dois 2Fe-2S por amostra Anamorsin. Este último resultado indica que, pelo menos, metade do Anamorsin é capaz de receber dois agrupamentos 2Fe-2S a partir de um único NAF-1 homodímero. (B) Anamorsin consequência de uma reacção de transferência com NAF-1 foi purificado e analisadas por ESI-MS (mostrado em vermelho). Os espectros de massa de Apo-Anamorsin (linha preta sólida) é comparado com o pico principal para o pós-transferência Anamorsin (linha vermelha sólida) que mostra um aumento na massa correspondente à incorporação de dois grupos 2Fe-2S. Há também um pico menor a 35856 Da que provavelmente corresponde a Anamorsin com um único conjunto 2Fe-2S e um ião de ferro ligado que pode ser um resto de um cluster que degradado durante o processo de preparação da amostra.

E

.

coli

-purified Anamorsin é mostrada para comparação (linha pontilhada) que mostra Anamorsin contendo um único cluster 2Fe-2S.

Discussão

Neste estudo, nós identificada Anamorsin como o primeiro 2Fe-2S proteína receptor de aglomerado humano, tanto para o mNT câncer OMM relacionados e proteínas NAF-1. Recentemente, Ferecatu

et al

. [37] determinou que mnt adquire seus clusters 2Fe-2S do sistema ISC mitocondrial. Nossos resultados mostram que uma vez adquirido, MNT (e NAF-1) pode transferir seus clusters 2Fe-2S para Anamorsin proporcionando assim um caminho bem definido do ISC para a CIA através da membrana externa tethered mnt (Fig 7).

mNT na OMM e NAF-1 no MAM receber agrupamentos 2Fe-2S produzidos no interior da mitocôndria pelo sistema ISC. Ambos MNT e NAF-1 transferência desses 2Fe-2S clusters para Anamorsin. Anamorsin recebe electrões da redutase diflavin NDOR1 e fornece-os ao sistema de CIA como um passo inicial necessário para a produção de aglomerados 4FE-4S. Esta etapa requer a forma holo de Anamorsin. Ambos MNT e NAF-1 pode fornecer rotas paralelas que ligam CIA para ISC. CIA produziu aglomerados são direcionados para proteínas no citoplasma eo núcleo e são importantes para o metabolismo celular, manutenção e proliferação.

Anamorsin, que é um componente essencial da CIA, abriga cluster de dois Fe-S liga�o ao locais e descobrimos que mNT ou NAF-1 pode transferir aglomerados 2Fe-2S para ambos os sítios de ligação do cluster. As proteínas NEET pode fornecer todos os clusters necessários para ativar Anamorsin por sua função de transferência de elétrons. Esta liga agora a necessidade para a montagem mitocondrial cluster de Fe-S com a função da CIA citosólica [37, 38].

A localização do NEET na OMM /MAM e sua função semelhanças transferência de cluster para ISCU sugerir que eles pode ser parte de um percurso que liga mitocondrial montagem 2Fe-2S para o sistema de CIA. Enquanto Ferecatu

et al

. demonstraram que o knockdown de MNT não têm um impacto significativo sobre a maturação de proteínas Fe-S CIA-dependentes [37], que demonstram que o NAF-1 é mais eficiente na transferência de Apo-Anamorsin e pode ser um caminho paralelo para a CIA .

as propriedades das proteínas NEET sugerem que, além de transporte mitocondrial 2Fe-2S, eles funcionam como reservatórios que permitam aglomerados 2Fe-2S a ser montadas em condições favoráveis ​​no interior da mitocôndria e armazenado disponibilidade mais rápida quando citosólica 2Fe -2S aglomerados são necessários. Isto permitirá uma resposta mais rápida às necessidades imediatas do que seria possível se a montagem mitocondrial e transporte através de duas membranas de proteínas citosólicas. Em apoio a esta função, MNT foi encontrado recentemente para remontar /reparar o cluster 4FE-4S de ferro citosólica proteína reguladora 1 (IRP1; aconitase citosólica) após o dano oxidativo [37]. Assim, os NEETs pode funcionar no transporte de 2Fe-2S aglomerados fora das mitocôndrias, bem como um reservatório de grupos 2Fe-2S prontamente disponíveis.

NAF-1, MNT e Anamorsin cada um foram implicados no cancro [15 , 39-41]. Ambas as proteínas NEET são sobre-expressos em células epiteliais de cancro da mama, e diminuindo a sua expressão através de shRNA knockdowns resulta na proliferação de células cancerosas diminuiu e diminuição do crescimento do tumor. Como as proteínas Fe-S são essenciais para a replicação do DNA e crescimento celular, a necessidade para o fornecimento rápido de clusters de Fe-S convenientemente liga as proteínas NEET a proliferação de células cancerosas. Além disso, o homólogo de levedura da Anamorsin (Dre2) é necessária para a montagem do diferric tirosil-cofactor radical de ribonucleótido-redutase [42], que é necessário para a produção de desoxinucleótidos. A disponibilidade limitada de desoxinucleótidos que também inibem a replicação do ADN e, assim, a proliferação de células de cancro. Segmentação as proteínas NEET pode ser um meio conveniente para controlar muitos processos que são necessários para a proliferação acelerada das células cancerosas com a possibilidade de modular usando pequena molécula de direccionamento das proteínas NEET [43].

Neste estudo, nós fornecemos um link bem definida entre os sistemas da CIA ISC e através de mNT e NAF-1, que são as únicas conhecidas proteínas 2Fe-2S associados com a OMM. Mostramos que as proteínas NEET pode transferir ambos os grupos 2Fe-2S através de uma interação proteína-proteína direta para ativar a proteína CIA essencial, Anamorsin.

Informações de Apoio

S1 Fig.