Abstract

Fundo

Um quinto dos pacientes com aparentemente “curável” adenocarcinoma ductal pancreático ( PDA) experimentar uma recidiva precoce e morte, recebendo nenhum benefício definidos a partir de uma grande operação. Alguns pacientes com tumores avançados são considerados ‘irressecável’ por critérios de preparo convencional (por exemplo metástase hepática), ainda progredir lentamente. biomarcadores eficazes que estratificam PDA baseado em comportamento biológico são necessários. Para ajudar os pesquisadores a classificar através do labirinto de dados de biomarcadores, um compêndio de ~2500 biomarcadores candidatos publicados em PDA foi compilado (PLoS Med, 2009. 6 (4) p. E1000046).

métodos e resultados

com base neste compêndio, construímos um

sobrevivência tissue microarray

(denominado s-TMA) composta de curto prazo; sobreviventes e de longo prazo (morte específico do cancro 30 meses, n = 79) submetidos a ressecção de PDA (total, n = 137). As funções s-TMA como um filtro biológico para identificar marcadores prognósticos de boa fé associados com extremos grupo sobrevida (pelo menos 18 meses grupos de sobrevivência separados). Com base em um processo de seleção rigoroso, 13 biomarcadores PDA putativos foram identificados a partir do repositório biomarcador público. Os candidatos foram testados contra o s-TMA por imuno-histoquímica para identificar os melhores marcadores da biologia do tumor. Em um modelo multivariado, MUC1 (odds ratio, OR = 28,95, 3+ vs. negativo expressão, p = 0,004) e MSLN (OR = 12,47, 3+ vs. negativo expressão, p = 0,01) foram altamente preditivos de Câncer início morte específica. Em comparação, fatores patológicos (tamanho, metástases em linfonodos, estado margem de ressecção e grau) tiveram RUP inferior a três, e nenhum atingiu significância estatística. Curvas ROC foram usados ​​para comparar as quatro características patológicas de prognóstico (área ROC = 0,70) a três preditores moleculares univariadas (MUC1, MSLN, MUC2) do grupo sobrevida (área ROC = 0,80, p = 0,07).

Conclusões

MUC1 e MSLN foram superiores às características patológicas e outros biomarcadores putativos como prever grupo sobrevivência. ensaios moleculares que comparam cânceres de sobreviventes curtas e longas são uma estratégia eficaz para rastrear biomarcadores e priorizar os genes do câncer candidato para estudos diagnósticos e terapêuticos

Citation:. inverno JM, Tang LH, Klimstra DS, Brennan MF, Brody JR, Rocha FG, et ai. (2012) A tissue microarray Novel Survival-base de cancro do pâncreas Valida MUC1 e mesothelin como biomarcadores. PLoS ONE 7 (7): e40157. doi: 10.1371 /journal.pone.0040157

editor: Frederic Andre, Universidade de Aix-Marseille, França |

Recebido: 14 Março, 2012; Aceito: 01 de junho de 2012; Publicação: 06 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Winter et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

financiamento:. Fundos para o estudo eram derivados de U01 CA152653, PI Allen. Além disso, os fundos foram fornecidos pelo Marshall e Therese Sonenshine Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

enquanto o adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) é tipicamente agressivo em comparação com a maioria dos outros cancros, a doença é composta por uma gama de fenótipos biológicos. Cerca de 20% dos pacientes que se submetem à ressecção vai viver, pelo menos, 5 anos, e uma porcentagem similar de pacientes deverá repetir-se logo após a ressecção e morrer da doença dentro de um ano [1] – [4]. Ao nível genómico, cada PDA adquire um conjunto único de mutações somáticas [5]. diversidade molecular nos níveis de RNA e proteína é ainda mais complexa. Apesar do genotípica e fenotípica diversidade no PDA, não há biomarcadores prognósticos fiáveis ​​ou clinicamente relevantes que estratificam a doença com base em resultados previstos.

Os laudos incluem informações básicas a respeito do estágio e grau do tumor, e atualmente fornecem a melhor informação prognóstica disponível. características patológicas convencionais continuam a ser o padrão ouro prognóstico (status, por exemplo, linfonodo e grau histológico). No entanto, em vários estudos grandes, as taxas de risco ajustado de características patológicas estão abaixo de dois [6] – [8]. Da mesma forma, em um nomograma câncer pancreático validado, características patológicas adversas contribuem com menos de 10% às previsões de sobrevivência de 3 anos [9]. Soro CA19-9 é igualmente limitado, como um marcador de prognóstico [10] – [12]. informações de prognóstico com tal valor preditivo mínima não pode informar de forma confiável as decisões de tratamento. Além disso, um conjunto completo de dados patológica está disponível apenas para pacientes com cancros ressecados, que compreendem uma minoria de pacientes com PDA.

Melhoria da informação prognóstico é uma prioridade da investigação sobre o cancro. Em primeiro lugar, o prognóstico exato informa discussões entre oncologistas e pacientes sobre a história natural do câncer de pâncreas. Em segundo lugar, as informações podem orientar as decisões de tratamento com implicações para a qualidade de vida e resultados relacionados com o cancro. Os biologicamente mais agressivo PDAs (tais como aqueles que se repetem logo após a ressecção) são melhor tratadas inicialmente com a terapia sistémica, em oposição a uma grande cirurgia. cirurgia pancreática atrasa o tratamento sistémico por um mínimo de 2 meses e expõe o paciente a risco operatório substancial com pouco benefício esperado. Por outro lado, os pacientes com cancros indolentes com doença oligometastatic podem beneficiar de uma abordagem cirúrgica agressiva, como se tornou padrão de cuidados em pacientes selecionados com câncer colorretal metastático [13]. Em terceiro lugar, os biomarcadores de prognóstico fornecer insights mecanicistas para o desenvolvimento do câncer. Em quarto lugar, eles servem como alvos moleculares para novas estratégias de tratamento, tais como vacina [14], o anticorpo [15], e terapias genéticas-driven promotor [16].

estudos de impacto alta com base em centenas de amostras de pacientes melhoraram capacidades prognósticos em vários tipos de cancro (por exemplo, pulmão, próstata, cólon e mama) [17] – [20]. Estudos de magnitude semelhante e as possibilidades têm se mostrado difícil em câncer de pâncreas, devido à menor quantidade de tecido disponível para estudo e menor heterogeneidade biológica entre tumores. Talvez o estudo de prognóstico mais informativo a data em PDA identificados um painel de 6 marcadores de prognóstico com base em diferenças de expressão génica entre PDA localizada e amostras de autópsia (n = 30) [21]. A lógica por trás do desenho do estudo foi que os dois grupos de estudo representavam diferentes extremidades do PDA extremos. Na verdade, os grupos foram, na verdade, distingue-se pelo estádio da doença (isto é cedo tarde vs), em oposição ao comportamento biológico (isto é agressivo vs indolente). O grupo localizada na verdade, teve uma sobrevida média de apenas 9 meses, que é considerado um curto período de sobrevivência pós-ressecção [6].

No presente estudo, utilizou-se imuno-histoquímica para interrogar um conjunto dicotômica de PDAs ressecados ( n = 137), composto exclusivamente por (agressivos específicos do cancro de sobrevivência (sobrevivência 30 meses) cancros, para os verdadeiros preditores de sobrevida. Um painel de 13 promissores biomarcadores PDA foi seleccionado a partir de literalmente de milhares de biomarcadores candidatos PDA publicados utilizando uma estratégia de selecção rigorosa (descrito em detalhe abaixo), a partir de um compêndio pública de biomarcadores PDA (Figura 1) [22]. Usando essa abordagem, descontamos 11 biomarcadores PDA putativos como marcadores prognósticos. No entanto, duas proteínas, mesothelin (MSLN) e mucina 1, da superfície celular associado (MUC1), foram preditores robustos do grupo sobrevivência e superou características patológicas convencionais como fatores prognósticos. Neste estudo, nós demonstramos a utilidade de um grande escala, alta taxa de transferência imuno-histoquímica (IHQ) baseado no ensaio de PDAs a sobrevivência extremos para identificar biomarcadores de boa fé de biologia do cancro agressivo.

métodos

os pacientes

Este estudo foi aprovado pelo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) conselho de revisão instituição. Os pacientes foram incluídos se eles foram submetidos a uma ressecção pancreática por invasivo tipo tubular adenocarcinoma ductal (convencional) (PDA) após o ano 2000, e morreram da doença dentro de 1 ano da ressecção (sobrevivência short) ou sobreviveram pelo menos 30 meses (sobrevivência a longo) . Os limites específicos de sobrevivência foram escolhidos por duas razões: em primeiro lugar, para se obter grupos que estavam suficientemente alimentado para a análise, ainda continham amostras comparáveis ​​entre si; Em segundo lugar, a fim de que que o intervalo de tempo entre os dois grupos de sobrevivência (pelo menos 1,5 anos no presente estudo) sublinhou a biologia do tumor através do tratamento relacionados com determinantes de sobrevivência. Por exemplo, o tratamento adjuvante proporciona um benefício de sobrevivência de cerca de três meses para PDA [23] e, portanto, não deve ditar grupos de sobrevivência, tal como definido aqui, exceto em casos raros. Da mesma forma, as taxas de recuperação da cirurgia são variáveis, mas os pacientes que sobrevivem a ressecção pancreática geralmente voltar para sua linha de base pré-operatório, ou sofrem de sintomas relacionados com a doença [24]. Os registros de cada paciente no grupo de sobrevivência a curto prazo foram meticulosamente revisados, e apenas os pacientes que morreram de câncer pancreático (e não complicações da cirurgia) foram incluídos no estudo. Foram excluídos pacientes com câncer invasivo decorrente de neoplasia mucinoso papilar intraductal, carcinoma coloide, carcinoma de células acinares, e outras variantes menos comuns de adenocarcinoma.

Informações Correlação

Correlação informações foram extraídas do banco de dados tumor pancreático institucional e de registros eletrônicos de pacientes. variáveis ​​clínicas relevantes incluídos quimioterapia pós-operatória, radioterapia, e sobrevida do paciente. dados patológicos incluídos estado dos linfonodos (positivo vs negativo), a diferenciação do tumor (pobres vs moderada /poço), tamanho (≥3 cm x 3 cm) e status margem de ressecção (positivo vs negativo). doença microscópica no pescoço pancreático, ducto biliar, o duodeno, e as margens uncinados foram classificados como positivos.

Preparação do tecido

A TMA foi construído a partir de núcleos de tecido obtidas a partir de formalina -Fixed, embebidos em parafina de tecido em blocos de 151 amostras de doentes. Em todos os casos, as amostras de tecido foram obtidas a partir ressecados adenocarcinomas primários ductal do pâncreas. O técnico colocou as amostras no TMA de forma cega garantindo que IHC interpretação pelos investigadores do estudo foi imparcial. A TMA foi construído como se segue: um bloco de tumor representativo foi obtido e uma correspondente com H slides E manchado foi examinada sob um microscópio para focos de alta celularidade neoplásica. núcleos em triplicado foram tomadas a partir dos blocos de índice e transferida para um bloco de TMA virgem para processamento com uma máquina automatizada de arranjos de tecidos (ATA-27, Beecher Instruments, Silver Spring, MD). seções TMA foram então cortado a partir do bloco em preparação para experimentos de imunohistoquímica.

Valores ao longo da linha diagonal indicada (

linha de não-discriminação

) refletem uma suposição aleatória, com pontos acima da linha sendo melhor do que aleatório. C-index ou área de Harrel sob a curva (AUC) para cada parcela é fornecida. Os valores de P referem-se a comparações entre a determinada curva ROC, em comparação com características patológicas somente.

Seleção de Biomarkers

Um compêndio publicado de biomarcadores de câncer de pâncreas putativos com base em uma abrangente pesquisa bibliográfica lista 2.516 genes sobre-expressos (~ 10% do genoma) em câncer pancreático [22]. Devido ao número esmagador de biomarcadores candidatos, nós projetamos uma estratégia para selecionar um painel de anticorpos para uso contra o s-TMA (Figura 1). Nós pared a lista de possibilidades para baixo para 386 genes candidatos previamente estudadas usando IHC. A lista de biomarcadores IHC em PDA era então cruzadas com nosso catálogo patologia institucional de 380 anticorpos otimizados. Nossa principal patologia continha 65 anticorpos otimizados contra biomarcadores PDA putativos. Devido ao número finito de secções histológicas coradas, disponíveis a partir de um estudo de TMA (~ 50 no presente recurso), que refinado ainda mais o processo de selecção por estratificação biomarcadores de acordo com o número de estudos publicados IHC independentemente citados no repositório biomarcador central. Usando essa estratégia, 13 biomarcadores PDA foram identificados como objecto de quatro ou mais estudos revisados ​​por especialistas baseados em IHC, e, adicionalmente, já foram otimizados em nosso núcleo patologia (BCL2, CASP3, CCND1, EGFR, ErbB2 MSLN, MUC1, MUC4, P53, SMAD4, MUC5AC, BIRC5 e ITGB4). Os primeiros 10 foram selecionados para testar no presente estudo. Além disso, três anticorpos foram incluídos como amostras representativas das opções restantes de biomarcadores putativos PDA: CEACAM6 (2 publicações baseadas na IHC anteriores), MYC (2 publicações) e MUC2 (1 publicação). MUC2 se acreditava ser particularmente intrigante devido à sua associação com tumores pancreáticos indolentes, em contraste direto com MUC1, que tem sido associada com subtipos de tumor pancreático mais agressivas [25], [26].

Análise imuno-histoquímica

análises de imuno-histoquímica foi realizada por um procedimento de estreptavidina-biotina-peroxidase padrão. seções TMA marcadas foram submetidos a recuperação epitopo calor induzida com o sistema automatizado Ventana Descoberta XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Os anticorpos primários e as suas diluições foram: BCL2 (1:100, DAKO, Carpenteria, CA), CASP3 (1:300), CCND1 (01:25, Lab Vision, Fremont, CA), CEACAM6 (01:05, Biogenex, San Ramon, CA), EGFR (1:100, Zymed, Carlsbad, CA), ERBB2 (1:400, Signet, Princeton, NJ), MSLN (1:100, Vector Labs, Burlingame, CA), MUC1 (1:100 , Vector Labs, Burlingame, CA) [27], MUC2 (1:100 Vector Labs, Burlingame, CA) [27], MUC4 (1:3000, clone 8G7, um presente da Universidade de Nebraska) [28], MYC ( 1:2000, Epitomics, Burlingame, CA), P53 (1:500, DAKO, Carpenteria, CA), e SMAD4 (1:800, Santa Cruz Bio, Santa Cruz, CA). O Kit Ventana DABMap foi usado para a detecção de anticorpos.

avaliação imuno-histoquímica foi realizada por um patologista pancreático especialista (L.H.T.) e gravado por um investigador do estudo diferente (J.M.W). SMAD4, MUC2 e BCL2 foram classificados como positivos ou negativos pelo IHC com base em estratégias de pontuação anteriores [29]. Para todos os outros anticorpos, uma escala de 4 pontos (0 a 3+) foi aplicada com base na percentagem de células cancerosas marcadas no núcleo do tecido: 0 ( 10% de células marcadas), 1+ (11-25%) , 2+ (26% -75%), 3+ ( 75%). Uma pontuação média foi registrada para cada conjunto triplicado. Um total de 14 amostras tinham insuficiente celularidade neoplásica para análise IHC e foram excluídos, obtendo-se 137 amostras com tecido adequado para todos os anticorpos testados.

Análise Estatística

A análise foi realizada utilizando Intercooled Stata 8.2. As variáveis ​​categóricas foram testadas pelo teste exato de Fisher, variáveis ​​contínuas pelo teste de soma Wilcoxon Rank, e regressão logística padrão foi realizada para testes variados. As variáveis ​​contínuas foram testadas usando o teste rank sum. Uma comparação de modelos de regressão multivariados foi realizada para identificar o melhor modelo prognóstico usando receiver operating análise característica e C-índice do Harrel associado (também referida como a área sob a curva ROC ou área). Na presente análise, as medidas C-índice quão bem um modelo multivariado particular de preditores discrimina entre grupos de sobrevivência a curto e longo prazo. Os valores variaram entre 0 e 1. Um valor de 0,5 indica que não há capacidade preditiva (previsão aleatória) e aparece como uma linha diagonal em um gráfico ROC, enquanto que valores acima de 0,5 indicam uma boa previsibilidade, e aparecem como parcelas curvilíneas acima da diagonal. Quando duas curvas ROC não se cruzam, o único com um C-index maior domina sobre o outro. Todas as estatísticas foram bicaudais com um valor de p . 0,05, indicando significância estatística

Características

Resultados

Convencional Patológica

Houve 79 (58%) pacientes no longo termo grupo sobrevivente e 58 (42%) no grupo sobrevivente de curto prazo. características convencionais patológicas (estado linfonodal, grau histológico, tamanho e estado margem de ressecção) e variáveis ​​do paciente (idade, sexo, tempo de pós-operatório de permanência e tratamento adjuvante) foram analisados ​​como preditores de grupo sobrevida (Tabela 1). Nenhum dos fatores relacionados aos pacientes correlacionados com a sobrevivência. Das variáveis ​​patológicas, positivo linfático status do nó (p = 0,02), falta de diferenciação (p = 0,003), e um tamanho de tumor superior a 3 cm (p = 0,02) foram associados com a morte específica por câncer no início da análise univariada não ajustada.

a precisão do prognóstico de três modelos diferentes, como estimado pelo C-index do Harrell, foi comparado, em gráfico e tabulados (Figura 4). O modelo que incluiu os três biomarcadores (MUC1, MSLN e MUC2) foi superior ao modelo, incluindo quatro características patológicas convencionais (estado linfonodal, grau histológico, tamanho do tumor e status margem de ressecção), embora a diferença só perdeu significância estatística ( p = 0,07). O modelo combinado com biomarcadores e características patológicas tiveram o melhor desempenho (p = 0,0001).

Biomarkers

padrões de expressão dos marcadores prognósticos 13 candidatos (ver Métodos e Figura 1 para obter detalhes sobre a seleção biomarcador estratégia) nos dois grupos de sobrevivência foram testadas e comparadas. Os resultados univariadas são fornecidos na Tabela 2. Dos 13 genes candidatos, única MUC1, MSLN, MUC2 e tinha estatisticamente diferentes padrões de expressão entre os grupos. A tendência à significância foi observada com a perda SMAD4 (p = 0,09). diapositivos representativos marcadas com MUC1, MSLN e MUC2 aparecem na Figura 2.

MUC1

Foi observada uma forte associação entre o aumento da expressão da proteína MUC1 e sobrevivência curta (p 0,0001). Em toda a coorte, 15% dos pacientes tiveram uma pontuação IHC de 0, 23% tinham 1+, 33% tiveram 2+, e 30% tinham 3+. As proporções de pacientes que estavam no grupo sobrevivente curto em cada pontuação IHC separado aumentou de um modo linear (inclinação da regressão linear = 0,21, p = 0,002). Especificamente, 5% estavam no grupo de sobrevivência curta com uma pontuação IHC de 0, 29% com 1+, 49% com 2+, e 68% com 3+ (Figura 3A). O valor preditivo negativo foi alta (95%), como 19 dos 20 pacientes com expressão MUC1 ausente nesta coorte sobreviveram por mais de 30 meses.

MSLN

Em comparação com a expressão MUC1, o padrão de expressão MSLN na coorte total era ligeiramente ponderada em menor pontuação IHC: 63% dos pacientes tiveram 2+ ou 3+ rotulagem MUC1 enquanto 48% tinham rotulagem MSLN comparável (p = 0,02). No entanto, como MUC1, houve uma forte associação entre a expressão MSLN e mortalidade específica por câncer precoce (p 0,0001). Mais uma vez, foi observada uma relação linear entre a pontuação IHC e a proporção de doentes no grupo de baixa sobrevivência (inclinação da regressão linear = 0,20, p = 0,02). Nas diferentes categorias de pontuação IHC, a porcentagem de pacientes que estavam no grupo de sobrevivência curta foram os seguintes: 20% dos pacientes com uma pontuação IHC de 0, 35% com 1+, 49% com 2+, e 81% com 3+ (Figura 3B).

MUC2

MUC2 expressão foi associada com sobrevivência a longo em contraste com MUC1 e MSLN (p = 0,03). expressão MUC2 era incomum geral (15%) no PDA. sobreviventes de curto prazo expressa MUC2 em apenas 7% dos casos. sobreviventes de longo prazo expressa MUC2 em maior proporção, embora a expressão ainda era pouco frequente (22% dos casos).

Análise Multivariada

A análise de regressão logística multivariada foi realizado que incluiu preditores de biomarcadores univariadas significantes de sobrevivência (MUC1, MSLN, e MUC2), bem como as quatro características patológicas frequentemente referidos (Tabela 3). MUC1 e MSLN foram altamente significativas no modelo ajustado, enquanto MUC2 não era. Em comparação com expressão ausente, odds ratio associadas à expressão MSLN incrementais foram 1,7 (pontuação IHC = 1+), 2,6 (pontuação IHC = 2+) e 12,5 (pontuação IHC = 3+). Para MUC1, as odds ratio foram 10,1 (pontuação IHC = 1+), 11,9 (pontuação IHC = 2+) e 29,0 (pontuação IHC = 3+). Os valores de p compósitos para MSLN e MUC1 foram p = 0,01 e p = 0,004, respectivamente. Nenhuma das características patológicas convencionais foram estatisticamente significativas no modelo multivariado. Para testar se os valores prognósticos altos de MUC1 e MSLN eram meramente um artefato de uma comparação multi-camadas (pontuação IHC de 0 a 3+), o modelo multivariada foi repetido após a categorização de metástases linfáticas, de uma forma semelhante em camadas (negativo, 1 ou ≥ 2 metástases em linfonodos). odds ratio ajustada para os biomarcadores relevantes não foram alteradas; múltiplas metástases linfáticas, previu a sobrevivência pobre com um odds ratio de apenas 3,9 (p = 0,02).

Discussão

recorrência do câncer precoce e mortalidade após ressecção pancreática (dentro de um ano) permanecem experiências desanimadoras para médicos. Nesses casos, os pacientes com doença aparentemente “ressecável” têm grandes ressecções com “intenção curativa,” ainda não recebem qualquer benefício definível, ocasionalmente, com o custo de morbidade significativa ou mesmo a mortalidade. Nossos dados institucional sugere esse cenário ocorre em um quinto dos pacientes que se submetem à ressecção pancreática para PDA [30]. Por outro lado, alguns doentes com doença metastática têm cancros crescentes relativamente lentas, e pode beneficiar da redução metastasectomia ou citológica. Este cenário é extremamente incomum com PDA, ainda não há precedente para uma abordagem cirúrgica agressiva em pacientes selecionados com doença avançada, mas indolente [31]. Infelizmente, a presente abordagem para pacientes com PDA falha para integrar fatores biológicos. No presente momento, as características patológicas convencionais fornecer a melhor informação de prognóstico, ainda não são suficientemente fiáveis ​​para impactar as decisões de tratamento, como o presente estudo mostra.

Os estudos destinados a identificar marcadores prognósticos confiáveis ​​enfrentam dois desafios particulares. Em primeiro lugar, os determinantes extrínsecos de sobrevivência que são independentes de análises de perfil molecular confundem biomarcador de um tumor. Considere um cenário em que a diferença na sobrevivência global entre os dois pacientes após ressecção pancreática é de apenas 3 meses. A diferença de sobrevivência pode estar relacionada com o estado do paciente desempenho, fatores sociais, comorbidades médicas, resposta à quimioterapia, toxicidade do tratamento, complicações cirúrgicas, ou uma série de outras possibilidades. Cada um desses fatores pode minimamente contribuir para a sobrevida do paciente, e exigiria um estudo com grande poder estatístico para caracterizar completamente cada um. Além disso, estes fatores de sobrevivência não são normalmente associado com padrões de expressão de biomarcadores (resposta à quimioterapia e toxicidade pode haver exceções). O presente estudo minimiza o ruído de fatores alternativos e menos significativos de sobrevivência através da exclusão de pacientes com a sobrevivência intermediário (12-30 meses). Com exceção de casos raros, a biologia do tumor seria esperado para ser o principal motor de grupos de sobrevivência definidas por um intervalo de tempo dessa magnitude (um mínimo de 1,5 anos separa grupos de sobreviventes curtas e longas).

Foram identificados 20 outros estudos na literatura que analisaram proteínas biomarcadores usando TMAs de PDA (Tabela 4). Ao contrário do presente estudo, esses estudos baseados em TMA incluiu todos os pacientes em todo o espectro de sobrevivência, o que pode ser interpretado como um recurso de estudo positivo. Nenhum destes estudos identificou quaisquer biomarcadores com relevância clínica no PDA. Sugerimos que uma TMA sobrevivência pode ser mais adequado para investigações de descoberta de biomarcador em PDA, porque enfatiza a biologia do tumor. O tamanho da amostra no presente estudo compara favoravelmente com outros estudos TMA (quartil superior). Mais importante, este estudo provavelmente inclui o maior número de pacientes nos extremos de sobrevivência.

O segundo desafio para as pesquisas de biomarcadores de PDA com IHC é conceber uma estratégia racional para selecionar os melhores candidatos moleculares para o estudo. Há cerca de 30.000 proteínas humanas, e 10% têm sido relatadas como sobre-expressos em PDA [22]. IHC análises são limitadas pela quantidade de tecido disponível (um anticorpo por cada secção de TMA, e cerca de 30-50 por secções de bloco TMA), e, por conseguinte, um processo de selecção racional biomarcador candidato é necessário para seleccionar os biomarcadores mais práticos e promissores para o estudo. Normalmente, os investigadores projetar painéis de biomarcadores experimentais segundo, quer interesses de pesquisa, um artigo intrigante, ou um tema unificador, como um caminho molecular comum. Como a Tabela 4 ilustra, estudos anteriores TMA em PDA testar um pequeno número de anticorpos (mediana de 2 por biomarcadores estudo; gama, 1 a 18). Apenas dois estudos examinou mais de 4 anticorpos.

selecção de Biomarcadores no presente estudo foi baseado no repositório biomarcador recentemente publicado e centralizada para PDA [22]. A construção deste conjunto de dados foi um esforço enorme que exigia 7000 horas por pessoa (valor de trabalho quase um pessoa por ano). Os autores identificaram cada estudo na literatura que ligada de um gene ou proteína para o PDA, e, em seguida, o gene tabulados índice (ou proteína), os principais ensaios envolvidas no estudo, e a referência relevante. principal objetivo dos autores foi a “desenvolver um compêndio de biomarcadores potenciais que poderiam ser sistematicamente validados pela comunidade câncer de pâncreas” [22]. Colocando seu desafio à ação, analisamos este grande conjunto de dados usando um algoritmo (detalhado na Figura 1) [22] que colocou aumento da importância ou peso sobre o número de relatórios anteriores que ligam um determinado biomarcador para PDA. Um total de 13 biomarcadores foram identificados utilizando esta estratégia de seleção e anticorpos correspondentes foram testados contra o S-TMA.

Análise

IHC revelou que 10 dos the13 candidatos eram não-informativa como marcadores prognósticos nesta coorte estudo. Estas observações fornecem evidências convincentes negativos (com a excepção de que perdeu SMAD4 significado estatístico, P = 0,09) que este grupo de biomarcadores de cancro do pâncreas putativos são clinicamente irrelevante para o prognóstico. Na análise univariada, MUC1 e expressão MSLN foram associados com a biologia agressiva do câncer (ou seja curta grupo sobrevida) e expressão MUC2 foi associado com a biologia favorável (ou seja, grupo sobrevivência a longo). Apenas MUC1 e MSLN foram fatores prognósticos robustos no modelo multivariado, o ajuste para características patológicas convencionais (Tabela 3). Difusa MUC1 e expressão MSLN foram altamente preditivos de sobrevivência curta (as odds ratio foram 12,47 e 28,95, respectivamente). Curiosamente, os quatro testes de patologia padrão tinha odds ratio inferior a 3, e nenhum alcançou significância estatística no modelo multivariado. Uma análise ROC foi realizada para estimar a precisão da previsão de três modelos multivariados diferentes para distinguir grupos de sobrevivência a curto e longo (biomarcadores única, apenas características patológicas, e uma combinação de biomarcadores e características patológicas). Uma tendência no sentido de exactidão preditivo superior foi observada com o painel de marcadores moleculares (MUC1, MSLN, e MUC2) ao longo de características patológicas convencionais (AUC = 0,81 vs. 0,70; p = 0,07). Estes dados sugerem que os biomarcadores podem realmente fornecer uma visão mais prognóstico do que os dados de prognóstico padrão incluídos em relatórios de patologia.

Este estudo valida MUC1 e MSLN como biomarcadores da agressiva biologia do câncer pancreático. As implicações destes resultados devem ser interpretados no contexto do desenho do estudo, bem como o papel destas proteínas como marcadores prognósticos no manejo clínico de PDA permanece incerto. Embora cada oncoproteína tem sido o foco de mais de 200 estudos em PDA, não há estudos em grande escala de amostras de tumores que examinaram-los bem como biomarcadores de prognóstico que utilizam um sistema de pontuação IHC graduada comparáveis. Alguns estudos anteriores observaram diferenças de sobrevivência associados a tumores que expressam altos e baixos (MUC1 ou MSLN), mas são limitados pelo pequeno tamanho das amostras, a ausência de sistemas de pontuação IHC em camadas, e as estatísticas não ajustados [32] – [34].

Alguns biomarcadores incluídos no estudo tinham padrões de expressão que diferiam dos relatórios anteriores. Por exemplo, a expressão MSLN (1+ ou superior) foi observada em 71% dos pacientes com PDA no presente estudo (quando comparado com 85-100% em estudos anteriores [32], [35]) e expressão MUC4 (1+ ou maior) foi observada em 55% (em comparação com 90% em estudos anteriores [36], [37]). As diferenças entre este estudo e os anteriores pode estar relacionado com provar variabilidade do tamanho (estudos anteriores eram menores) e seleção dos pacientes (do presente estudo é enriquecido com pacientes nos extremos de sobrevivência). Estamos no processo de validar os resultados do presente estudo em um grande conjunto de dados que inclui pacientes em todo o espectro de sobrevivência. Além disso, as diferenças na pontuação imuno são importantes. Por exemplo, estudos anteriores de MSLN MUC4 e rotulagem definido como positivo reactividade do anticorpo focal em mais do que 1% de células cancerosas [35], [36], enquanto que o presente estudo requerido, pelo menos, 10% das células para uma contagem de IHC 1+ .

as implicações desta pesquisa se estender além de uma melhor avaliação prognóstica de amostras de tumores e, portanto, a utilidade da estratégia de s-TMA não é inteiramente dependente de estudos de validação com grande número de pacientes não selecionados. Em primeiro lugar, a descoberta de biomarcadores com base na sobrevivência extremos é útil para priorizar os genes do câncer de investigação diagnóstica e terapêutica. Uma vez que as células cancerosas biologicamente mais agressivas são tipicamente refratária aos agentes convencionais, é lógico que as novas abordagens de tratamento que visam especificamente as sub-clones agressivos são particularmente atraentes e merecem uma investigação mais aprofundada. Em suporte deste conceito, o NCI identificou MUC1 e MSLN entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de vacina para o cancro, com a ex-proteína listadas no topo de três [38]. Um anticorpo monoclonal radiomarcado contra MUC1 também foi recentemente avaliada em uma fase I /II julgamento, com um processo planejado de fase III a seguir [39], [40]. Além disso, a terapia genética do cancro orientada por promotor que explora overactive promotores MUC1 e MSLN em vários tipos de cancro tem sido extensivamente estudada em modelos de cancro da pré-clínicos utilizando vectores virais [41] – [43]. No momento, estamos buscando uma abordagem de terapia genética orientada por promotor contra o PDA usando, um vetor polímero biodegradável não-viral para entregar nanopartículas tóxicos [16].

Além disso, tanto MUC1 e MSLN estão presentes na superfície celular a com isoformas secretadas. Assim, os indicadores de prognóstico, tais como estes são potencialmente detectável no soro ou fluidos segregados.