Abstract
Objectivo
Este estudo teve como objetivo investigar o estado de metilação da região promotora do fator de transcrição spalt-like 3 (
SALL3
) ea expressão de
SALL3
no cancro do colo do útero para explorar a função deste gene na carcinogênese do câncer cervical.
Métodos
o estado de metilação de
SALL3
foi detectada por methylation- PCR específico, e
SALL3
expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real quantitativa em linhas celulares de cancro do colo do útero, SiHa, HeLa e C33A, bem como em amostras de tecido de cancro do colo do útero (n = 23), combinado pericarcinomatous amostras de tecido (n = 23) e amostras de tecidos colo normais (n = 17). MTT foi utilizado para medir a capacidade de viabilidade celular e proliferação de células SiHa e HeLa.
Resultados
O
SALL3
promotor estava completamente metilado em células SiHa, não metilado em células C33A e parcialmente metilado em células HeLa. Após o tratamento das células SiHa e HeLa com 5 uM e 10 uM de 5-azacitidina (5-Aza), respectivamente, o nível de metilação do
SALL3
promotor diminuiu e observou aumento no grau de unmethylation numa dose forma dependente. Além disso, a expressão relativa de
SALL3
ARNm aumentou à medida que a concentração de 5-aza aumentada em SiHa (
P
0,05) e HeLa (
P
0,05 ) células. Este aumento acima mencionado na
SALL3
ARNm em células SiHa foi mais notável do que a observada em células HeLa. capacidade de proliferação celular também diminuiu após a administração de 5-Aza de células SiHa e HeLa (
P
0,05). Metilação do
SALL3
promotor foi observada em 15 de 23 (65,21%) amostras de tecido de câncer cervical, 15 de 23 (65,21%), coincidiram com amostras de tecido pericarcinomatous e 5 de 17 (29,41%) amostras de tecido cervical normal (
p Art 0,05).
SALL3
expressão de mRNA foi significativamente menor no cancro do colo do útero e tecidos pericarcinomatous em comparação com os tecidos cervicais normais (
p Art 0,05). Em todas as amostras de tecido do colo do útero, infecção por HPV foi associado positivamente com hipermetilação da região promotora de
SALL3
(
p Art 0,05, r = 0,408), e a expressão de
SALL3
mRNA em tecidos HPV-positivos foi menor do que em tecidos HPV-negativos (
p Art 0,05).
Conclusão
A hipermetilação aberrante de
SALL3
juntamente com o envolvimento HPV inativado sua função como um supressor tumoral e contribuiu para a carcinogênese em câncer cervical
Citation:. Wei X, Zhang S, Cao D, Zhao M, Zhang Q, Zhao J, et ai. (2015) aberrante Hipermetilação de SALL3 com envolvimento HPV Contribui para a carcinogênese do câncer cervical. PLoS ONE 10 (12): e0145700. doi: 10.1371 /journal.pone.0145700
editor: Xuefeng Liu, da Universidade de Georgetown, Estados Unidos
Recebido: 09 de junho de 2015; Aceito: 06 de dezembro de 2015; Publicação: 23 de dezembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Wei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Dados Disponibilidade: Todos os dados subjacentes os resultados do nosso estudo estão disponíveis gratuitamente no jornal e seu arquivo de Informações de Suporte
Financiamento:.. Esta pesquisa foi apoiada por um National Science Foundation Natural da China (No. 81.472.428)
Competindo interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
fileiras câncer cervical como a segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer do trato genital entre as mulheres em todo o mundo, e resulta em aproximadamente 266.000 mortes. cada ano de acordo com a recente Rede Nacional de Comprehensive Cancer (NCCN) orientações (2015 versão) [1] .Over 99% dos casos estão ligados à infecção dos órgãos genitais com papilomavírus humano (HPV), que foram identificados na etiologia do colo do útero câncer e ter infectado cerca de 660 milhões de pessoas [2]; No entanto, a prevalência da infecção pelo HPV ainda é insuficiente para dar conta de todas as instâncias da carcinogênese cervical. Nos últimos anos, mecanismos epigenéticos, especialmente a metilação do DNA, têm surgido e que, posteriormente, forneceu novos insights sobre a ocorrência de tumores [3, 4]. No entanto, os cientistas continuam a explorar os mecanismos da carcinogênese e do desenvolvimento de cânceres em genômica.
Spalt-like factor de transcrição 3 (
SALL3
) é um membro da
SAL
família e está localizado em 18q23.
SALL3
codifica um sal do tipo C
2H
2 de tipo proteína zinc-finger. As mutações em alguns destes genes estão associados com perturbações congénitas na espécie humana, o que indica a sua importância no desenvolvimento embrionário [5-7]. Shikauchi
et ai [8] descobriram que
SALL3
foi silenciado por metilação do DNA e que o produto proteico deste gene (SALL3) interage directamente com o domínio de PWWP DNMT3A no carcinoma hepatocelular humano ( HCC), que sugeriu que
SALL3
actua como um supressor tumoral no carcinoma hepatocelular. Love
et al
[9] sequenciaram os exomes de 59 tumores de linfoma de Burkitt, e os resultados mostraram pela primeira vez que
SALL3
foi recorrentemente mutado em Burkitt linfomas. Além disso, em CD133 (+) células de câncer colorretal (CRC),
SALL3
foi significativamente regulada para cima em comparação com CD133 (-) células CRC [10]. Além disso, um estudo recente utilizando análise de metilação do DNA de alto rendimento também mostrou que
SALL3
era um potencial biomarcador para o câncer de cólon [11]. Os resultados acima mencionados demonstram que a expressão anormal de
SALL3
está associado com a ocorrência de vários tipos de câncer. No entanto, se
SALL3
está envolvido na carcinogênese do câncer cervical permanece desconhecida.
Em nosso estudo, nós demonstramos que a região promotora de
SALL3
é hipermetilado e, juntamente com a infecção pelo HPV, está envolvido no cancro do colo do útero; Além disso, o nível de ARNm SALL3 expressão foi regulada para baixo. Nós sugerimos que a metilação do DNA de
SALL3
inibe o seu papel como um supressor tumoral e contribui para a carcinogênese do câncer cervical.
Materiais e Métodos
declaração Ética
Este estudo foi aprovado pela “Comissão de Ética do primeiro Hospital Filiado de Xi’an Jiaotong University” em Shannxi, China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes para a participação neste estudo.
linhas de células e condições de cultura
As três linhas celulares de cancro do colo do útero humanas SiHa, HeLa e C33A foram dadas a nós pelo Dr. Jing Ji do primeiro Hospital Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong [12, 13]. Todas estas células foram cultivadas em glucose elevada de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM) (HyClone, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Si Ji Qing, China), a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2.
5-azacitidina Tratamento
1,0 × 10
5 /cavidade células SiHa e HeLa foram cultivadas separadamente em placas de 6 poços em DMEM com 10% de FBS, e depois 24 horas, o meio foi substituído com meio fresco contendo 0, 5 ou 10 uM 5-azacitidina (5-Aza) (Sigma, EUA). O meio contendo 5-Aza foi substituído a cada 24 horas durante um período de 72 horas.
Ensaio MTT
3 × 10
3 /poço de células SiHa ou HeLa foram semeadas em 96- bem placas e foram cultivadas com 0, 5 ou 10 uM 5-Aza. Ao longo de um período de 5 dias, o meio foi substituído a cada 24 h, e adicionou-se a mesma concentração de 5-aza. A 3- (4, 5-dimetiltiazol-3-il) -2, ensaio de 5-difenil tetrazólio (MTT) foi utilizado para avaliar a capacidade proliferativa das células SiHa e HeLa após o tratamento com 5-azacitidina de acordo com um protocolo padrão. A viabilidade celular foi medida pela absorvância a 490 nm.
Pacientes e amostras
Vinte e três amostras de tecido de cancro cervical, as amostras de tecido 23 e 17 pericarcinomatous correspondentes amostras de tecido cervical normal foram obtidos a partir do primeiro filiado Hospital de Xi’an Jiaotong University entre janeiro de 2014 e dezembro de 2014. Todos os pacientes foram diagnosticados por exame patológico e nenhum tinha recebido quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Cada paciente foi voluntária para este estudo de pesquisa e forneceu consentimento informado por escrito.
As amostras de câncer cervical foram coletadas a partir do centro dos tumores, enquanto que as amostras de tecidos pericarcinomatous originou 1,0 cm de distância do tecido canceroso. Dezessete amostras de colo normal foram obtidos a partir do colo uterino de pacientes que se submeteram a uma histerectomia total devido a doenças uterinas benignas. O tamanho médio de cada amostra foi de 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm. Depois de os tecidos foram dissecados, cada amostra foi lavada com PBS esterilizado e armazenado a -80 ° C. Todos os procedimentos foram realizados em gelo.
extracção do ADN, modificação com bissulfito e metilação específicas de PCR (MSP)
O ADN genómico foi isolado a partir de células e tecidos, utilizando um Kit Mini TaKaRa MELHOR Universal DNA genómico Extracção (Takara, China) de acordo com as instruções do fabricante. Um total de 500 ng do ADN extraído foi bissulfito-modificado com o kit EZ-metilação de ADN Gold ™ (Zymo Research, EUA). Os pares de iniciadores utilizados no MSP foram como se segue:
SALL3
: 5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3 ‘(para a frente), 5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′ (inverso) para a metilação e 5’-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3 ‘ (para a frente), 5’-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3 ‘(reverso) para unmethylation. Ambos os produtos de PCR eram 197 pb. Os programas termociclador foram como se segue: 95 ° C durante 10 minutos, e 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, a temperatura de emparelhamento para os pares de iniciadores metilados foi de 51 ° C, enquanto que para os pares de iniciadores não metilados foi de 50 ° C durante 30 segundos , e 72 ° C durante 30 segundos, seguido por uma incubação a 72 ° C durante 7 minutes.The produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 2%, corados com Gelview e visualizados sob iluminação ultravioleta. Cada reacção foi realizada em triplicado.
HPV-DNA teste
HPV-DNA de vinte e três amostras de tecido de cancro do colo do útero e do colo do útero dezassete amostras de tecido normais foram testados, por reacção em cadeia da polimerase (PCR) e hibridação flow-through. 21 genótipos de HPV foram testados qualitativamente por genotipagem de HPV kit de teste de acordo com o sistema da fosfatase alcalina (HybriBio, China), incluindo os tipos de alto risco de HPV-16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58 , 59 e 68, tipos de baixo risco de HPV-6,11,42,43,44 e tipos comuns na China HPV-53,66 e CP8304.
extração de RNA e quantitativa em tempo real PCR (Q- PCR)
o ARN total foi extraído a partir de células e tecidos utilizando Trizol Reagente (Life Technologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados para PCR em tempo real quantitativa são como se segue:
SALL3
: 5′-CAAAGCGAGCTCAGAAACAG-3 ‘(para a frente), 5′-CCTGATGCTCCAACTTCAAA-3’ (inverso);
GAPDH
:
5 ‘
-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′ (para a frente), 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘(reverso). As condições de reacção foram as seguintes: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos e 60 ° C durante 30 segundos. Utilizou-se o limiar de ciclo (CT) como o ponto representativo. A expressão relativa de
SALL3
mRNA em cada grupo (fold-mudança em comparação com o controle) foi calculada utilizando a fórmula: RQ = 2
– △△ Ct. Cada reação foi realizada em triplicado.
Análise Estatística
Todos os dados foram analisados com os dados 18.0.Consecutive versão SPSS foram analisados pelo teste de Wilcoxon, teste de Kruskal-Wallis H ou um- maneira análise ANOVA. Os dados categóricos foram comparadas pelo teste de Pearson Chi-Square. Todos os testes estatísticos foram de 2 faces, e as diferenças em que
p
. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
Detecção do estado de metilação nas regiões promotoras de
SALL3
em linhas celulares de cancro do colo do útero
metilação do DNA sempre ocorre em áreas que são ricos em ilhas CpG, como regiões promotoras. Uma causa comum de muitas doenças malignas é hipermetilação anormal ou hipometilação do promotor de ilhas de CpG, o que resulta na repressão da transcrição de muitos genes supressores de tumor ou a reactivação dos oncogenes. Foi utilizado o software online “MethPrimer” ao perfil uma ilha CpG na região que está localizada a partir -1859 a -54 pb a montante do ATG, o local de início da transcrição (TSS) no
SALL3
promotor (Fig 1A ). Um par de iniciadores foi desenhado para amplificar a região do promotor
SALL3
. Para identificar o estado de metilação da região em linhas celulares de cancro do colo do útero, utilizou-se-metilação específica de PCR (MSP) para determinar o
SALL3
estado de metilação do promotor em células SiHa, C33A e HeLa. Os resultados mostraram que esta região em células SiHa foi totalmente metilada, enquanto que esta região era completamente não metilada em C33A e parcialmente metilado em células HeLa (Fig 1B).
(A) Previsto ilhas de CpG da região promotora de
SALL3
. Os números indicam as posições de pb em relação ao local de início da transcrição. A região azul representa as ilhas CpG e as barras verticais vermelhas são os loci CpG nestas sequências de entrada. (B) Detecção de
SALL3
estado de metilação pelo MSP em SiHa, C33A e linhas de células HeLa. (M: metilado; U: não metilado)
5-azacitidina desmetila tratamento
SALL3 e região promotora e inverte a expressão de
SALL3
Na maioria dos casos, a metilação do ADN é um processo reversível. Para identificar se o estado de metilação na região promotora regula a expressão do nosso gene de interesse ao nível da transcrição, foi detectada a expressão de
SALL3
em linhas celulares em que o
SALL3
promotor é fortemente metilado (SiHa e HeLa) após o tratamento com 5-azacitidina (5-Aza), o que pode causar a desmetilação de ADN. Medimos a metilação por MSP em tempo real e Q-PCR. Os resultados mostraram que a intensidade de metilação do
SALL3
promotor em ambas as linhas celulares HeLa e SiHa diminuiu, enquanto que o unmethylation de
SALL3
aumentada gradualmente medida que a concentração de 5-aza aumentou (Fig 2). Além disso, descobrimos que a expressão de
SALL3
ARNm em células SiHa e HeLa aumentou significativamente de uma forma dependente da dose após a administração de 5-Aza (
P
0,05); o aumento na expressão que foi observado em células SiHa foi mais notável do que a observada em células HeLa (Tabela 1, Figura 3). Estes resultados sugerem que a expressão de
SALL3
foi revertida pela 5-Aza, que desmetilado o
SALL3
promotor e promovida a expressão do
SALL3
gene ao nível da transcrição .
(M: metilado; U: não metilado)..
(*
p Art 0,05)
a desmetilação do
SALL3
promotor poderia inibir a proliferação de células cancerosas cervicais
foi utilizado um ensaio de MTT para explorar se a capacidade de proliferação de células SiHa e HeLa foi efectuada pela
SALL3
metilação. Após o tratamento com 5-Aza, a viabilidade celular de ambas as células HeLa e SiHa foi enfraquecido de uma forma dependente da dose (
P
0,05) (Figura 4), que demonstrou que a desmetilação da
SALL3
na região do promotor pode melhorar a expressão de
SALL3
e levar a uma diminuição na capacidade de proliferação e de viabilidade das células das linhas de células do cancro do colo do útero HeLa e SiHa.
o
SALL3 e região promotora foi hipermetilado em tecidos de cancro cervical
Para confirmar ainda mais o estado de metilação da região promotora de
SALL3
em tecidos de cancro cervical, foi realizada MSP em 23 tecidos de câncer do colo do útero, 23 tecidos pericarcinomatous combinados e 17 tecidos cervicais normais. Como mostrado na Tabela 2, em tecidos de cancro do colo do útero, 15 foram metilados (65,21%) e 8 eram não metilado (34,78); em tecidos pericarcinomatous, 15 foram metilados (65,21%) e 8 eram não metilado (34,78%); em tecidos cervicais normais, 5 foram metilados (29,41%) e 12 eram não metilado (70,59%). A diferença entre os dois grupos foi significativa (
P
0,05) (Tabela 2), excepto que não se observou qualquer diferença significativa entre o cancro e tecidos pericarcinomatous (p 0,05). No entanto, o nível médio na escala de cinzentos era mais elevada nos tecidos cancerosos (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que o
SALL3
promotor foi hipermetilado em tecidos de câncer, que pode desempenhar um papel na carcinogênese do câncer cervical (Fig 5).
hipermetilação do
SALL3
promotor inibiu a expressão do gene ao nível da transcrição
Detectamos a expressão de
SALL3
mRNA nos 23 tecidos de cancro do colo do útero, 23 tecidos pericarcinomatous combinados e 17 tecidos cervicais normais em tempo real por Q-PCR. Comparado com o cérvix normal, a expressão relativa média de
SALL3
foi menor em tecidos de cancro do colo do útero (
P
0,05) e tecidos (pericarcinomatous
P
0,01 ), mas não houve diferença significativa entre os tecidos tumorais e tecidos pericarcinomatous (
p Art 0,05) (Fig 6A)
Estes dados são representados pela mediana com um intervalo interquartil (. *
p
. 0,05)
Além disso, nós separamos essas amostras em dois grupos. Um grupo consistia em tecidos onde a região promotora de
SALL3
foi metilada, e o outro composto dos tecidos onde essa região foi não metilado. A expressão relativa média de
SALL3
ARNm nos tecidos metilados foi menor do que nos tecidos não metilados (
P
0,05) (Fig 6B). Estes resultados demonstraram que hipermetilação do
SALL3
inibida
SALL3
expressão do gene ao nível da transcrição.
infecção por HPV de alto risco foi associado positivamente com hipermetilação do
SALL3
região promotora no cancro do colo do útero
Uma vez que a infecção por HPV de alto risco está envolvido na etiologia do câncer do colo do útero, exploramos ainda mais a relação entre a infecção pelo HPV e hipermetilação do
SALL3
promotor região em câncer cervical. Em tecidos de cancro do colo do útero, de 14 amostras de HPV-18 positivos foram metilados (77,78%), e 4 eram não metilado (22,22%); 1 de 5 amostras de HPV-negativo foi metilado (20,00%), e 4 eram não metilado (80,00%). Em tecidos normais do colo do útero, de duas amostras de HPV-6 positivos foram metilados (33,33%), e 4 eram não metilado (66,67%); 3 de 11 amostras de HPV-negativo foi metilado (27,27%), e 8 foram não metilado (72,73%). Os resultados estatísticos combinados foram apresentados na Tabela 3. A diferença entre estes dois grupos foi significativa (
P
0,05). Além disso, verificou-se uma relação positiva entre a infecção pelo HPV e hipermetilação da região promotora
SALL3
em tecidos colo uterino (p = 0,010, r = 0,408) (Tabela 3), que demonstraram que a infecção hr-HPV tem uma perto relevância com a metilação no
SALL3
regiões promotoras.
Além disso, a expressão relativa da
SALL3
mRNA nos tecidos HPV-positivos foi menor do que em os tecidos de HPV-negativa (Fig 7). Os resultados dos tipos de HPV de 40 amostras de tecido do cérvix foram mostrados na Tabela S1
Estes dados são representados pela mediana com uma gama interquartil (*
P
0,05)..
Discussão
em uma escala global, a taxa de incidência de contas de câncer cervical por 13% de todos os tumores malignos em mulheres e é em segundo somente ao câncer de mama [14, 15]. Embora HPV genital foi encontrado para ter uma estreita associação com a etiologia do câncer cervical, e apesar do uso generalizado de métodos de rastreio e vacinas [16], a incidência e taxa de mortalidade ainda são elevadas, especialmente nos países menos desenvolvidos [17-19 ]. Assim, a elucidação da patogênese do câncer do colo do útero é de grande importância.
Metilação
DNA é a forma mais comum de modificação epigenética e é essencial para vários processos de desenvolvimento através da sua regulação da expressão do gene, imprinting genômico e herança epigenética [20]. Estudos recentes têm mostrado que a metilação de ADN aberrante em regiões do promotor (e ilhas CG em particular) está intimamente relacionado com a génese de muitos cancros, porque uma redução na metilação do genoma ou a hipermetilação das regiões promotoras dos genes supressores do tumor afecta a expressão do gene [21, 22]. Como consequência, a metilação anormal de genes relacionados com o tumor tem um papel importante na carcinogénese [23]. A descoberta de marcadores de metilação específicas de diferentes cânceres poderiam ter um impacto profundo.
SALL3
é um membro da família SAL localiza na 18q23 [24], um gene essencial no desenvolvimento do corpo humano . Supressão de 18q23 causou perda de audição, problemas cardíacos, retardo mental, retardo do crescimento, deformidades dos membros e assim por diante [7, 24] .Para os últimos anos, os cientistas que visa a relevância entre a
expressão e carcinogênese SALL3
. Yu
et al
[25] tinha encontrado
SALL3
hipermetilado em regiões promotoras ricos em CG dinucleotídeo em linhas celulares de cancro da bexiga e tecidos, o que poderia ser um marcador de metilação do DNA romance na detecção de bexiga Câncer. Além do mais, os promotores de
SALL3
foram hipermetilado na linha de células H719 [26]. Além disso, Yang
et al
[27] descobriu que a hipermetilação do
SALL3
contribuiu para a diminuição da
SALL3
mRNA no HCC.
nosso estudo, nós exploramos a viabilidade da detecção de hipermetilado
SALL3
em regiões promotoras como método de triagem para o câncer cervical. Em linhas celulares de cancro do colo do útero SiHa e HeLa, dos quais foram ambas linhas de células positivas de HPV, foram metilados em
SALL3
regiões promotoras mas em C33A, uma linha celular negativa HPV,
SALL3
foi não metilado em a região do promotor. Enquanto isso, em tecidos de câncer do colo do útero, combinado tecidos pericarcinomatous e tecidos colo do útero normais, os resultados mostraram hipermetilação do
SALL3
no cancro do colo do útero e tecidos pericarcinomatous comparação com em tecidos normais do colo do útero (
p Art 0,05 ) .O nosso resultado foi consistente com Shikauchi
et al
[8] e Yang
et al
[27].
Tomado estes juntos, a infecção de HPV pode participar o mecanismo de
SALL3
carcinogénese relacionada com a metilação. HPV de alto risco (hrHPV) imortalização induzida e transformação maligna são acompanhados por metilação do DNA de genes do hospedeiro. Schütze
et al [28] verificaram que imortalização induzida pelo HPV foi associada com um aumento sequencial e progressiva na metilação do promotor de um subconjunto de genes incluindo, hTERT, mir124-2, PRDM14 e assim por diante, que foi principalmente independente da capacidade de imortalizao viral. Em nosso estudo, surpreendentemente, por meio da análise da relação entre a infecção pelo HPV e
SALL3
estado de metilação em tecidos colo do útero, os resultados demonstraram que a hipermetilação genômica e menor expressão de mRNA em nível de transcrição da
SALL3
em tecidos de câncer cervical HPV-positivos, quando comparado com em tecidos HPV-negativos (
p Art 0,05) e infecção hr-HPV associados positivamente com hipermetilação do
SALL3 e região promotora (
p Art 0,05, r = 0,408), que era consistente com Schütze e nosso estudo anterior sobre linhas celulares de cancro do colo do útero, trazendo-nos novas evidências de que a infecção pelo HPV que tenham participado na carcinogênese do câncer cervical. No entanto, em nosso estudo, a ordem dos dois eventos-hr HPV infecção e
SALL3
metilação ocorreu e se eles tinham interacção directa (E6 /E7 ou outro loci) ainda permanece desconhecido. Nós vamos continuar a procurar o mecanismo de carcinogênese induzida pela infecção pelo HPV e metilação do DNA nas seguintes pesquisas.
A fim de comprovar a relação entre metilação e expressão do gene, nós tratados SiHa e HeLa, que foram fortemente
SALL3
metilado na região promotora, com 5-azacitidina, um agente poderia desempenhar um papel na desmetilação de ADN em grande escala do genoma. Os resultados sugerem que, quando a concentração de 5-aza elevada geralmente, o nível de metilação de
SALL3
deixados assim como a expressão não metilado aumentou significativamente em SiHa e HeLa (
P
0,05 ). Ao mesmo tempo, a expressão relativa de mRNA de
SALL3
em SiHa e HeLa também aumentar eo aumento da medida em
SALL3
linha de células totalmente metilado SiHa foi mais notável do que em HeLa, o
SALL3
linha celular parcial metilado, que sugeriu que a desmetilação do
SALL3
poderia efetivamente inverter a sua expressão em nível de transcrição. Em seguida, o ensaio de MTT mostraram que, após tratamento com 5-Aza, a viabilidade celular e a proliferação de células HeLa e SiHa significativamente enfraquecida que ilustra uma função inibidora de cancro de
SALL3
em células de cancro do colo do útero. Em amostras de tecidos, os resultados Q-PCR sugeriram que a expressão de ARNm de
SALL3
foi mais elevada no cancro e tecidos pericarcinomatous do que em tecidos normais do colo do útero (
P
0,05), que dividiu o semelhante ideia com estudos anteriores [27]. Além disso, a análise estatística da expressão de ARNm entre os tecidos metilados e não metilados revelou que em
SALL3
tecidos metilados, o ARNm de
SALL3
foi maior do que em tecidos não metilados (
P
. 0,05) .Taken em conjunto, os resultados demonstraram
SALL3
hipermetilação contribuiu para a diminuição da regulação da expressão gênica em nível de transcrição no cancro do colo do útero
em conclusão, nossa pesquisa demonstrou pela primeira vez que o promotor de
SALL3
foi de hipermetilação, e devido a este mecanismo regulado negativamente a expressão de mRNA e acelerou o crescimento de células em tecidos de câncer cervical e linhas celulares. infecção por HPV de alto risco como uma etiologia do câncer cervical participou
SALL3
metilação. Esse estado de metilação aberrante em toda a escala do genoma inativado sua função como um supressor tumoral e contribuiu para a carcinogênese do câncer cervical.
Informações de Apoio
Tabela S1. HPV tipos de amostras de tecido de 40 colo
doi: 10.1371. /journal.pone.0145700.s001
(DOCX)
Reconhecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por uma Ciência Natural Nacional Fundação da China (No.81472428).