Abstract

Compreender a resposta à droga heterogêneo de pacientes com câncer é essencial para oncologia precisão. análises genômicas pioneiros de subtipos de câncer individuais começaram a identificar os principais determinantes de resistência, incluindo up-regulação da resistência a múltiplas drogas genes (MDR) e alterações mutacionais de alvos de drogas. No entanto, estas alterações são suficientes para explicar apenas uma minoria da população, e mecanismos adicionais de resistência à droga ou sensibilidade são necessários para explicar o espectro remanescente de respostas do paciente para, finalmente, atingir o objectivo da oncologia precisão. Nossa hipótese é que uma análise pan-câncer do

in vitro

sensibilidade às drogas em todo inúmeras linhagens de câncer irá melhorar a detecção de associações estatísticas e produzir mais robusto e, mais importante, determinantes recorrentes de resposta. Neste estudo, foi desenvolvido um quadro estatístico com base na meta-análise de perfis de expressão para identificar marcadores e mecanismos de resposta à droga pan-cancerosas. Usando a linha de células do cancro do Encyclopaedia (LECC), um grande painel de várias centenas de linhas celulares de cancro de inúmeras linhagens distintas, caracteriza ambos os mecanismos conhecidos e novos de resposta a fármacos citotóxicos, incluindo inibidores da topoisomerase 1 (TOP1; topotecano, irinotecano) e direcionados terapias, incluindo inibidores de histona desacetilases (HDAC; panobinostat) e MAP /quinases ERK (MEK; PD-0325901, AZD6244). Notavelmente, a nossa análise implicada reduzida e taxas de replicação de transcrição, assim como a deficiência em genes de reparação de danos no DNA de resistência a inibidores de TOP1. A activação constitutiva de várias vias de sinalização, incluindo o interferon /STAT-1 foi implicada na via de resistência ao inibidor da pan-HDAC. Finalmente, um número de desregulações a montante de MEK foram identificados como mecanismos compensatórios da resistência aos inibidores de MEK. Em comparação com estratégias de análise alternativa pan-câncer, nossa abordagem pode elucidar melhor os mecanismos de resposta de drogas relevantes. Além disso, o compêndio de marcadores putativos e mecanismos identificados através de nossa análise pode servir como uma base para futuros estudos sobre estas drogas

Citation:. Wang K, Shrestha R, Wyatt AW, Reddy A, Lehár J, Wang Y , et ai. (2014) Uma abordagem meta-análise para a caracterização Pan-CANCER Mecanismos de sensibilidade às drogas em linhagens celulares. PLoS ONE 9 (7): e103050. doi: 10.1371 /journal.pone.0103050

editor: Caterina Cinti, Instituto de Fisiologia Clínica, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Itália |

Recebido: 07 de maio de 2014; Aceito: 30 de maio de 2014; Publicação: 18 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os arquivos CEL estão disponíveis a partir GEO (GSE36139)

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. Os co-autores AR e JL são funcionários da Novartis Pharmaceuticals . Isto não altera ‘adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Durante a última década, o tratamento do câncer tem visto uma mudança gradual para’ os autores medicina precisão ‘e fazendo decisões terapêuticas racionais para o câncer de um paciente com base em seu perfil molecular distinta. No entanto, a ampla adoção desta estratégia tem sido dificultada por uma compreensão incompleta para os determinantes que impulsionam a resposta do tumor a diferentes medicamentos contra o câncer. diferenças intrínsecas na sensibilidade ao fármaco ou a resistência foram previamente atribuída a uma série de aberrações moleculares. Por exemplo, a expressão constitutiva de quase quatrocentos resistência a múltiplas drogas (MDR) de genes, tais como ATP-ligação cassete transportadores, pode conferir resistência a drogas em cancro universal [1]. Do mesmo modo, as mutações em genes do cancro (tais como EGFR) que são selectivamente orientados por inibidores de moléculas pequenas podem aumentar ou perturbar a ligação da droga e, assim, modular a resposta à droga do cancro [2]. Apesar destes resultados, a tradução clínica de inibidores de MDR foram complicados por interações farmacocinéticas adversos [3]. De igual modo, a presença de mutações em genes alvo só pode explicar a resposta observada numa fracção da população, que também limita a sua utilidade clínica. Como exemplo deste último, cancros do pulmão inicialmente sensíveis ao EGFR resistência inibição adquirem que pode ser explicado por mutações EGFR em apenas metade dos casos. Outros eventos moleculares, tais como amplificações MET proto-oncogene, têm sido associados com resistência aos inibidores de EGFR em 20% dos cancros do pulmão, independentemente, de mutações de EGFR [4]. Portanto, ainda há uma necessidade de descobrir mecanismos adicionais que podem influenciar a resposta aos tratamentos de câncer.

Historicamente, gene profiling de expressão

in vitro

modelos têm desempenhado um papel essencial na investigação de determinantes subjacentes de drogas resposta [5] – [8]. Especificamente, painéis de linhas celulares compilados para tipos de câncer individuais têm ajudado a identificar marcadores preditivos de respostas de drogas de linhagem específica, tais como associar P27 (KIP1), com resistência Trastuzumab no câncer de mama e ligando genes de transição epitelial-mesenquimal a resistência a inibidores do EGFR em cancros do pulmão [9] – [11]. No entanto, a aplicação desta estratégia tem sido limitada a um punhado de tipos de câncer (por exemplo, mama, pulmão) com um número suficiente de modelos de linhas celulares estabelecidas para alcançar o poder estatístico necessário para novas descobertas.

Estudos recentes abordou o problema de tamanhos de amostra limitada por investigar

in vitro

sensibilidade às drogas de uma maneira pan-câncer, através de painéis de linhas de células grandes que combinam vários tipos de câncer selecionados para as mesmas drogas [7], [8], [12], [13]. Desta forma, a análise pan-cancro pode melhorar o ensaio para associações estatísticas e ajudar a identificar genes ou vias desreguladas oncogénicas que recorrentemente promovem o crescimento e sobrevivência dos tumores de origens diversas [14], [15]. A abordagem comum usado para a análise pan-câncer diretamente piscinas amostras de diversos tipos de câncer; no entanto, isso tem duas grandes desvantagens. Em primeiro lugar, quando as amostras são considerados coletivamente, Gene significativa associações de resposta expressão de drogas presentes em menores linhagens de câncer de tamanho pode ser obscurecida pela falta de associações presentes em linhagens de maior porte. Em segundo lugar, a gama de expressões de genes e valores farmacodinâmica de drogas são frequentemente e incomparável entre diferentes linhagens de cancro (Figura 1A) de linhagem específica. Coletivamente, essas questões reduzir o potencial para detectar associações significativas comuns em várias linhagens de câncer.

(A) Esquema demonstrando uma grande desvantagem da abordagem do câncer de pool comumente usado (PC-Pool), ou seja, que a expressão do gene e perfis farmacológicos de amostras de diferentes linhagens de câncer muitas vezes são incomparáveis ​​e, portanto, inadequado para a agregação em uma única análise. (B) Fluxo de trabalho que descreve a nossa abordagem PC-Meta. Em primeiro lugar, cada linhagem câncer no conjunto de dados pan-câncer é avaliado independentemente de correlações de resposta expressão gênica de drogas em ambos os sentidos positivos e negativos (etapa 2). Em seguida, um método de meta-análise é utilizada para agregar os resultados da correlação de linhagem específica e para determinar pan-cancerosas expressão correlações de resposta. O significado destas correlações é indicada por valores de p-teste múltiplo de corrigidos (meta-FDR; Passo 3). Em seguida, os genes que se correlacionam significativamente com a resposta de drogas em várias linhagens de câncer são identificados como marcadores de genes pan-câncer (meta-FDR 0,01; Passo 4). Finalmente, vias biológicas significativamente enriquecidas no conjunto de marcadores de genes descobertos pan-cancerosas são identificados como mecanismos pan-cancerosas de resposta (PI Índice de 1,0; Passo 5). Um subconjunto dos marcadores pan-cancerosas correlacionados com a resposta à droga em linhagens de cancro individuais são seleccionados como marcadores de linhagem específica. Os níveis de envolvimento de mecanismos pan-cancerosas em linhagens de câncer individuais são calculados a partir da análise de enriquecimento via destes marcadores de linhagem específica.

Para enfrentar os problemas introduzidos através da partilha directa de dados, foi desenvolvido um quadro estatístico com base na meta-análise chamado de “PC-meta”. Meta-PC identifica os marcadores e os mecanismos da resposta à droga pan-cancro por meio de testes para o gene de resposta expressão associações de drogas em cada linhagem cancro individualmente e combinando os resultados de cada linhagem. Estudos anteriores têm aplicado com sucesso meta-análises para combinar conjuntos de dados genômicos incompatíveis para um único tipo de câncer, e para combinar conjuntos de dados de diferentes tipos de câncer para identificar mecanismos comuns de início e progressão [16] câncer – [18]. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para alavancar meta-análise para a identificação de intrínsecos determinantes pan-cancerosas de resposta a terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Linha Cancer Cell Encyclopaedia (LECC ) dataset

O conjunto de dados pan-câncer LECC utilizado neste estudo abrange 1046 linhas celulares de cancro derivadas de 24 tipos de câncer e blindados para a sensibilidade farmacológica a 24 compostos anti-cancro [8]. Os dados de expressão e sensibilidade a drogas gene pré-processados ​​foram obtidas diretamente a partir do projeto LECC (https://www.broadinstitute.org/ccle/home; GSE36139). As linhas celulares foram perfilado antes do tratamento para a expressão de genes usando a matriz Affymetrix U133plus2.0, e para mutações em 33 genes do cancro conhecidos por genotipagem de espectrometria de massa (OncoMap). concentração inibitória 50 valores (IC50) extrapolados no estudo original a partir de dados de dose-resposta foram utilizados como parâmetro de eficácia da droga.

-análise Meta Abordagem para Análise Pan-Cancer

Nosso PC-Meta abordagem para a identificação de marcadores e mecanismos de resposta à droga pan-cancro é ilustrado na Figura 1B. Inicialmente, cada linhagem câncer no conjunto de dados pan-câncer foi tratado como um conjunto de dados distintos e avaliado de forma independente para as associações entre os níveis de expressão do gene de referência e valores de resposta de drogas. Estas correlações expressão de resposta específica da linhagem foram calculados utilizando o teste de correlação de Spearman. Linhagens que apresentaram o mínimo valor de sensibilidade de drogas diferencial (tendo menos de três amostras ou um log

10 (IC50) gama inferior a 0,5) foram excluídos da análise.

Em seguida, os resultados do indivíduo linhagem específica análises de correlação foram combinados usando meta-análise para determinar pan-cancerosas associações expressão de resposta. Utilizou-se o método de Pearson [19], um método de Fisher de uma cauda de meta-análise. método de Fisher é uma técnica padrão que agrega vários valores de p em um único valor de P-meta meta onde um pequeno valor P indica correlação expressão-resposta significativa em uma ou mais linhagens de cancro. O método de Pearson pode reduzir falsas associações resultantes de indicações conflitantes de correlação em diferentes linhagens. Combina valores p linhagem individuais para correlações positivas e negativas separadamente e retorna o mais significativo dos dois valores combinados (meta P

+ e meta P

-) como o meta P-valor final (meta P *) . A partir deste, um valor múltiplo-teste corrigido meta P-valor (meta-FDR) foi calculada usando o método de Hochberg-Benjamini (BH). Para cada fármaco, os genes com os meta-FDR 0,01 foram considerados marcadores pan-cancerosas de resposta

Em seguida, mecanismos pan-cancerosas de resposta foram revelados através da realização de análise de via enriquecimento nos marcadores pan-cancerosas utilizando descobertos. o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity Systems, Inc., Redwood City, CA). A sobre-representação estatística das vias IPA canônicos foi calculada utilizando o teste exacto e método de correção de múltiplas teste BH de Fischer. A ‘comprometimento das vias (PI) score’ foi calculado para cada via como o

10 (valor-p enriquecimento via BH-corrigida) -log. Pathways com pontuação PI . 1.0 foram consideradas significativamente associados com a resposta à droga

Finalmente, uma vez que os marcadores pan-cancerosas podem ser relevantes em apenas um subconjunto de linhagens de câncer, foram definidos conjuntos de genes associados com a resposta em cada linhagem como marcadores de linhagem específica. marcadores de linhagem específica foram derivados como o subconjunto de marcadores pan-cancerosas que significativamente correlacionada com a resposta em uma determinada linhagem (teste de correlação de postos valor de p 0,05 e | coeficiente de correlação de Spearman | 0,3). Uma vez que os mecanismos de pan-cancerosas podem similarmente ser envolvido em apenas um subconjunto de linhagens de cancro, o seu envolvimento em cada linhagem foi delineada por meio da análise de enriquecimento via de genes marcadores de linhagem específica, tal como descrito acima.

abordagens alternativas para o pan Análise cancro

Foram avaliados PC-Meta contra duas abordagens alternativas comumente usados ​​em estudos anteriores para a identificação de marcadores e mecanismos pan-cancerosas. Um deles, que nós chamado de “PC-Pool ‘, identifica marcadores pan-cancerosas como genes que se correlacionam com a resposta de drogas em um conjunto de dados combinada de múltiplas linhagens de câncer [8], [12]. A significância estatística foi determinada com base no mesmo teste estatístico de correlação de postos de Spearman com BH correcção de testes múltiplos (valores de p 0,01 e | rho de Spearman, r

s | 0,3). mecanismos pan-cancerosas foram revelados através da realização de análise de enriquecimento via nesses marcadores pan-cancerosas.

A segunda abordagem alternativa, que nós chamado de “PC-União”, ingenuamente identifica marcadores pan-cancerosas como a união de resposta- genes associados detectadas em cada linhagem cancro [20]. marcadores associados a resposta em cada linhagem foram também identificados por meio do teste de correlação de Spearman com BH correcção de testes múltiplos (valores de p 0,01 e | r

s | 0,3). mecanismos pan-cancerosas foram revelados através da realização de análise de enriquecimento via no set coletiva de marcadores associados a resposta identificadas em todas as linhagens.

Resultados e Discussão

Estratégia de Análise Pan-Cancer

Nós desenvolvemos PC-Meta, uma estratégia de análise pan-câncer duas fases, para investigar os determinantes moleculares da resposta à droga (Figura 1B). Resumidamente, na primeira etapa, PC-Meta avalia as correlações entre os níveis de expressão de genes com os valores da resposta à droga em todas as linhagens de cancro independentemente e combina os resultados de uma forma estatística. Um valor meta-FDR calculado para cada gene é utilizado para identificar genes que são recorrentemente associados com a resposta em vários tipos de câncer e, portanto, são potenciais marcadores pan-cancerosas. Na segunda etapa, os genes marcadores pan-cancro são mapeados para vias de sinalização celular para elucidar os mecanismos envolvidos pan-cancro em resposta à droga. Para testar a nossa abordagem, aplicamos PC-Meta ao conjunto de dados LECC, um painel de linha celular pan-câncer grande que tem sido extensivamente examinado para sensibilidade farmacológica de inúmeros medicamentos contra o câncer. PC-Meta foi avaliado contra duas estratégias de análise pan-cancerosas comumente usados, que nós denominado “PC-Pool” e “PC-União”. PC-Pool identifica marcadores pan-cancerosas como genes que estão associadas com a resposta à droga em um conjunto de dados agrupados de linhagens de cancro. PC-Union, uma abordagem simplista para meta-análise (não baseado em medidas estatísticas), identifica marcadores pan-cancerosas como a união de genes correlacionados-resposta detectadas em cada linhagem câncer. Detalhes adicionais de PC-Meta, PC-Pool, e PC-União são fornecidos na secção de Métodos.

Seleção LECC compostos adequados para Análise Pan-Cancer

24 compostos disponíveis a partir do recurso LECC foram avaliados para determinar a sua adequabilidade para análise pan-cancro. Durante oito compostos, nenhum dos métodos de análise pan-câncer voltou marcadores suficientes (mais de 10 genes) para acompanhamento e, portanto, foram excluídos da análise subsequente (Tabela S1). A falha a identificação de marcadores para estas drogas podem ser atribuídos a uma triagem incompleta composto (isto é executada num pequeno número de linhagens de cancro) tal como com nutlin-3, ou o cancro tipo especificidade de compostos tais como com erlotinib, que é mais eficaz em cancros do pulmão de células não-pequenas viciado-EGFR (Figura S1). Sete compostos adicionais, incluindo o L-685,458 e sorafenib, apresentaram fenótipos resposta dinâmica em apenas uma ou duas linhagens e também foram considerados inadequados para a análise pan-cancro (Figura 2; Figura S1). Mesmo que a estratégia de PC-Pool identificados numerosos marcadores de genes associados com a resposta a estas sete compostos, perto inspeção desses marcadores indicaram que muitos deles realmente correspondia a diferenças moleculares entre as linhagens em vez de determinantes relevantes da resposta à droga. Por exemplo, L-685458, um inibidor da actividade γ-secretase AβPP, apresentaram sensibilidade variável em linhas celulares de cancro hematopoiéticas e principalmente resistência em todas as outras linhagens de cancro. Como resultado, as identificadas 815 genes marcadores foram predominantemente enriquecido para as funções biológicas hematopoiéticas relacionadas com o desenvolvimento do sistema e a Resposta Imunológica (Tabela S2). Isso destaca as limitações de partilha directamente dados de linhagens de câncer distintas. Dos restantes nove compostos, nós nos concentramos em cinco drogas que pertenciam a classes distintas de inibidores (segmentação TOP1, HDAC, e MEK) e exibiram uma ampla gama de respostas em múltiplas linhagens de câncer (Figura 2, Tabela 1).

Boxplots indicar a distribuição de valores de sensibilidade aos fármacos (based on IC50) em cada linhagem de cancro para cada droga de cancro. Por exemplo, a maioria das linhagens de câncer são resistentes a L-685,458 (com IC50 cerca de 10

-5 M), exceto para os cancros hematopoiéticos (IC50 de 10

-5 a 10

-8 M). O número de amostras em uma linhagem de câncer selecionados para a resposta à droga é mostrado sob o boxplot correspondente. Compostos indicados no texto azul exibiu uma ampla gama de respostas em múltiplas linhagens de câncer e foram selecionados para análise neste estudo, enquanto que os compostos indicados no texto vermelho são exemplos de compostos excluídos da análise. abreviaturas câncer de linhagem – AU: autonômicos; BO: óssea; BR: mama; NC: sistema nervoso central; EN: endometrial; HE: hematopoiética /linfóide; KI: renal; LA: intestino grosso; LI: fígado; LU: pulmão; OE: esófago; OV: ovário; PA: pâncreas; PL: pleura; SK: pele; SO: tecidos moles; ST: estômago; TH: tireóide; UP: digestiva alta; UR: urinária

Intrínseca Determinantes da resposta a TOP1 Inibidores (topotecano e irinotecano)

O topotecano e irinotecano são quimioterapias citotóxicas que inibem a enzima TOP1. Eles interrompem os processos de replicação e transcrição normais para induzir danos ao DNA e apoptose em células que se dividem rapidamente. Resistência à inibição TOP1 pode ocorrer como resultado de mutações em TOP1 ou em células não submetidas a replicação de ADN; que, hipersensibilidade podem surgir devido a deficiências no ponto de verificação e de reparação do ADN caminhos [21].

No painel LECC, estes dois inibidores TOP1 mostrou efeitos farmacológicos em grande parte similares, com base em valores de IC50 (Figura 2). Aplicou-se o PC-meta em relação a cada conjunto de dados de drogas e identificou 757 e 211 marcadores pan-cancerosas do gene associado com a resposta ao topotecano e irinotecano, respectivamente (Tabela 1; Tabela S5). O número discordantes dos marcadores identificados para estas duas drogas pode ter resultado de diferenças em ações de drogas ou o número diferente de linhas celulares selecionados para cada droga – 480 para topotecano e 303 para o irinotecano. No entanto, 134 dos 211 (63,5%) marcadores de genes identificados para irinotecano ainda sobreposto com aqueles identificados para topotecano e estão provavelmente associados à mecanismos gerais de inibição TOP1 (Tabela 1).

Dos 134 genes comuns identificado para as duas drogas por PC-Meta (Tabela S3), muitos estão altamente correlacionados com a resposta (com base em valores-meta FDR) e possuem funções conhecidas que podem afectar a citotoxicidade dos inibidores de TOP1. Por exemplo, o gene marcador de topo membro da família Schlafen 11 (SLFN11) mostraram um aumento da expressão em linhas de células sensíveis a ambos topotecano e irinotecano em dez linhagens de cancro individuais (Figura 3A). Esta tendência significativa (meta-FDR = 6,4 × 10

-18 para topotecano e 1,9 × 10

-10 para irinotecano, ver Métodos) concorda com estudos recentes que delineiam o papel da SLFN11 na sensibilização de células cancerosas aos agentes que danificam o ADN pelo aplicação de paragem do ciclo celular e indução de apoptose [8], [22]. Outro marcador superior, caixa de grupo de alta mobilidade 2 (HMGB2), é um mediador da resposta ao estresse genotóxico e mostrou reduzida expressão em linhas de células resistentes aos inibidores da TOP1 em múltiplas linhagens (Figura 3B; meta-FDR = 1,7 × 10

– 07 de topotecano e 3,7 × 10

-03 para irinotecano). Isto coincide com descobertas anteriores que mostram que ab-rogados resultados de expressão HMGB2 na resistência a danos no DNA induzidos por quimioterapia [23]. Da mesma forma, a BCL2-Associated Transcription Factor de 1 (BCLAF1), um regulador de apoptose e reparação de ADN de cadeia dupla, foi também sub-regulada em linhas de células resistentes a fármacos (meta-FDR = 4,8 × 10

-04 do topotecano e 1,9 × 10

-03 para irinotecano), o que é concordante com a sua supressão observado anteriormente em linhas celulares intrinsecamente radioresistentes [24].

gráficos de dispersão mostram correlação entre a expressão de genes e valores resposta farmacológica em várias linhagens de câncer , onde a regulação positiva de SLFN11 e HMGB2 correlacionam com sensibilidade às drogas (indicado por valores IC50 menores).

Para investigar mecanismos pan-cancerosas variações em resposta topotecano subjacentes, mapeamos todo o conjunto de pan- marcadores do gene do cancro identificados pelo PC-Meta em vias de sinalização celular correspondentes (através da análise de enriquecimento via IPA). Cada caminho foi atribuído um “comprometimento das vias (PI) score ‘definido como -log

10 do valor-p enriquecimento via, e caminhos com pontuação PI = 1 foram considerados como tendo influência significativa na resposta. No conjunto de dados topotecano, PC-Meta detectado 15 vias pan-cancerígenas relevantes para a resposta à droga (PI pontuação = 1.3-6.6), com os caminhos mais significativos relacionados com a regulação do ciclo celular e reparação de danos ao DNA (Figura 4A; Tabela 2). Em contraste, a mesma análise enriquecimento rendeu apenas 3 vias significativamente enriquecido para marcadores PC-piscina e não as vias significativas para marcadores PC-Union. Claramente, a identificação dos caminhos mais significativos por PC-Meta pode ser atribuído ao aumento da potência da nossa abordagem para identificar marcadores de genes potencialmente relevantes adicionais em comparação com PC-Pool e PC-União (757 vs 474 e 61, respectivamente; Tabela 1) .

(a) vias Pan-cancerosas com envolvimento significativo na resposta à droga detectada pelo PC-Meta, PC-Pool, PC-União aproxima-se (à esquerda). Estas vias podem ser agrupados em seis processos biológicos (que se distinguem pela cor de fundo), que convergem para dois mecanismos distintos. O nível de envolvimento destas vias pan-cancerosas previstos por diferentes abordagens é ilustrada com barras horizontais azuis. comprometimento das vias em cada linhagem de câncer previsto por PC-Meta é indicado pela intensidade de preenchimentos vermelhas na tabela correspondente (à direita). pontuações comprometimento das vias de linhagem específica (PI) Pan-câncer e são derivados de análises de enriquecimento de percurso e calculado como -log

10 (valores de p BH-ajustadas). Apenas os caminhos com pontuação PI 1.3 são mostrados. abreviaturas câncer de linhagem – AU: autonômicos; BO: óssea; BR: mama; NC: sistema nervoso central; EN: endometrial; HE: hematopoiético /linfóide; KI: renal; LA: intestino grosso; LI: fígado; LU: pulmão; OE: esófago; OV: ovário; PA: pâncreas; PL: pleura; SK: pele; SO: tecidos moles; ST: estômago; TH: tireóide; UP: digestiva alta; UR: urinário (B) Previsto conhecidos e novos mecanismos de resposta intrínseca à inibição TOP1. Red- e verde-fill indicar aumento e diminuição da atividade em linhas de células resistentes aos medicamentos, respectivamente. (C) Mapa de calor que mostra a expressão de genes do ciclo celular, a síntese de nucleótidos, e vias de reparação de danos no DNA correlaciona com a resposta topotecano em múltiplas linhagens de cancro.

As vias detectados por PC-Meta convergiram para dois mecanismos principais que podem influenciar a resposta quimioterapia: a taxa de crescimento celular e da instabilidade cromossómica (Figura 4A-B). Todos os genes que participam no controlo do ciclo celular, a transcrição de ADN, tradução de ARN, e processos de síntese de nucleótidos foram regulados negativamente em linhas de células resistentes à quimioterapia-, o que sugeria uma cinética de crescimento mais lento como um mecanismo de resistência. A maioria dos genes envolvidos no DNA reparação de danos e regulação checkpoint do ciclo celular também foram regulados negativamente em linhas de células resistentes. Isto pode parecer contra-intuitivo porque, tipicamente vias de reparação de mitigar a morte celular induzida por dano de DNA (como a causada pelos inibidores de TOP1). No entanto, alguns dos seus genes componente (como RAD51, BRCA2, e os genes CPNF-família) também são reguladores-chave da estabilidade genómica e a sua perturbação pode reflectir um fenótipo de instabilidade do genoma que é inerentemente resistente ao stress genotóxico de quimioterapia [25], [ ,,,0],26]. Na verdade, nosso achado concorda com uma assinatura gene de reparo de DNA informou recentemente que foi preditiva de ambos supressão de reparação homóloga contribuindo para a instabilidade do genoma, bem como a sensibilidade à quimioterapia em estudos de pacientes [27]. análise de enriquecimento executadas no conjunto marcador irinotecano revelou vias desreguladas semelhantes relacionados ao controle do ciclo celular e reparação de danos ao DNA (Tabela S6). Isto sugere que estes dois mecanismos são geralmente importantes para a gestão de inibição TOP1.

Desde vias de resposta ao fármaco recorrentes podem estar envolvidos em apenas um subconjunto de tipos de câncer, que teve como objetivo delinear a extensão de seus papéis em cada linhagem câncer. Um subconjunto dos marcadores pan-cancerosas significativamente correlacionados com a resposta em cada tipo de cancro foram seleccionados como “marcadores específicos de linhagem. Em seguida, cada conjunto de marcadores específicos da linhagem foi avaliada para o enriquecimento de calcular a pontuação PI para cada percurso pan-câncer em cada linhagem. Curiosamente, as vias pan-cancerosas relevantes para resposta Topotecano exibiu diferenças óbvias de linhagem específica (Figura 4A). resposta intrínseca em cancros do intestino urinário, ovário e grandes apareceram proeminentemente influenciado através de vários mecanismos, incluindo a regulação do ciclo celular, síntese de nucleotídeos, e as vias de reparo de DNA (Figura 4C), enquanto a resposta em cancros do sistema nervoso central de sinalização eIF2 principalmente envolvida. Um terço das linhagens cancerosas não foram caracterizados por quaisquer mecanismos de resposta pan-cancerosas. Linhagens sem pontuação PI significativas em geral tinham menos marcadores de linhagem específica detectados (Figura 4A), mas não em todos os casos – óssea e câncer de endométrio teve um número semelhante de marcadores para os cancros do intestino urinário e grandes, duas linhagens com os escores PI mais significativos.

intrínseca Determinantes da resposta a HDAC inibidor (panobinostat)

panobinostat (LBH-589) é um inibidor da deacetilase pan-histona (HDAC), que faz com que o hiperacetilação de proteínas histonas e não-histonas . Isso desencadeia uma pluralidade de mecanismos de anti-cancro por meio de ambos os processos de transcrição e pós-tradução, incluindo a activação de vias apoptóticas e a degradação de proteínas oncogénicas cliente HSP90 [28]. A resistência à inibição de HDAC tem sido associada a numerosos mecanismos incluindo a expressão forçada de proteínas anti-apoptóticas, a activação de MAPK /PI3K /STAT3 vias de sinalização, e a activação de NF-kB via [28].

Aplicação do PC- meta-análise identificou 542 genes marcadores pan-cancerosas associadas com a resposta intrínseca à panobinostat (Tabela 1; Tabela S5). Um dos melhores marcadores identificados por PC-Meta foi a histona acetiltransferase (HAT) enzima EP300, que antagoniza HDACs. Ele tinha reduzido expressão em linhas de células resistentes aos medicamentos em cinco linhagens de câncer (Figura 5a; meta-FDR = 8,9 × 10-3). Em estudos anteriores, a expressão inferior EP300 foi mostrada para aumentar a influência de HDAC e atenuar os efeitos de inibição de HDAC [28]. Outro marcador interessante topo pan-câncer gene, PEA-15, tem a função anti-apoptótica e foi regulada nas linhas de células resistentes de sete linhagens de câncer (Figura 5B; meta-FDR = 2,7 × 10-5). Dado que PEA-15 sobre-expressão pode suprimir a morte celular FAS /mediada por TNFa, pode neutralizar os efeitos dos inibidores de HDAC na via apoptótica extrínseca [28], [29].

gráficos de dispersão mostrou correlação entre a expressão do gene e valores resposta farmacológica em diversas linhagens de câncer, onde a infra-regulação da EP300 e aumento da regulação do PEA15 se correlacionam com a resistência aos medicamentos (indicado por maiores valores de IC50).

para investigar mecanismos pan-cancerosas de resposta a panobinostat, aplicou-se a análise de enriquecimento caminho para o conjunto de marcadores de genes pan-cancerosas PC-Meta. Isto revelou 20 vias significativamente associados com a resposta com pontuações PI variando 1,0-4,0 (Figura 6A; Tabela 2). Em contraste, a análise de enriquecimento com base em marcadores de genes derivados de PC-Pool e PC-União identificou apenas 6 e 8, respectivamente, vias, embora a abordagem PC-Pool fornecida número maior de marcadores do gene do que o PC-Meta (723 vs 542). As pontuações PI para vias comumente detectados (por exemplo hepática Stellate activação de células) foram significativamente maiores para marcadores de genes derivados por PC-Meta em comparação com os dois métodos alternativos de análise pan-cancerosas. Semelhante a nossas conclusões para os inibidores TOP1, PC-Meta desempenho melhor do que abordagens alternativas na identificação de vias potencialmente envolvidos na resposta a panobinostat.

(A) vias Pan-cancerosas com envolvimento significativo na resposta à droga detectada por PC- meta, PC-Pool, PC-União abordagens (à esquerda). O nível de envolvimento previsto destas vias pan-cancerosas de diferentes abordagens é ilustrada com barras horizontais azuis (no meio). O envolvimento destas vias pan-cancerosas em cada linhagem de câncer previsto por PC-Meta é indicado pela intensidade de preenchimentos vermelhas na tabela correspondente (à direita). pontuações comprometimento das vias de linhagem específica (PI) Pan-câncer e são derivados de análises de enriquecimento de percurso e calculado como -log

10 (valores de p BH-ajustadas). Apenas os caminhos com pontuação PI 1.3 são mostrados. abreviaturas câncer de linhagem – AU: autonômicos; BO: óssea; BR: mama; NC: sistema nervoso central; EN: endometrial; HE: hematopoiético /linfóide; KI: renal; LA: intestino grosso; LI: fígado; LU: pulmão; OE: esófago; OV: ovário; PA: pâncreas; PL: pleura; SK: pele; SO: tecidos moles; ST: estômago; TH: tireóide; UP: digestiva alta; UR: urinário (B) O papel previsto de STAT /via de sinalização Interferon na inibição panobinostat. Red- e verde-enche indica aumento e diminuição da expressão genética em linhas de células resistentes aos medicamentos, respectivamente. (C) Heatmap mostrando a expressão de genes no STAT via /Interferon correlacionada com a resposta panobinostat em múltiplas linhagens de câncer.

As vias pan-cancerosas previstos por PC-Meta a ser mais associada a uma resposta eram interferon Signaling, glicocorticóides Receptor (GR) de sinalização, e hepática Stellate celular (HSC) Activation (Figura 6A).