Abstract

Fundo

A desregulamentação dos canônica Wnt /CTNNB1 (beta-catenina) via é um dos primeiros eventos na patogênese do câncer de cólon. Mutações no

APC

ou

CTNNB1 Quais são altamente freqüente em câncer de cólon e causar estabilização aberrante de CTNNB1, que ativa a transcrição de genes alvo Wnt por ligação a cromatina através dos fatores de transcrição TCF /LEF. Aqui nós relatamos uma análise integrativa de ocupação cromatina do genoma de CTNNB1 por imunoprecipitação da cromatina juntamente com sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) ea expressão gênica profiling por análise de microarray em cima knockdown RNAi-mediada de CTNNB1 em células de câncer de cólon.

resultados

observamos 3629 picos de ligação CTNNB1 em todo o genoma e uma correlação significativa entre CTNNB1 ligação e induzida knockdown mudança expressão do gene. A nossa análise integrativa levou à descoberta de uma assinatura-alvo de Wnt directa composta de 162 genes. Gene análise ontologia dessa assinatura revelou um enriquecimento significativo de genes via Wnt, sugerindo várias regulamentações de feedback da via. Os dados mostram que esta assinatura gene se sobrepõe parcialmente à Lgr5

+ assinatura células estaminais intestinal, e é significativamente enriquecida em células estaminais normais intestinais, assim como em amostras clínicas de cancro colorrectal. Curiosamente, enquanto a expressão do conjunto de genes-alvo CTNNB1 não se correlacionam com a sobrevivência, a expressão elevada de reguladores de feedback negativo na assinatura prediz melhor prognóstico.

Conclusão

Nossos dados fornecem uma ampla do genoma vista da cromatina de ocupação e gene regulação do Wnt /CTNNB1 sinalização em células cancerígenas do cólon

Citation:. Watanabe K, Biesinger J, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) Integrativa ChIP-seq /Análise de Microarray Identifica uma assinatura CTNNB1 alvo enriquecido em células-tronco intestinais e cancro do cólon. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10.1371 /journal.pone.0092317

editor: Ted S. Acott, Casey Eye Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de outubro de 2013; Aceito: 20 de fevereiro de 2014; Publicação: 20 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Watanabe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento do Susan G. Komen conceder KG110897 (XD), um Departamento de Defesa BCRP pós-doutorado (KW W81XWH-10-1-0383) dos Estados Unidos, e os Institutos Nacionais de Saúde concedem R01HG006870 (a XX). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Brian S. Roberts e William T. Arthur são ex-funcionários da Rosetta Inpharmatics, LLC , Merck Co Inc. Michele Cleary é atualmente um empregado de Merck Co., Inc. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Fundo

sinalização de Wnt /CTNNB1 é uma via conservada que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento embrionário, a homeostase do tecido e manutenção de células estaminais. No intestino normal, esta via é essencial para o desenvolvimento e manutenção de células estaminais intestinais [1], [2]. A activação da via de sinalização Wnt canónica envolve estabilização de CTNNB1 citoplasmático, que é de outro modo degradado pelo proteassoma através de um complexo composto de degradação da proteína supressora de tumor APC, serina /treonina quinase GSK-3, e Axin. Estabilizado CTNNB1 transloca-se para o núcleo onde se liga a factores de transcrição TCF /LEF e activa a expressão do gene alvo [2]. Um evento de iniciação chave do câncer colorretal (CRCs) é CTNNB1 estabilização através da perda do

APC

gene ou mutações ativadoras no gene

CTNNB1

[3]. Este evento genética ocorre principalmente na população de células estaminais intestinal [4] – [6] e leva à proliferação anormal de células mutantes através da activação de genes alvo, tais como

MYC

e

CCND1

[7 ]. No entanto, dadas as funções celulares diferentes de sinalização de Wnt /CTNNB1, outros genes-alvo também podem contribuir para a patogênese da CRCs.

Assim, a identificação e caracterização de genes alvo CTNNB1 genoma-wide ter sido um exercício importante no CRC estudos. perfis de transcrição foi usada para identificar genes alvo de Wnt /CTNNB1 em células [8] do cancro do cólon. No entanto, a análise da expressão genética por si só é limitada devido à incapacidade de distinguir entre os efeitos primários e secundários da activação da via de Wnt. Mais recentemente, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguido por análise de DNA em larga escala, tais como ADN-chip (ChIP-chip) ou sequenciação de alto rendimento (ChIP-SEQ) [9], [10] foi usada para identificar os loci genómico de factores que CTNNB1 ou TCF ligar directamente [11] – [14]. No entanto, estudos baseada em chip de vários fatores de transcrição sugerem que nem todos os eventos de ligação identificados correlacionam-se com a regulação da transcrição em um nível funcional [15]. Portanto, é importante para executar uma análise integrativa incorporando tanto mapeamento cromatina ocupação e a expressão do gene de perfil do mesmo tipo de células cancerígenas do cólon, a fim de identificar genes alvo de Wnt /CTNNB1 directos e funcionais, que ainda não tenha sido feito em todo o genoma a literatura.

no estudo atual, nós combinamos ChIP-seq com a análise microarray utilizando a linha celular SW480 humana cancro do cólon, onde a atividade de sinalização Wnt desregulada tem sido bem documentada. Nós relatamos uma correlação significativa entre a ligação CTNNB1 e regulação da expressão, bem como a identificação de um conjunto de 162 genes como “genes-alvo directo Wnt ‘que estão vinculados e ativados por CTNNB1. A assinatura do gene alvo Wnt foi enriquecida em células estaminais normais intestinais e CRCs mas falhou em prever prognóstico de pacientes de CRC. Nosso estudo fornece um recurso importante para a compreensão da biologia da sinalização de Wnt.

Resultados

análise ChIP-seq de CTNNB1 cromatina ocupação em células SW480

SW480 células contêm uma mutação de inactivação

APC

gene que resulta num elevado nível de proteína estabilizada CTNNB1 constitutivamente nos núcleos [16], [17]. Para capturar a interacção, presumivelmente dinâmica de CTNNB1 com cromatina [18], [19], que otimizada um protocolo ChIP utilizando específicos para amina proteína-proteína reticuladores anteriores ao formaldeído reticulação juntamente com extracção nuclear [20] (ver métodos) . A ligação específica de CTNNB1 foi validado pela primeira vez por ChIP-PCR para alvos conhecidos, incluindo

MYC

e

LEF1

(Figura 1A). DNAs de vários experimentos chip, utilizando anticorpo ou controlo de isotipo de controlo anti-IgG CTNNB1 foram agrupados para Solexa /Illumina seqüenciamento, que rendeu cerca de 26 milhões de sequência de 36 nucleotídeos indivíduo lê em cada corrida. Lê apenas mapeados exclusivamente no genoma humano (15776628 para IgG de controlo e 17112552 para o anti-CTNNB1) foram utilizados para a análise subsequente (Tabela 1). Model-Based Análise de ChIP-Seq (MACS) [21] identificou 3629 CTNNB1 regiões de pico de ligação (

p

valor ≤ 1E-5, FDR ≤ 5%) em todo o genoma (Tabela 1). Aproximadamente 60% dos picos estão localizados numa proximidade imediata das regiões de codificação de genes, incluindo-promotor (2-kb a 5 ‘que flanqueia a região, 21,5%), 5′-UTR (6,9%), exão (5,5%), o intrão (21,6 %), regiões 3’-UTR (3,2%) e a jusante 2-KB região 3 ‘(flanqueando, 0,5%) (Figura 1B). Enriquecimento de CTNNB1 ligação aos promotores (21,5%) foi estatisticamente significativa (

P

0,001) quando comparada com a distribuição de picos gerados aleatoriamente de tamanhos semelhantes (3,5 ± 0,2%). Consistente com um relatório anterior [12], a distribuição de pico correlacionou-se significativamente com a proximidade dos locais de início da transcrição (SST) (Figura 1C). Uma vez que um intensificador CTNNB1 /TCF-ligado pode actuar remotamente a partir do TSS [18], que procurado para TSSs que estão localizados dentro de 20 kb a partir dos picos observados, e identificou 2794 genes que foram utilizados na análise subsequente para identificar os genes-alvo directos .

A. otimização

Chip. ChIP-PCR foi realizada por elementos de ligação conhecidos CTNNB1 em LEF1 myc e regiões reguladoras de genes. anticorpo * anti-PYGO2 foi usada como um controlo positivo, como associados proteína PYGO2 com a proteína CTNNB1-TCF /LEF complexo [51].

B.

Distribuição das regiões CTNNB1 vinculativas sobre o genoma relativamente a genes humanos RefSeq. Um “promotor” é definido como a região 2 kb a montante do TSS, enquanto que uma região “a jusante” é definido como a região 2 kb a jusante do local de terminação da transcrição. região intergénica refere-se a todas as outras do que ‘promotor’, 5′-UTR, “exão”, “intron”, ‘3’-UTR’, ou «a jusante» locais.

C.

Distância a partir do centro de cada pico de ligação CTNNB1 no TSS do gene mais próximo. A linha vermelha representa um padrão distribuídos aleatoriamente gerado tomando 1000 permutações aleatórias dos picos.

D.

Programa MEME identifica um motivo de consenso TCF /LEF de ligação dentro dos picos Chip-seq.

Usando Múltipla EM para Motif elicitação (MEME), um de Novo programa de descoberta motivo [22], analisou-se os picos CTNNB1 únicos para a presença de qualquer possível motivo de consenso. Uma sequência estendida TCF /LEF consenso [12], [13] surgiu como a principal motivo classificado (valor de E = 7.9e-1135) (Figura 1D). Várias outras sequências candidatas também foram identificados; no entanto, eles pareciam representar sequências repetitivas, que são artefactos comuns desta análise (dados não mostrados). Estes dados confirmam que CTNNB1 se liga a cromatina principalmente através TCF /proteínas de ligação de ADN LEF [11]. Dito isto, não podemos excluir os motivos de ligação potenciais que não foram detectados pelo meme, bem como a existência de outros motivos associados que se encontram fora das regiões ChIP pico [12], [14]. Com efeito, uma pesquisa K-mer [23] revelou que a AP-1 sequência de consenso (TGAYTCA) significativamente é enriquecida em relação ao tamanho similar fragmentos genómicos aleatórios (

P =

1.78e-50), consistente com trabalhos anteriores relatando o enriquecimento de AP-1 motivos em elementos CTNNB1 de ligação [12].

Usando o navegador UCSC Genome (NCBI36 /hg18) [24], nós visualizado CTNNB1 de ligação com genes conhecidos alvo Wnt /CTNNB1.

Axin2

é um alvo clássico e contém múltiplos TCF /LEF regiões de ligação em seu promotor e o primeiro intrão [25]. A nossa análise ChIP SEQ fato identificados vários picos em

AXIN2

, com as suas posições correspondendo bem com os sítios de ligação relatados (Figura 2A). Nós também detectou picos em regiões relatados de outros genes alvos conhecidos, incluindo

MYC

[12] e

LEF1

[26] (Figura 2B e C).

São mostrados resultados para distribuições CTNNB1 e IgG no gens Ref-seq. caixas vermelhas indicam as posições dos motivos consenso TCF /LEF vinculativos. domínios H3K4me1 e H3K4me3 de múltipla Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) linhas de células são mostrados como referências para as regiões potenciador /promotor e do promotor, respectivamente.

Análise Combinatória de ligação à cromatina e os dados de expressão de genes identifica uma relação directa CTNNB1 assinatura gene alvo contendo reguladores de feedback do Wnt via de sinalização

Para identificar genes alvo CTNNB1 diretos e funcionalmente relevantes, analisamos o conjunto de dados ChIP-seq em relação aos dados de criação de perfil de transcrição de controle e CTNNB1-empobrecido SW480 células [27] . Tal como descrito anteriormente [27], de knockdown CTNNB1 foi realizada utilizando dois diferentes ARNsi específicos de CTNNB1, que quando testado num ensaio funcional utilizando um repórter beta-catenina-Activated (BAR) [28] foram capazes de suprimir a actividade de -99 BAR % e ~97%, respectivamente. Foi realizada Gene definido análise de enriquecimento (GSEA), utilizando o teste modificado de Kolmogorov-Smirnov (KS) [29] para avaliar os genes CTNNB1-bound para sua distribuição no conjunto de dados microarray em que os genes foram rank-ordenado para a sua expressão diferencial entre o controle e células CTNNB1-empobrecido. O teste KS revelou uma correlação altamente significativa (

p

= 0) entre a ligação CTNNB1 e as mudanças de expressão gênica após CTNNB1 knockdown, e isso era verdade com as duas siRNAs (Figura 3A e dados não mostrados). A maioria dos genes CTNNB1-ligadas foram positivamente correlacionados, enquanto que um pequeno número de genes foram negativamente correlacionados, com expressão CTNNB1 (Figura 3B). Isto é consistente com CTNNB1 actua principalmente como um activador de transcrição, mas também de ser capaz de reprimir a expressão de certos genes [30].

A-B

. parcelas KS mostrando correlação entre a ligação CTNNB1 e regulação da expressão. Os 2794 genes ligados a CTNNB1 foram comparados para a sua correlação com as mudanças de expressão sobre siRNA knockdown de CTNNB1. Genes no microarray foram classificados por

p

valor (

A

,

p

= 4.4e-16) ou fold aumento (

B

,

p

= 0) em cada GSEA

Usando um critério combinatórios, ou seja, a regulação negativa na análise microarray com

p

. 0,01 e razão -0.2 após o tratamento de ambos os siRNAs e exibindo picos de ligação CTNNB1 a ± 20 kb do TSS, foram identificados 162 genes como alvos Wnt diretos e funcionais (Tabela S1). Incluído neste assinatura alvo são conhecidos alvos, como

AXIN2, CDX2, ID2, LEF1, LGR6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1,

e

TNFRSF19

, indicando a validade do assinatura. Nós também amostradas 10 genes a partir da lista, e usado ChIP-PCR para confirmar CTNNB1 de ligação nos locais esperados (Figura 4A). Usando um shRNA contra CTNNB1 que é diferente dos dois siRNAs utilizados na análise de microarray, que validado que knockdown de CTNNB1 resultou numa regulação negativa significativa da maioria dos genes testados, incluindo

FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, notum , PPP1R2,

e

trem2

(Figura 4B).

A

. análise ChIP-PCR dos genes indicados utilizando uma amostra preparada de forma independente da cromatina.

LEF1

e

GAPDH

servem como controlos positivos e negativos, respectivamente.

B

. RT-PCR quantitativa dos genes indicados. ± desvio padrão de 4 experiências independentes são mostrados.

valores p

são calculados com a norma bicaudal

t-

teste. NS: não significativo, *:

p Art 0,05, e **:

p Art 0,01

Gene Ontology (GO) enriquecimento prazo,. banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) [31] do 162-target-assinatura sugeriu funções de desenvolvimento importantes da via Wnt, incluindo a morfogênese embrionária apêndice, coração ou desenvolvimento muscular (Tabela S2). GO análise de genes revelou também envolvidos em várias vias de sinalização, sugestivos de potenciais cruzadas conversações entre a sinalização de Wnt e estas vias. Especificamente, caminho significativamente detectado GO termos incluem citocina sinalização (

FASL, BMP7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, EDAR, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19

), as vias em câncer (

FASL, Gli3 , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, LEF1, WNT6, WNT11

), ou via de sinalização Hedgehog (

Gli3, BMP7, WNT6, WNT11

) (Tabela 2).

GO análise de genes também identificou que codificam componentes de sinalização Wnt como alvos CTNNB1 e geramos uma lista alargada de reguladores de feedback potenciais (Tabela 3).

AXIN2, LEF1, NKD1

e

NKD2

têm sido descritos como reguladores de feedback negativos ou positivos da via [25], [32], [33].

WNT6

e

WNT11

codificam ligantes Wnt que têm papéis potenciais promotores de tumor mesmo em CRCs com

APC

mutações [34] e que têm a capacidade de sinalizar para o estroma componentes para modular o microambiente do tumor [35]. Outros reguladores de feedback potencial incluem

APCDD1

,

notum, PPP1R2

, e

ZNRF3

.

APCDD1

é relatado para regular negativamente a via no passo interacção ligando-receptor e a sua mutação é responsável por uma doença autossómica perda de cabelo dominante, hereditária simplex hipotriquia [36].

notum

codifica uma α /β-hidrolase secretada, que é conhecida por antagonizar Wnts soltando glypicans da superfície da célula [37].

PPP1R2

produto do gene inibe a proteína complexo fosfatase 1, que regula a situação phospholyration de GSK3 [38] e, consequentemente, CTNNB1 degradação [39].

ZNRF3

codifica uma ubiquitina ligase E3 que promove especificamente ubiquitinação e degradação de receptores Frizzled [40], [41]. Como mostrado acima, temos confirmado

notum

e

PPP1R2

a ser alvos de boa fé de CTNNB1. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a sinalização Wnt está sujeito a regulamentações de feedback complexos.

A assinatura alvo CTNNB1 é enriquecida em células-tronco intestinais e CRCs, mas não se correlaciona com a sobrevida dos pacientes CRC

Lgr5

+ células intestinais são divisão activa células-tronco ea via de sinalização Wnt /CTNNB1 desempenha um papel crítico na sua auto-renovação [2]. Por isso, em comparação a assinatura alvo CTNNB1 identificados neste estudo com uma assinatura gene relatado recentemente (um conjunto de 510 genes identificados a partir de perfis de transcrição baseado em microarray e perfil de proteínas por espectrometria de massa) que é enriquecido em Lgr5

+ células-tronco intestinais [42 ]. A sobreposição estatisticamente significativa (

p Art 8.9e-07, o fator de representação 4,1; comparando ao acaso) foi encontrado: 17 genes (~ 10%) na assinatura gene alvo CTNNB1 também fizeram parte da o Lgr5

+ assinatura células estaminais intestinal (Figura 5A, Tabela 4). GSEA em um dados de microarranjos definidos a partir de uma população enriquecida em EphB2 intestinal com células-tronco de células epiteliais do cólon humano (GSE31257) [43] revelou também o enriquecimento do nosso 162-target-assinatura nestas células [Normalizada Enriquecimento Score (NES) = 1,81, FDR

q

-valor = 0,0; Figura 5B]. Estes dados sugerem que os genes alvo CTNNB1 diretos em células SW480 também são ativados nas células-tronco intestinais normais.

A

. Sobreposição entre o conjunto gene alvo CTNNB1 eo Lgr5

+ intestinal tronco conjunto de genes de células.

p valor

e representação fator de destaque significância estatística em relação ao acaso. Cálculo baseou-se no pressuposto de que o número de genes totais é 20000.

B-C

. GSEA para os 162 genes usando dados comparativos entre EphB2

célula de alta intestinal humano caule e EphB2

populações de células nonstem baixos (

B

), ou entre o câncer de cólon e amostras de tecidos normais (

C

).

Para investigar a relevância do 162-target-assinatura em amostras clínicas, realizamos GSEA em dados de expressão de genes de amostras de cancro do cólon humano (GSE41328) [44] . Esta análise revelou um enriquecimento marcante da assinatura alvo CTNNB1 em amostras de câncer de cólon em comparação com tecidos de cólon normal (NES = 2,01, FDR

q

-valor = 0,0; Figura 5C). Nós também utilizado um conjunto de dados de expressão gênica disponível publicamente para testar se o 162-target-assinatura pode prever o resultado de pacientes com câncer de cólon [45]. Apesar do enriquecimento da assinatura em amostras de câncer de cólon, não observamos nenhuma correlação significativa entre a expressão global da assinatura e sobrevivência pós-operatório livre de doença de pacientes com câncer de cólon (Figura 6A). Dito isto, a expressão de vários dos reguladores de feedback negativo que identificamos neste trabalho correlacionados com uma melhor taxa de sobrevida livre de doença. Por exemplo, os pacientes com expressão alta média de

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2

, e

notum

mostrou significativamente a sobrevida livre de doença em comparação com o grupo de baixo expressor (Figura 6B). Juntos, nossos resultados revelam um enriquecimento de genes alvo CTNNB1 direta em células-tronco intestinais e amostras de CRC clínicos. No entanto, uma correlação significativa com o prognóstico de pacientes com CCR é limitado a um subconjunto seleto de genes alvo CTNNB1, nomeadamente os factores de feedback negativo, em vez de toda a assinatura alvo.

Um total de 232 pacientes foram categorizados em alta ( vermelho) ou baixas expressadores (azul) com base na expressão dos 162 genes (

a

) ou cinco genes de feedback negativo (

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, notum)

(

B

).

p valores

foram calculados por meio de análise de log rank.

Discussão

A nossa seleção imparcial escala genoma de genes alvo CTNNB1 combinando ChIP-seq e microarray analisa fornece uma recurso importante para a investigação do cancro do cólon. Apesar da correlação significativa entre a ligação da cromatina e regulação da expressão gênica, o nosso trabalho revela um pequeno número (162) de genes como alvos, CTNNB1 funcionais diretos em células cancerígenas do cólon SW480. Este número é consideravelmente menor do que a de loci CTNNB1-ligado ou de genes CTNNB1-responsivas, sugerindo que nem todos os loci ligados são funcionalmente utilizados em células SW480 para a regulação da transcrição, e que a maior parte das alterações na expressão genética ocorre consequências indirectas de CTNNB1 depleção. Poderíamos ter perdido algumas metas modestamente regulamentados, exigindo a mudança de expressão gênica para ocorrer após tratamento com dois siRNAs diferentes e usando valores de corte rigorosas. Alguns dos loci ligados a CTNNB1 pode ser regulada de forma específica ao contexto; Por exemplo, genes que têm camadas adicionais de regulação tais como os silenciados por metilação do DNA ou predominantemente controlada por outros reguladores transcricionais /translacionais em células SW480 pode não mostram uma diminuição significativa na transcrição em cima depleção CTNNB1. Ele continua a ser possível que tais loci são regulados por CTNNB1 em outros contextos celulares.

Nossos experimentos de validação sugerem uma taxa de sucesso de 80% na identificação de boa fé alvos CTNNB1 usando a abordagem genômica. A diferença na eficiência knockdown entre si /shRNAs ou fora do alvo efeitos de si /shRNAs pode contribuir para os “falsos positivos”. A assinatura alvo CTNNB1 de 162 genes apresenta algumas características interessantes. O mais impressionante é a presença de reguladores de feedback da via. regulação por feedback da via Wnt /CTNNB1 foi bem estabelecida com base em estudos de genes individuais [25]. Usando a análise de série de ocupação da cromatina (SACO), CTNNB1 ocupação de componentes da via de sinalização Wnt canónica foi descoberto [11]. Nossa descoberta de que componentes Wnt via estão sobre-representadas na assinatura alvo CTNNB1 acrescenta evidências adicionais para apoiar este importante modo de regulação. De nota, o nosso estudo e no estudo SACO [11] descobrem genes da via Wnt em grande parte distintas como alvos CTNNB1: dos 15 genes que foram identificados no estudo SACO, apenas 2 genes (

AXIN2

e

WNT11

) foram encontrados na nossa lista de 10 genes Wnt via (Tabela 2). Além disso, quando comparado com outro estudo CTTNB1 ChIP-seq que utilizou células HCT116 [12], uma sobreposição de 161 genes CTNNB1-bound foi encontrada entre os 988 genes identificados neste estudo e os 2794 genes identificados no estudo atual. Mesmo que a sobreposição é estatisticamente significativa (

P

4.8e-07), um número substancial de genes alvo era específica para cada estudo. Isso pode ser em parte devido a uma diferença na definição de parâmetro ou ruídos potenciais na análise, mas também pode refletir uma diferença real na função CTNNB1 entre as linhas de células CRC (HCT116 vs. SW480) utilizados nos dois estudos. Com efeito, a diferença nos padrões de metilação do DNA de genes alvo Wnt entre HCT116 e SW620, uma variante metastático nó de linfa de SW480, tem sido relatada [46]. Como tal, o nosso trabalho revela novas facetas da regulação por feedback da sinalização Wnt /CTNNB1. Afinar a saída de sinalização Wnt por múltiplos mecanismos de feedback pode ser importante para a regulação espaço-temporal preciso da sua actividade durante a padronização do tecido e manutenção da homeostase do tecido. Além disso, o mau funcionamento de tais mecanismos podem contribuir para condições patológicas tais como cancro [47].

Mesmo para um número relativamente pequeno de genes no-alvo 162 de assinaturas, os termos funcionais relacionadas aparecem indefinido e diversificada. Isto é consistente com os efeitos biológicos divergentes de Wnt /CTNNB1 [2] sinalização. A assinatura inclui um número de reguladores transcricionais (Tabela S1), o que implica a existência de alvos transcricionais secundários /indirectos. A identificação de CTNNB1 direta alvos /TCF por outros [11] – [14] e este trabalho fornece uma estrutura para dissecar as contribuições relativas de genes-alvo directos e indirectos para os efeitos biológicos da via

É. amplamente reconhecido que a desregulação da via Wnt /CTNNB1 é um passo fundamental início de tumorigênese intestinal [48]. Esta desregulação Pensa-se que ocorrem na população de células estaminais intestinal que alimenta o crescimento tumoral [5], [6]. Consistente com esta noção, verificou-se a assinatura-alvo a ser CTNNB1 significativamente enriquecida em células estaminais isoladas intestinais, assim como em amostras clínicas de CRC. No entanto, não observamos uma correlação significativa entre a expressão da assinatura alvo e o prognóstico dos pacientes com CCR. Isto é interessante, tendo em conta que a expressão elevada de uma assinatura de células estaminais intestinal prediz mau prognóstico de pacientes de CRC [46], [49] e que a desregulação da via Wnt tem sido conhecida como uma marca de CRC [50]. O facto de o assinatura CTNNB1 alvo inclui um número de factores de feedback pode complicar o cenário. Por exemplo, a supressão dos reguladores de feedback negativo pode ligar a actividade de sinalização Wnt oncogénica em células cancerosas, mas uma vez que estes comentários fatores próprios são alvos Wnt, o padrão de Wnt geral expressão do gene alvo pode não parece estar correlacionada com o prognóstico. Na verdade, silenciamento de Wnt genes alvo por metilação do promotor foi observado no CRCs com mau prognóstico [46]. Nossos resultados mostram que a expressão de selecionar fatores de feedback negativo de nossa lista gene fato correlaciona-se positivamente com a sobrevivência de pacientes com CCR (Figura 6B). Em tais casos em que os reguladores de retroalimentação negativa da via são silenciados, a expressão do gene alvo média pode não reflectir a efectiva actividade de sinalização da via. Assim, o presente estudo e outros [46] sugerem que considerações cuidadosas dos regulamentos complexos e dependência de contexto têm garantia sobre a utilidade clínica dos vários conjuntos de genes alvo Wnt que surgiram na literatura. Nosso estudo contribui para uma visão abrangente da regulação de sinalização Wnt em CRCs, que tem sido estudada há décadas, mas ainda não foi totalmente compreendido.

Conclusão

Nossos dados fornecem uma visão de todo o genoma do gene regulação por Wnt /CTNNB1 sinalização em CRCs. A análise do gene alvo revelou múltiplas camadas de regulação por feedback da via Wnt /CTNNB1. A assinatura gene alvo direto CTNNB1 foi altamente expresso em populações de células-tronco intestinais e as células cancerosas, mas não mostrou correlação significativa com a sobrevida dos pacientes de CRC. Este estudo fornece um recurso importante para entender as funções complexas e divergentes de Wnt /CTNNB1 via.

Métodos

cultura celular

SW480 células foram obtidas de ATCC e mantidas em Dulbecco meio eagle modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino.

cromatina imunoprecipitação (CHIP) e high-throughput seqüenciamento

chip foi realizada de acordo com o protocolo da Millipore com algumas modificações. células SW480 foram reticulada primeiro com um cocktail de agentes de reticulação da proteína-proteína [0,67 mM de sulfato de dissuccinimidilo (DSS), 0,67 mM de dissuccinimidilo glutarato (DSG), e 0,67 mM de glycolbis etileno (succinimidilsuccinato) (EGS)] [20] durante 45 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, em 0,75% de formaldeído durante 10 minutos a 37 ° C. Após a lavagem, a cromatina foi cortado em fragmentos ~100-300-BP utilizando um Bioruptor (Diagenode Inc.). Os lisados ​​foram pré-aclarados com proteína A Dynabeads (Invitrogen) durante uma hora a 4 ° C, e pequenas aliquotas de sobrenadante recuperado foram sujeitos a inverter a reticulação e purificação de ADN (como amostras de entrada). amostras de entrada foram usadas para medir a concentração de ADN cromatina e imunoprecipitação foi realizada com 25 ^ g de cromatina contendo ADN a 4 ° C durante a noite com IgG de controlo (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) ou anticorpo anti-CTNNB1 (Santa Cruz Biotechnology, SC-7199). Imuno-complexos foram então purificados com Dynabeads proteína A e reverter ligações cruzadas por incubação com NaCl 200 mM a 65 ° C durante 5 horas. Após tratamento com proteinase K durante 1 hora, o DNA chip foi recuperado usando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen, 28104). geração biblioteca foi realizada utilizando amostras de DNA ChIP combinados provenientes de quatro preparações Independent Chip usando o protocolo Illumina. Resumidamente, as extremidades do fragmento de DNA foram reparadas e ChIP fosforilado usando Klenow, polimerase de ADN de T4 e T4 polinucleótido cinase (componentes do kit Ilumina). Após a ligação de adaptadores Illumina, o DNA foi seleccionado por tamanho purificação em gel e, em seguida, amplificado por PCR utilizando iniciadores Illumina. O sequenciamento foi realizado em Ambry Genetics em um Illumina Genome Analyzer IIx, uma pista por amostra, de 36 bp sequenciamento Singleton.

O experimento validação foi feita usando o chip-PCR com iniciadores listados na Tabela S3.

análise Microarray

A análise foi publicado anteriormente [27], e os detalhes experimentais são os seguintes. microarray duas cores foi realizada em duplicata para SW480 transfectadas com o controle (siRNA contra o gene luciferase) e dois siRNAs independentes contra CTNNB1 (CTNNB1 # 1 para a frente; CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, reverso; UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1 # 2 para a frente; CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, reverso; UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), respectivamente. Vinte e quatro horas ap a transfeco, o ARN foi extraído a partir das células utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). O ADNc foi sintetizado com Cy3 (controlo) e Cy5 (siARN CTNNB1) de rotulagem, utilizando uma versão automatizada personalizada do MessageAmp II kit aminoallyl (Life Technologies). As amostras marcadas foram hibridadas com Rosetta /Merck humano 44k 1,1 microarray (GPL4372) por incubação a 40 ° C durante 48 horas num carrossel rotativo. Após lavagem para remover amostras hibridadas não-específicos, microarrays foram secos numa câmara de azoto isenta de ozono. Microarrays foram digitalizados usando o scanner a laser Agilent LP2. A saída do scanner é um arquivo Tiff, que contém dados de hibridização quantitativos de cada microarray individual. Os arquivos TIFF foram então processados ​​usando software de extração de recurso personalizado Rosetta, que realiza a modelagem de erro. Os dados foram então processados ​​usando o sistema Rosetta Resolver®, que executa uma operação de aperto que combina repetições da mesma sequência em uma matriz durante a aplicação de ponderação de erro. A ponderação de erro consistiu de ajuste para aditivo e ruído multiplicativo.