Sumário

Um método para melhorar o tratamento do cancro é a utilização de drogas de nanopartulas funcionalizadas com ligandos de direccionamento que reconhecem selectivamente receptores expressos por células tumorais. Em teoria, tais ligandos alvo deve entregar a droga de nanopartículas especificamente para o tumor, aumentando a concentração de droga no tumor e entrega do fármaco ao seu local de acção no interior do tecido do tumor. No entanto, a vascularização de tumores gotejante combinadas com um sistema linfático pobre permite a acumulação passiva, e a retenção subsequente, de materiais nanométricos em tumores. Além disso, um grande tamanho de nanopartículas podem impedir a penetração tumoral. Como tal, o papel de direcionamento ativo na entrega de nanopartículas é controversa, e é difícil prever como uma droga de nanopartículas alvo irá se comportar

in vivo

. Aqui nós relatamos

in vivo

estudos para α

vp

6-específica H2009.1 peptídeo alvo doxorrubicina lipossomal, o que aumentou a entrega lipossomal e toxicidade para as células de câncer de pulmão

in vitro

. Nós sistematicamente variado de afinidade de ligando, densidade de ligando, ligando de estabilidade, a dosagem de lipossomas, e modelos de tumores para avaliar o papel de direccionamento activo de lipossomas para a

Vp

6. Em contraste directo com os

in vitro

resultados, demonstrar nenhuma diferença no

in vivo

segmentação ou eficácia para H2009.1 tetramérica peptídeo doxorrubicina lipossomal, em relação ao controle de péptidos e sem lipossomas peptídicas. Examinando a acumulação de lipossomas e de distribuição no interior do tumor demonstra que o lipossoma, e não o péptido H2009.1, impulsiona a acumulação de tumor, e que tanto H2009.1 alvo e não-alvo lipossomas permanecem nas regiões perivasculares, com pouca penetração do tumor. Assim H2009.1 lipossomas direccionados não para melhorar a eficácia da droga, porque o lipossoma plataforma droga evita o péptido H2009.1 de ambos segmentação activamente o tumor e a ligação a células de tumor por todo o tecido do tumor. Portanto, utilizando um ligando de elevada afinidade e elevada especificidade de segmentação um biomarcador tumor sobre-expressa não garante a eficácia de um fármaco lipossomal melhorada. Esses resultados evidenciam a complexidade do

in vivo

segmentação

Citation:. Cinza BP, McGuire MJ, Brown KC (2013) A Plataforma lipossomal drogas Sobreposições Peptide ligando de direccionamento para um biomarcador Cancer, independentemente do ligando de afinidade ou densidade. PLoS ONE 8 (8): e72938. doi: 10.1371 /journal.pone.0072938

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 14 de julho de 2013; Publicação: 23 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gray et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Welch concessão # I-1622 e os Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer (NCI) conceder # 1R01CA164447 (a KCB). BPG foi apoiado por uma bolsa da Investigação e Prevenção Instituto do Câncer do Texas (RP 101496). Os recursos de imagem compartilhados da UT Southwestern está apoiado em parte por uma concessão suporte NCI ao Harold Simmons Cancer Center (P30 CA142543). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é a principal causa de morte no mundo, eo número de mortes relacionadas ao câncer deverá aumentar nas próximas décadas [1]. Um paradigma para melhorar o tratamento do cancro é o desenvolvimento de terapias de direccionamento que utilizam ligandos específicos de tumores para entregar drogas para selectivamente as células cancerosas, aumentando, assim, a acumulação do fármaco no tumor e reduzir as toxicidades indesejadas a partir de acumulação do fármaco em outras áreas do corpo. ligandos específicos de tumores acumulam preferencialmente em tumores, devido à especificidade para um receptor selectivamente expresso pelas células tumorais ou da vasculatura tumoral (e não expresso por células normais). drogas nanopartículas são particularmente atractivas para uso com os ligandos específicos de tumores devido à encapsulação da droga dentro de uma nanopartícula, o que impede a actividade da droga até que a sua libertação da nanopartícula e pode aumentar o tempo de circulação sanguínea.

peguilada de doxorrubicina lipossomal (DOXIL ® /CAELYX®) foi o primeiro nanopartículas clinicamente aprovados para o tratamento do cancro. DOXIL ® é de aproximadamente 100 nm de tamanho, contém a doxorrubicina antraciclina quimioterapêutico [2], e está actualmente aprovado para o tratamento do cancro do ovário [3], mieloma múltiplo [4], e sarcoma de Kaposi [5], tanto nos Estados Unidos e e Europa para uso em pacientes com cancro da mama na Europa [6]. Numerosos estudos clínicos envolvendo a droga estão em curso, incluindo os ensaios em doentes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [7]. Devido ao sucesso clínico de DOXIL ®, a maioria dos ligandos alvo para conjugados de nanopartículas de administração de fármaco alvo foram conjugados com formas lipossómicas de doxorrubicina. Ambos os ligandos de anticorpos e péptido alvo têm sido utilizados para aumentar a eficácia e diminuir a toxicidade da doxorubicina lipossomal por células tumorais vasculatura segmentação activamente e tumorais [8-25]. De particular interesse, anti-HER2 doxorrubicina lipossomal e formulações doxorrubicina lipossomal anti-EGFR estão em fase I de ensaios clínicos [26,27]. Além disso, doxorrubicina lipossomal conjugado com um derivado peptídico da vasculatura do tumor peptídeo alvo NGR [28] foi preparado para potenciais futuros ensaios clínicos de preparação utilizando Boas Práticas de Fabricação (BPF) [29].

Entre os muitos vantagens da utilização de doxorrubicina lipossomal para segmentação terapias é a elevada razão entre droga e ligando alvo, devido aos milhares de moléculas de doxorrubicina aprisionados dentro de cada lipossoma. Além disso, peguilado doxorrubicina lipossomal goza

in vivo

longos tempos de circulação [30], estendendo o tempo de segmentação ligantes têm para entregar sua carga ao tumor. Um fator importante que contribui para a eficácia da droga liposomal é a acumulação passiva de nanopartículas no tumor através da permeabilidade aumentada e efeito de retenção (EPR) [31]. Ao contrário da vasculatura de tecido normal, a vasculatura tumoral é irregular e desordenada. partículas nanométricas podem escapar através dessa gotejante vasculatura para o tecido circundante do tumor e são subsequentemente retida dentro do tumor devido às más sistemas de drenagem linfática de tumores. Assim, a acumulação tumoral de lipossomas dirigidos por ligando depende não só no ligando alvo específico, mas também em efeitos EPR-impulsionadas. O papel de direcionamento ativo na entrega de nanopartículas para tumores é controverso [32-36].

Estudos com lipossomas direccionados têm demonstrado dois mecanismos para melhorar a acumulação do fármaco tumor, os quais levam a resultados terapêuticos desejáveis. Alguns lipossomas dirigidos-peptídicos, em particular os que se destinam a vasculatura tumoral, incluindo as NGR-lipossomas, entregar mais doxorrubicina para os tumores do que os lipossomas não-alvo [9,16], sugerindo que os lipossomas direccionados estão a acumular-se no tumor com base em ambos o péptido alvo capacidades e o efeito EPR. Outras formulações de lipossomas alvo-anticorpo, incluindo o anti-HER2 e anti-EGFR lipossomas, se acumular no tumor em níveis semelhantes aos lipossomas não-alvo. No entanto, ao contrário dos lipossomas não-alvo, estes lipossomas direccionados internalizar em células tumorais e apresentam uma melhor distribuição de todo o tecido tumoral [37,38]. Enquanto o ligando de direccionamento não substitui o efeito EPR condução acumulação tumoral destas formulações lipossómicas, o local alterado da droga para o seu local de acção no interior das células tumorais aumenta a eficácia. Devido ao efeito EPR e a diferente estrutura vasculatura de cada tumor, é difícil prever como uma formulação de lipossoma de segmentação não testado irá acumular-se nos tumores e afectar o crescimento tumoral.

Recentemente, descreveu o desenvolvimento do péptido alvo doxorrubicina lipossomal formulações específicas para os α do receptor de forma restritiva expressas

vp

6 [39]. As α integrina

vp

6 está emergindo como um destino de câncer ideal; ela é expressa por uma variedade de cancros do epitélio [40-50] e só raramente expressa em tecidos normais [51]. De particular interesse é a prevalência de α

vp

6 no cancro do pulmão, o cancro assassino número um de homens e mulheres [1]. Mais de metade de cancro do pulmão de não pequenas células do paciente (NSCLC) tumores expressam α

Vp

6, e a expressão da integrina é “ligado” durante as fases iniciais de NSCLC carcinogénese e permanece elevada durante toda a progressão da doença [52].

Nós identificamos e, posteriormente, otimizado um α

vp

peptídeo específico-6, H2009.1 [53]. O péptido monomérico liga-se células H2009 adenocarcinoma de NSCLC com uma afinidade de ligação de metade do máximo de 9,2 nM, e a síntese do péptido H2009.1 como um péptido tetramérica fago estrutura que imita aumenta a afinidade para 23:00 [54]. Ambos os péptidos monoméricos e tetram�icos internalizar em α

vp

6 células que expressam

in vitro Comprar e alvo tumores

in vivo

. Com o objetivo de traduzir peptídeos isolados de bibliotecas de apresentação de fagos em agentes de entrega de terapêuticas eficazes, examinamos a melhor plataforma para a exibição dos péptidos H2009.1 sobre doxorrubicina lipossomal para entrega de drogas

in vitro

, variando tanto peptídeo lipossomal densidade e péptido valência [39].

In vitro

, a formulação de lipossomas mais eficaz exibe o péptido tetramérica H2009.1 a uma densidade de 1,3% do conteúdo total de lípidos. A formulação de lipossomas H2009.1 tetramérica 1,3% foi 2 vezes mais tóxico para as células do que os lipossomas que ostentam o controlo mexidos péptido scH2009.1 e mais de 10 vezes mais tóxico do que o nu, não peptídicos, lipossomas. Apesar destes

in vitro

resultados, não está claro se a mesma formulação de lipossomas irá melhores α destino

vp

6 expressando tumores

in vivo

. Existem diferenças significativas entre o

in vitro

para

In vivo

contextos, incluindo possíveis diferenças na expressão do receptor e disponibilidade, estrutura vasculatura do tumor, e os efeitos de biodistribuição de drogas.

Para examinar o melhor H2009.1 alvo formulação de doxorrubicina lipossomal para inibir α

vp

6 expressando o crescimento do tumor

in vivo

, nós afinidade sistematicamente variada ligando, ligando densidade, estabilidade ligando, dosagem de lipossomas, e tumor modelos para avaliar o papel de direccionamento activo do lipossoma em três modelos NSCLC. Apesar das diferenças de segmentação entre os diferentes formulações de lipossomas

in vitro

, todas as plataformas de lipossomas peptídicas H2009.1 exibem eficácia idêntica

in vivo

. Além disso, não há diferença entre a eficácia dos lipossomas H2009.1 e de controlo de lipossomas não-peptídicos. Experiências subsequentes demonstraram que este resultado é devido à acumulação tumoral de lipossomas baseia-EPR e falha dos lipossomas para penetrar no tecido tumoral passado áreas imediatamente adjacentes à vasculatura do tumor, apesar da expressão disseminada de α

Vp

6 no tumor . Esses resultados evidenciam a complexidade do

in vivo

droga segmentação, mesmo quando se usa um ligando de alta afinidade conhecida para alvejar seletivamente tumores

in vivo

, e sugerem que um grande nanopartículas pode não ser a melhor segmentação plataforma para todos os ambientes de tumor.

Materiais e Métodos

Materiais

Todos os aminoácidos Fmoc foram adquiridos de Novabiochem® (EMD Millipore, Billerica, MA). Sepharose CL-4B e Sephadex G-50 foram adquiridos da Sigma-Aldrich Inc. (Livermore, CA). Os lípidos foram adquiridos a Avanti® Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) e cloridrato de doxorubicina por injecção de Bedford Laboratories ™ (Bedford, OH). O Probes® molecular corantes DII [DII (C)

18 (3), 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ‘, 3’-tetramethylindocarbocyanine perclorato] e Dir [DIOC

18 (7) , 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ‘, 3’-iodeto tetramethylindotricarbocyanine], foram adquiridos a Life Technologies ™ (Grand Island, NY). Para a cultura de células, soro fetal de bovino (FBS) foi adquirido de Gemini Bio-Products (West Sacramento, CA) e ambas RPMI 1640 e EDTA de tripsina 1x, de Mediatech, Inc. (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

linhas celulares

Todas as linhas de células NSCLC humanos utilizados foram previamente estabelecido e caracterizado [55]. As linhas celulares foram obtidas a partir do Centro de Hamon for terapêuticas Oncologia Investigação da UT Southwestern Medical Center. As linhas celulares foram testados rotineiramente para Mycoplasma e DNA impressões digitais para confirmar a sua identidade. As linhas de células H2009, H1975, H460 e foram crescidos a 37 ° C e 5% de CO

2 em meio RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS.

Péptido síntese e purificação

Ambos péptidos e H2009.1 scH2009.1 monoméricos e tetraméricos foram sintetizados como anteriormente descrito [54]. Resumidamente, todos os péptidos monoméricos e o núcleo tetramérica necessário para tornar os péptidos tetraméricos foram sintetizados num sintetizador Symphony (Rainin Instruments, Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ) por síntese peptídica em fase sólida de Fmoc padrão. Os péptidos tetraméricos foram sintetizados por reacção de um excesso de 5 vezes de péptidos monoméricos de rolamento de cisteína purificado com maleimida activado purificado núcleo tetramérica, numa solução de PBS + EDTA a 10 mM, com agitação à temperatura ambiente durante 2 horas. Todos os péptidos foram purificados por cromatografia em líquido de alta eficácia de fase inversa (HPLC) utilizando um espírito ™ Peptídeo C18 5 um, 25 x 2.12 coluna (AAPPTec®, Louisville, KY) em um ™ Breeze HPLC (Waters Corporation, Milford, MA) de acordo às condições de eluição da literatura [54]. tempo de dessorção a laser /ionização assistida por matriz de voo de espectrometria de massa foi usado para confirmar a massa do péptido (Voyager-DE ™ PRO, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). As massas dos péptidos monoméricos (massa média calculada /MH +: 1843,02 /1844,18) e núcleo tetramérica (massa média calculada /MNa +: 1251,49 /1274,27) foram determinadas em modo reflector usando α-ciano-4-hidroxicinâmico como matriz. As massas dos péptidos tetraméricos (massa média calculada /MH +: 8629,01 /8626,77) foram determinadas em modo linear, utilizando ácido sinapinico como uma matriz

Preparação de doxorrubicina lipossomal

Os lipossomas foram preparados a partir de soluções. os lípidos de soja hidrogenado L-α-phophatidylcholine (HSPC), colesterol, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [carbonil-metoxi (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG

20.000), e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [maleimida (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG

2000-maleimida) em 2: 1 de clorofórmio: metanol. Os lipossomas 0,64% foram preparadas a partir de misturas de 100 mg (131 umol) de HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) de colesterol, 14,7 mg (5,20 umol) de DSPE-PEG

20.000 e 3,85 mg (1,31? Mol) de DSPE PEG

2000-maleimida. Os lipossomas 1,3% foram preparadas a partir de misturas de 100 mg (131 umol) de HSPC, 25,4 mg (65,6 umol) de colesterol, 10,9 mg (3,87 umol) de DSPE-PEG

20.000 e 7,92 mg (2,69? Mol) de DSPE PEG

2000-maelimide. O solvente foi removido sob uma corrente lenta de azoto a 45

° C, e o filme de lípido foi deixado sob vácuo durante a noite. O filme lipídico seco foi hidratado com 155 mM (NH

4)

2SO

tampão 4, pH 5,5, por forma intermitente aquecendo a 65

° C e vortex. Os liposomas foram subsequentemente extrudida 20 vezes através de membranas de dupla empilhadas de 100 nm, e colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare, Waukesha, WI) foram usadas para mudar o tampão para Citrato de Na lipossómica exterior 123 mM, pH 5,5. A doxorubicina foi carregado remotamente (formação pós-lipossoma) por incubação dos lipossomas e doxorrubicina a 65

° C durante 1 hora. doxorrubicina livre foi removido utilizando uma coluna de Sephadex G-50 equilibrada com solução salina tamponada com HEPES. Os péptidos foram conjugados com os lipossomas por reacção durante 24 horas a uma razão de 2: 1 de péptido:. DSPE-PEG

2000-maelimide numa solução de salina tamponada com HEPES, e o excesso de péptido foi removido por meio de colunas de Sepharose CL-4B

Preparação de DII ou Dir-rotuladas lipossomas

Dye lipossomas marcados foram preparadas como descrito exceto que não foram carregados com doxorrubicina. A formulação de lipossomas 1,3% foi preparada com a adição do corante DII ou DiR na mistura de lípidos em 2: 1 de clorofórmio: metanol. Os corantes DII ou dir foram dissolvidos em etanol a uma concentração de 2,5 mg /mL e foram adicionados à mistura de lípidos a uma razão de 3,75 g de corante /0,5 mg de lípido. O solvente foi removido sob uma corrente lenta de azoto a 45

° C, e o filme de lípido foi deixado sob vácuo durante a noite. O filme lipídico seco foi hidratado com 155 mM (NH

4)

2SO

tampão 4, pH 5,5, por forma intermitente aquecendo a 65

° C e vortex. Os liposomas foram subsequentemente extrudida 20 vezes através de 100 membranas de dupla empilhados nm, e colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare, Waukesha, WI) foram usadas para mudar o tampão para lipossómica exterior salina tamponada com HEPES. Os péptidos foram conjugados com os lipossomas por reacção durante 24 horas a uma razão de 2: 1 de péptido:. DSPE-PEG

2000-maelimide numa solução de salina tamponada com HEPES e excesso de péptido foi removido por meio de colunas de Sepharose CL-4B

Estabelecimento de rato modelos de tumor

protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da UT Southwestern Medical Center (animal Welfare Assurance número A3472-01, número de protocolo 2010-0280). Todos imagiologia foi realizada sob isoflurano, e todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Feminino NOD /SCID (da UT Southwestern Medical Center mouse Breeding Núcleo Facility) foram injetados com 1 milhão de H2009, H1975, ou células H460 no flanco direito. Todas as células foram injectados em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, e foram preparadas para injecção através da incubação das células com 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco®, Life Technologies ™, Grand Island, NY) durante 10 minutos, temperar a tripsina com meio, e a lavagem das células com solução salina tamponada com fosfato antes da suspensão final em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de 10 milhões de células por ml.

em experiências in vivo terapêuticas

H2009 tumores subcutâneos foram estabelecidos no flanco de NOD /SCID. Uma vez que os tumores palpáveis ​​tinha formado, 18 dias após a implantação de células de tumor, os ratinhos foram tratados com HBS (controlo) ou formulações de lipossomas diferentes, com base na concentração total de doxorrubicina. As diferentes formulações de lipossomas e das doses de tratamento são descritos em detalhe na secção Resultados. Para todas as experiências, os ratos foram tratados uma vez por semana durante 3 semanas, no dia 18, 25 e 32, através de injecção na veia da cauda. Os tumores foram medidos por um cientista independente, e os volumes tumorais foram calculados a partir da fórmula

V

=

(LXW

2

)

/2.

Métodos estatísticos

a significância estatística das diferenças de tamanho do tumor entre os grupos tratados com o fármaco e o grupo controle foram calculados usando um ANOVA com o teste de comparação múltipla de Dunnett e entre diferentes grupos tratados de drogas, usando um ANOVA com múltiplas de Tukey teste de comparação. A significância estatística das diferenças entre as curvas de sobrevivência foram calculados a partir de curvas de Kaplan-Meier com teste de log-rank. Todos os cálculos foram determinados utilizando GraphPad Prism.

In Vivo e Ex Vivo Near Infrared de imagem

Mice rolamento H2009 subcutânea, H1975, ou tumores H460 no flanco direito foram injetados via veia da cauda com DIR- lipossomas marcados com uma concentração de fosfolípido 22,22 umol /kg. Este fosfolípido /kg concentração correlaciona-se com a mesma quantidade de fosfolípido (e, por conseguinte, o mesmo número de lipossomas) como presente num tratamento de 4 mg /kg de doxorrubicina lipossomal. ratinhos portadores de tumor H2009 e H460 foram injectados com versões Dir-marcados da tetramérica 1,3% H2009.1, AcH2009.1 tetramérica, scH2009.1 tetramérica, ou lipossomas nus com 3 ratinhos por grupo de lipossomas. Os ratinhos portadores de tumores H1975 foram injectados com versões Dir-marcados da tetramérica H2009.1 1,3%, scH2009.1 tetramérica, ou lipossomas nus com três ratinhos por grupo de lipossomas. Para cada ratinho, Nair® foi usada para remover todo o cabelo a partir da metade inferior do corpo. Aos 24, 48 e 72 horas após a injecção de lipossomas, os ratos foram fotografadas para a DIR de fluorescência de corante utilizando um Lumina IVIS® (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Depois de imagem inteira do mouse em 72 horas, todos os ratos foram sacrificados e os órgãos retirados para

ex vivo

imagem fluorescente. Para cada rato, os órgãos foram fotografadas em ambos os lados, e a média do valor de eficiência radiante de dois lados utilizados como o valor real da acumulação de lipossomas em que o tecido.

Microscopia de DII lipossomas em secções de tumores

Os ratinhos portadores H2009, H1975, H460 ou tumores subcutâneos foram injectados através da veia da cauda com lipossomas DII-marcados a uma concentração de 22,22 pmol /kg de fosfolípidos. Para cada tipo de tumor, os ratinhos foram injectados com DII-rotulados versões do tetramérica H2009.1 1,3%, scH2009.1 tetramérica, ou lipossomas nus, com três ratinhos por grupo de lipossomas. Um ratinho de cada grupo de tratamento foi sacrificada em 24 horas, um segundo ratinho às 48 horas, e o terceiro rato a 72 horas. No momento do sacrifício, os tumores foram removidos e congelados rapidamente dentro cryomolds usando Tissue-Tek® O.C.T. Composto meio de montagem (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Para a microscopia, os tumores foram seccionados em 10 mm usando um criostato Leica CM3050 S (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). As secções foram obtidas a partir do topo, meio e fundo de cada tumor. Para a mancha vasculatura, um anticorpo primário CD31 (CD31 anti-rato de rato, catálogo # 550274, BD Biosciences, San Jose, CA) foi utilizado a uma diluição de 1:50 e um anticorpo secundário de cabra anti-rato fluoresceína (catálogo # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY, EUA) foi utilizado a uma diluição de 1: 100. As lâminas foram montadas com DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) e fotografada em um microscópio Leica CTR5500 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) e um DeltaVision

PDV

microscópio de desconvolução (Precision Aplicada, Inc., Issaquah, WA).

β

6 coloração de secções de tumor

secções de tumor preparados a partir dos tumores que contêm DII-lipossomas foram coradas para β

6 expressão utilizando um β

6 anticorpo primário (# catálogo MAB2076Z, EMD Millipore, Billerica, MA) a uma diluição de 1:50 e um anti-anticorpo secundário de rato de cabra fluoresceína (catálogo # A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY) a um 1: 100 de diluição. As lâminas foram fotografadas em um microscópio Leica CTR5500 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) e um DeltaVision

PDV

deconvolução microscópio (precisão Aplicada, Inc., Issaquah, WA).

Resultados

In Vivo Eficácia de H2009.1 tetramérica Peptide lipossomas Segmentação α

vp

6

Para verificar se a α

Vp H2009.1

6-específica peptídeo pode ser usado para aumentar o

in vivo

entrega e eficácia da doxorrubicina lipossomal em direção α

vp

6 expressando tumores NSCLC, nos propusemos a explorar os efeitos da densidade de peptídeo lipossomal e valência em resultados terapêuticos em ratinhos portadores de tumor. Começámos por tratar ratinhos portadores de tumor com o H2009.1 tetramérica formulação de peptídeo lipossomas de 1,3%, que demonstrou o melhor

in vitro

eficácia com a toxicidade não específica limitada [39]. Nesta formulação de lipossomas de 1,3%, 1,3% do lípido total é modificado com maleimida para permitir que os péptidos portadores de cisteína para acoplar-se ao lípido através de química de cisteína-maleimida. Assim, 1,3% de lípidos compreendendo cada lipossoma suportar o péptido H2009.1, resultando em cerca de 1400 péptidos por lipossoma. Acoplamento do péptido H2009.1 tetramérica aos 1,3% de resultados de formulação de lipossomas de um visor multivalente baseada em nanopartículas do péptido tetramérica inerentemente multivalente, resultando em um multivalência camadas que leva a uma maior especificidade e uma maior toxicidade para com α

Vp

6-expressando células NSCLC

in vitro

do que os lipossomas modificados com o peptídeo H2009.1 monomérica.

células H2009 NSCLC, que expressam α

vp

6, foram injetadas em NOD /SCID para formar xenoenxertos subcutâneos H2009. No dia 18, uma vez que os ratinhos tinham tumores palpáveis ​​formado, eles foram tratados com solução salina tamponada com HEPES (HBS) como um controlo; livre, não-encapsulado em lipossomas, doxorrubicina; α

vp

6-alvo de 1,3% doxorrubicina lipossomal H2009.1 tetramérica; ou controlar formulações doxorrubicina lipossomal. Dois diferentes formulações de lipossomas foram usadas como controlos não-alvo: 1,3% “despido”, sem péptido, lipossomas e 1,3% lipossomas scH2009.1 tetraméricos. Os 1,3% lipossomas nus servir como um normal, não-péptido de controlo de lipossoma-alvo, o que só deve acumular-se passivamente em tumores baseados no efeito EPR. Os 1,3% lipossomas scH2009.1 tetram�icos exibir uma seqüência de versão do peptídeo H2009.1 que não tem como alvo α

mexidos Vp

6; por conseguinte, estes lipossomas servir como um controlo para a especificidade do péptido H2009.1 e assegurar que a carga e a hidrofobicidade do péptido não está a conduzir a acumulação tumoral. Os ratos foram tratados por meio de injecções na veia da cauda uma vez por semana por via intravenosa durante 3 semanas com 4 mg /kg de cada uma das formulações de lipossomas, com base na concentração total de doxorrubicina, nos dias 18, 25, e 32 após a implantação de células de tumor. Este regime irá proporcionar a dose máxima tolerada de vida para ratinhos NOD /SCID ao longo de um período de 2 semanas [56]. injecções semanais foram escolhidos com base em estudos anteriores; mais injecções a uma dose inferior, provaram ser de uma eficácia semelhante como uma dose semanal mais elevada para outros lipossomas com a mesma formulação lipídica [2,16,57,58].

Tal como representado na Figura 1A, todos lipossoma formulações crescimento tumoral significativamente inibido em comparação com as de controlo HBS grupo tratado, com valores de p inferiores a 0,001. No entanto, não foi observada nenhuma diferença entre qualquer uma das formulações de lipossoma. Os lipossomas orientados 1,3% H2009.1 tetraméricos inibiu o crescimento de tumores na mesma extensão como tanto o controlo scH2009.1 tetramérica ou lipossomas nus. As taxas de crescimento do tumor são virtualmente idênticos até ao dia 64, altura em que a curva tetramérica scH2009.1 separa ligeiramente mas ainda está dentro da margem de erro do tetramérica H2009.1 e grupos de lipossomas nus. Importante, este efeito é reprodutível; os dados da Figura 1A representam a combinação de vários experimentos realizados separadamente.

tumores subcutâneos H2009 foram estabelecidos no flanco de NOD /SCID. Tumor-rolamento camundongos foram tratados com HBS (controle) e quer 4mg /kg (

A Restaurant –

B

) ou 2 mg /kg (

C Restaurant –

D

) de doxorrubicina livre ou o tetramérica H2009.1 1,3%, scH2009.1 tetramérica, ou lipossomas nus, com base na concentração total de doxorrubicina.

Um

) curvas de crescimento do tumor para os ratinhos tratados com 4 mg /kg de as diferentes formulações de lipossomas demonstram que o α

Vp

6-segmentação 1,3% lipossomas H2009.1 tetraméricos inibir o crescimento do tumor para a mesma medida como a tetramérica controle scH2009.1 e nua, sem peptídeo, lipossomas. (

B

) curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para ratinhos tratados com 4 mg /kg de as diferentes formulações de lipossomas demonstram que todos os tratamentos de lipossomas aumentam significativamente a sobrevivência em comparação com os murganhos de controlo (p 0,0001 para o H2009.1 tetramérica e lipossomas nus e p = 0,0007 para os lipossomas scH2009.1 tetraméricos), e o tratamento com os lipossomas H2009.1 tetraméricos aumenta a sobrevivência em comparação com o tratamento com lipossomas de controlo scH2009.1 tetraméricos (p = 0,0068). (

C

) curvas de crescimento do tumor para os ratinhos tratados com 2 mg /kg de as diferentes formulações de lipossomas demonstram que a doxorrubicina livre e todas as formulações de lipossomas inibir significativamente o crescimento do tumor em comparação com ratinhos de controlo, e todas as formulações de lipossomas 3 inibir tumores o crescimento na mesma extensão em níveis significativamente melhor do que a doxorrubicina livre. (

D

) curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para ratinhos tratados com 2 mg /kg das diferentes formulações de lipossomas demonstrar nenhuma diferença significativa entre a sobrevivência ratinhos tratados quer com doxorubicina livre ou qualquer uma das formulações de lipossoma. (

E Art

F

) comparações directas do crescimento do tumor (

E

) e sobrevivência (

F

) de camundongos tratados com 4 mg /kg ou 2 mg /kg dos lipossomas H2009.1 tetraméricos 1,3% demonstra que a 4 mg /kg de tratamento foi significativamente melhor na inibição do crescimento do tumor e aumentou significativamente a sobrevivência (p = 0,0005). As setas indicam os dias de tratamento. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0.001verses controle, salvo indicação em contrário com suportes.

Foi também determinada a sobrevivência geral dos ratos sobre o diferente regime de tratamento. Livre, não-encapsulado em lipossomas, doxorrubicina provou tóxicos para os ratinhos neste regime de dosagem de 4 mg /kg. Os ratinhos tratados com a doxorrubicina livre, todos morreram no dia 32, antes de receber a terceira e última dose do fármaco. Por conseguinte, duas injecções de 4 mg /kg de doxorrubicina, para um total de 8 mg /kg de doxorrubicina, são suficientes para a toxicidade induzida por drogas nos nossos estudos. Todos os outros ratos viveram até serem sacrificados devido aos seus tumores, atingindo um comprimento de 2 cm (Figura 1B). Como esperado a partir das curvas de crescimento do tumor, houve diferença de sobrevivência significativa entre o grupo de controlo e de todos os grupos de tratamento de lipossomas (p 0,0001 para o tetramérica 1,3% H2009.1 e lipossomas nus e p = 0,0007 para o scH2009 1,3% .1 lipossomas tetraméricos). Embora três dos ratinhos tratados com 1,3% H2009.1 tetramérica lipossoma viveram mais tempo do que qualquer um dos ratinhos tratados com lipossomas nu 1,3%, estas diferenças não foram estatisticamente significativas. No entanto, houve uma diferença significativa de sobrevivência entre os camundongos tratados com o tetramérica H2009.1 1,3% e scH2009.1 lipossomas tetram�icos (p = 0,0068). Assim, embora o tratamento com os lipossomas H2009.1 tetram�icos 1,3% não melhorou a eficácia terapêutica em um 4 mg regime de dosagem /kg em comparação com os lipossomas não-alvo nus, estes α

vp

6-alvo lipossomas aumento da sobrevida em comparação com o peptídeo de controle lipossomas scH2009.1 tetram�icos.

Efeitos de lipossomas de dosagem sobre a Eficácia in vivo do peptídeo lipossomas H2009.1

Como não houve aumento do benefício terapêutico para 1,3% lipossomas exibindo a tetramérica H2009.1 versos péptido de controlo lipossomas nus, nós concluímos que o α

Vp segmentação

6-específica dos lipossomas peptídicos H2009.1 pode ser mascarado pela eficácia dos lipossomas nus em concentrações de tratamento de quatro mg /kg (12 mg /kg totais). Isto poderia resultar por saturação do receptor de tal modo que as diferenças entre a focalização activa e passiva são diminuídas.