Abstract

Um número crescente de doenças malignas foi mostrado para ser iniciado e impulsionado por pequenas subpopulações de células-tronco cancerosas (CSC). No entanto, se a agressividade do tumor é impulsionado pela CSC e por que ponto esta propriedade pode ser relevante dentro da massa do tumor ainda é instável. Para abordar esta questão, nós isolamos uma população de células tumor raro, com base em sua CD44

+ CD24

– fenótipo da linha celular humana independente de androgénios carcinoma da próstata DU145 e estabeleceu suas propriedades CSC. O comportamento de CSC seleccionado foi investigado no que diz respeito às células DU145 granel. A injecção de CSC em ratinhos nus gerado tumores altamente vascularizadas que se infiltram nos tecidos adjacentes, com elevada densidade de células neuroendócrinas e que expressam níveis baixos de E-caderina e β-catenina, bem como níveis elevados de vimentina. Pelo contrário, quando um número comparável de células DU145 não ordenados foram injectados os tumores resultantes eram menos agressivos. Para investigar as diferentes características de tumores

in vivo

, a influência das células tumorais diferenciadas sobre CSC foi examinado

in vitro

pela crescente CSC na ausência ou na presença de meio condicionado de células DU145. CSC cultivadas em condições permissivas diferenciadas em populações de células com características semelhantes às de células realizada em tumores agressivos gerados a partir da injecção CSC. Diferentemente, o meio condicionado induziu CSC para se diferenciarem em um fenótipo celular comparável às células de tumores pouco agressivas originado a partir da injecção de células DU145 grandes quantidades. Estes resultados mostram pela primeira vez que a CSC são capazes de gerar células diferenciadas que expressam quer altamente agressivo ou mal fenótipo, influenciando assim a progressão do cancro da próstata. O destino de CSC foi determinada por sinais libertados a partir ambiente tumoral. Além disso, usando a análise de microarray selecionamos algumas moléculas que poderiam ser envolvidos neste sinalização célula-célula, levantando a hipótese de o seu valor potencial para aplicações de prognóstico ou terapêutica

Citation:. Salvatori L, Caporuscio F, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR, et al. Sinalização (2012) Cell-to-Cell Influencia a Fate of Prostate Cancer Stem Cells e seu potencial de gerar tumores mais agressivos. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10.1371 /journal.pone.0031467

editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |

Recebido: 8 de junho de 2011; Aceito: 09 de janeiro de 2012; Publicação: 06 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Salvatori et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Ministério da Saúde italiano (PRIN 2006062242). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma da próstata (PCA) é um líder. causa de morte entre os homens nos Estados Unidos e Europa Ocidental United [1]. Devido ao seu crescimento dependente de androgénios, ablação hormonal continua a ser o principal tratamento da doença metastática. Embora inicialmente eficaz, este tratamento é seguido em poucos anos de recorrência do tumor [2] em que um neuroendócrino (NE) subpopulação independente de androgénios de células é pensada para desempenhar um papel importante [3], [4]. células de NE são células quiescentes, terminalmente diferenciadas caracterizadas por processos dendríticos estendendo-se entre as células adjacentes e por a expressão das proteínas neuronais semelhante, tais como CD56 e cromogranina A (CGA) contidos nos grânulos densos citoplasmáticos [5]. Através da secreção de neuropeptídeos células NE modular a actividade do epitélio da próstata normal, mas também é capaz de influenciar as células epiteliais transformadas adjacentes através de sinais parácrinos, estimulando assim o crescimento do tumor e a capacidade metastática [5] – [7]. De facto, um aumento da população de células NE em PCA é pensada para ser associada com uma doença mais agressiva, enquanto que um baixo número de células de NE em tecido tumoral não têm significado prognóstico específica [6], [8], [9]. Curiosamente, ambos NE e linhagem epitelial secretório são derivadas de uma célula estaminal pluripotente comum da próstata [10].

Um outro mecanismo básica envolvida na progressão da PCA é a diminuição da expressão de E-caderina, a molécula transmembranar adesão página responsável por interações célula-célula e organização do tecido em células epiteliais [11], [12]. Através do domínio citoplasmático, que se liga β-catenina, o que influencia o arranjo do citoesqueleto [13]. Como consequência, a perda de função de E-caderina ou expressão é considerado um evento importante na perturbação de adesão célula-célula e arquitectura do citoesqueleto e na aquisição de um fenótipo invasivo em células tumorais [14]. Em particular, no APC, menor expressão de E-caderina foi associado a mais estágio do tumor avançado e grau [15], [16]. Mal diferenciado da próstata tumores também mostraram maior expressão de vimentina, um componente do citoesqueleto responsável por manter a integridade das células, e elevados níveis de vimentina correlacionada com a capacidade invasiva de linhas celulares de cancro da próstata, incluindo DU145 [17].

Tradicionalmente, Os tumores foram considerados para ser composta de células heterogéneas com proliferativa comparável ilimitada e potencial tumorigénico. No entanto, recentemente, tem sido a hipótese de que apenas as células raros dentro do tumor, cancro de células estaminais nomeados (CSC), são capazes de proliferar extensivamente e são tumorigénicas, ao passo que a maioria das células na massa do tumor mostrar um grau variável de diferenciação e passam por um número limitado de divisões. A sua contribuição para o crescimento do tumor e Metastatização é considerado ser bastante limitada. Importante, este modelo implica a necessidade de uma nova abordagem terapêutica especificamente voltado para o CSC na tentativa de erradicar o tumor definitivamente [18]. No entanto, se a agressividade do tumor é impulsionado pela CSC e por que ponto esta propriedade pode ser biologicamente relevante dentro da massa tumoral que ocorre naturalmente ainda é instável.

Como a presença de CSC em ACP [19] e linhas celulares de cancro da próstata [20] foi recentemente demonstrado com base no perfil antigénico superfície CD44

+ /α

2β

1

oi /CD133

+ e CD44

+ CD24

– , respectivamente, no presente estudo teve como objetivo avaliar a contribuição da CSC à progressão do tumor. Nós isolado CD44

+ CD24

– as células cancerosas a partir da linha de células de câncer de próstata independente de androgénios DU145 derivada de uma metástase cerebral do CaP humana como caule, mostrou suas propriedades CSC, e investigados seu fenótipo e do comportamento em relação ao as células DU145 grandes quantidades. É importante salientar que, neste modelo de cancro da próstata observa-se que a CSC foram capazes de gerar tumores altamente agressivos em NOD /SCID e que este potencial foi limitada pela presença de células DU145 diferenciados, com o consequente crescimento de tumores menos agressivos. Consistentemente, por CSC crescimento em meio condicionado a partir de células DU145

in vitro

, revelámos que factores difusíveis libertados a partir de células tumorais diferenciadas foram capazes de reprimir a CSC de diferenciação em populações de células que mostra um fenótipo agressiva e com características semelhantes às de células mantidas em tumores gerados em murganhos da injecção de CSC. Finalmente, a análise funcional de genes que se encontram expressos diferencialmente em células DU145 e CSC por análise de microarray confirmou o papel essencial de moléculas de sinalização célula-a-célula para determinar o comportamento de CSC. Outras investigações também se apresentou em outros modelos de câncer de próstata pode atribuir valor prognóstico ou terapêutica para essa assinatura.

Resultados

Isolamento e caracterização de CSC a partir de células de câncer de próstata DU145

DU145 as células foram enriquecidas por células activadas por fluorescência (FACS) para a população que expressa CD44

+ CD24

– [20], que representa cerca de 10% de células DU145 granel (Figura 1A). Testamos as propriedades estaminais-como de células selecionadas para descrevê-los, indiscutivelmente, como próstata CSC. Uma porcentagem muito pequena de CD44

+ CD24

– células isoladas foi capaz de gerar agrupamentos esféricas não aderentes, esferóides ou prostaspheres denominadas, em meio isento de soro suplementado com EGF, bFGF e insulina (substituição meio de soro, SRM ). Esferóides cresceram muito lentamente, atingindo o tamanho de cerca de 300 um dentro de 6-8 semanas (Figura 1B). Como esperado, os esferóides foram enriquecidas em CD44

+ CD24

– células, como determinado tanto por imunofluorescência (IF) de coloração (dados não mostrados) e análise quantitativa PCR em tempo real (Q-PCR), com resultados comparáveis. De facto, em esferóides de ARNm de CD44 foi expressa em níveis semelhantes aos células DU145, ao passo que a expressão de CD24 foi significativamente mais baixa (Figura 1C).

(A) Análise FACS da expressão de CD44 e CD24 em células DU145. (B) Cultura de isolados CD44

+ CD24

– células que crescem em SRM prostaspheres como não aderentes (5 × objetivo). (C) Q-PCR da expressão de CD44 e de CD24 em células de esferóides e DU145. Os dados são apresentados como média ± EPM de 3 experiências. *,

p Art 0,05

vs células DU145

. (D) A capacidade de auto-renovação de esferóides. suplementação de soro e à retirada de factores de crescimento induzem o crescimento de células como células aderentes esferóides com morfologia (E), a taxa de proliferação (F) e a expressão da vimentina (L) comparáveis ​​às células DU145. De fotografias de células esferóides foram tiradas com um microscópio de contraste de fase após 10 e 20 dias de crescimento em meio contendo FBS (20 ×). Os Western blots representativos mostram a expressão de vimentina e β-actina em células esferóides cultivadas em meio suplementado com FBS em relação ao controlo esferóides e células DU145. O histograma apresenta a quantificação densitométrica da vimentina normalizadas para os níveis de p-actina. Os valores são expressos como média ± EPM de 3 experiências independentes. (H) a incidência de tumores e latência após a injeção de um esferóide, 5.000 ou 3 × 10

6 DU145 células em NOD /SCID.

Spheroids contidas células auto-renovação de longo prazo, como demonstrada pela capacidade de uma fracção de células a partir de esferóides dissociados para gerar novas prostaspheres durou mais de 5 passagens (Figura 1D).

observou-se que células de esferóide exibida capacidade de diferenciação. Na verdade, quando removidos dos factores de crescimento e expostos a 10% de FBS contendo meio, uma fracção significativa de células esferóides tornou-se aderente, cresceu como uma monocamada plana, apresentando uma morfologia heterogénea altamente semelhante às células DU145 após 20 dias (Figura 1E). Nos primeiros dias de crescimento nestas condições permissivas, as células esferóides mostrou um tempo de duplicação de cerca de 50 h que diminuiu progressivamente até a taxa de proliferação de células DU145, ou seja, 30 h, a partir de 15 dias de cultura (Figura 1F). Além disso, para confirmar o aparecimento do fenótipo de células cancerosas diferenciada DU145 analisou-se a expressão da vimentina proteína de filamento intermédia. De facto, a expressão de vimentina tem sido relatada a ser modulada durante a maturação de células de acordo com a linhagem de células [21] e verificou-se altamente expressa em linhas celulares DU145 [17]. médio, na verdade, depois de 20 dias de suplementado com FBS, as células vimentina-negativos derivados de esferóides expressas vimentina em níveis comparáveis ​​às células DU145 (Figura 1G).

Por fim, determinou-se a capacidade de produção de tumor de células esferóides com respeito às células DU145 não ordenados em ratinhos imunodeficientes. A injecção de um esferóide de 300 um de diâmetro, contendo aproximadamente 5000 células, resultou em tumores em 80% dos ratinhos, enquanto que os tumores a injecção de 5.000 células DU145 granel gerado em 40% dos animais (Figura 1H). Além disso, a latência do tumor foi também menor nos ratinhos injectados-esferóides do que em ratinhos injectados com células não separados (37 e 54 dias, respectivamente). A injecção de 3 × 10

6 DU145 células, as quais foram utilizadas como controlos, os tumores com a menor latência em todos os ratos gerados. Consistente com um relatório anterior [20], todos juntos nossos resultados indicam que CD44

+ CD24

– células esferóides presente propriedades biológicas fundamentais da CSC, uma vez que mostrou capacidade de auto-renovação, foram capazes de se diferenciar em células DU145 parentais e foram mais tumorigénico de células DU145 granel quando o mesmo número de células foi injetado em ratos.

composição heterogênea de esferóides

spheroids até 300-400 m de diâmetro mostrou uma arquitetura compacta (Figura 2A), devido à presença de contactos muito apertadas célula-a-célula, como visto na Microscopia Electrónica de Transmissão (MET). ampliação de alta potência mostrou vários complexos juncionais formadas por desmossomos e junções aderentes (Figura 2B). células esferóides também apresentou complexos poro nuclear organizados em anelado lamelas (Figura 2C), que são considerados precursores na montagem do envelope nuclear. Eles estão tipicamente presentes em células embrionárias e imaturos e desaparecer durante a diferenciação [22]. No entanto, esferóides também conter células diferenciadas que, nestas condições de cultura selectivas para células estaminais, mostraram vários níveis de degradação celular. Em particular, bolhas citoplasmáticas característicos foram evidente (Figura 2D), indicando que a fase degradantes aproximou necrose celular (Figura 2F), enquanto que na maior parte núcleos apareceu intacta (Figura 2E). Estes danos sugerem o destino do terminal de células diferenciadas. Avaliação

(A) O contraste de fase da estrutura esferóide (10 ×). Análise (B) TEM mostrando desmossomas e junções aderentes (superior e inferior, respectivamente), bem como o lamelas anelares (C) em células de esferóides. (D) O contraste de fase (20 ×) de um fragmento de esferóide rodeado por células caracterizadas por saliente bolhas de citoplasma vazio, que apresentam núcleos intactos, como mostrado por coloração com DAPI (40 ×, E). (F) A coloração com azul de tripano mostra a presença de células mortas em esferóides (10 ×). imunofluorescência de uma seção de esferóides e células DU145 (aumento original x 200), mostrando a expressão da caderina-E (G), β-catenina (H) e vimentina (I).

Spheroids e células DU145 foram também avaliadas para a expressão de marcadores de haste (e-caderina e β-catenina [23] – [25]) e células diferenciadas (vimentina). imunofluorescência identificados de E-caderina e β-catenina em ambas as populações de células, mas em níveis mais elevados em esferóides (Figuras 2G e 2H, respectivamente). Notavelmente, em células esferóides E-caderina e coloração β-catenina foi localizada na membrana plasmática, enquanto que em células DU145 foi principalmente citoplasmática, indicando que as células tumorais diferenciadas foram bastante independente das interacções célula-a-célula. O fenótipo maduro de células DU145 foi acompanhada de uma elevada expressão de vimentina, que, pelo contrário, foi expresso apenas por células raras em esferóides (Figura 2I). Portanto, podemos concluir que esferóides são enriquecidos por CSC, mas também realizou algumas células diferenciadas danificadas destinado a necrose.

Análise de tumores cultivados em ratinhos

Comparando tumores gerados no NOD /SCID após a injeção de 1 esferóide (contendo cerca de 5.000 células totais, considerando tanto CSC e células diferenciadas danificados) 5.000 células DU145 não triados (que contém principalmente células diferenciadas e uma porcentagem muito pequena de CSC) ou, várias diferenças macroscópicas foram evidentes no momento da retirada do tumor. Os tumores dos esferóides cresceu profundamente no local da injecção, invasão dos tecidos adjacentes e mostrou vascularização acentuada. Diferentemente, tumores originários de injeção de células DU145 cresceu superficialmente e apareceu bem delimitado e móvel em relação aos tecidos circundantes. vasos visíveis eram raros ou ausente (dados não mostrados).

Estas diferenças foram confirmadas por análise histológica. tumores esferóides derivado eram compostas por células monomórficas com uma alta taxa de núcleo /citoplasma e apresentou um crescimento acentuado infiltrativa caracterizado por bandas invadindo o cercam musculares e tecidos adiposos (Figura 3A, painel esquerdo). Pelo contrário, os tumores gerados a partir de células DU145 não ordenados foram compostas de sub-populações morfologicamente heterogéneas de células e mostrou um crescimento expansivo, comprimindo, em vez de se infiltrar nos tecidos do hospedeiro adjacentes (Figura 3A, painel da direita). Curiosamente, os tumores altamente invasivos apresentaram menor expressão de E-caderina e β-catenina e maior expressão de vimentina, quando comparados com os tumores pouco invasivas (Figura 3B). Notavelmente, em cada tumor o padrão de expressão destes marcadores foi 3 oposta à das células que deram origem ao próprio tumor, nomeadamente células CSC ou DU145 (Figuras 2G-2H).

(A) coloração histológica com H e de tumores cultivadas depois da injecção de um esferóide ou 5.000 células DU145 mostrando altamente invasiva (painel esquerdo) e do fenótipo invasivo scantly (direita) (5 x). Os asteriscos indicam as fronteiras entre tumores e tecidos circundantes. (B) Western blots representativos que mostram a expressão de E-caderina, β-catenina e vimentina em tumores. (C) A coloração por IHC com anticorpos anti-ratinho CD31 destacando maior densidade de vasos em tumores esferóides-derivado (indicado por asteriscos, painel da esquerda) em comparação com tumores de células DU145 (direita). (D) Q-PCR que mostra a expressão de CD31 em tumores do rato. B2M rato foi usado como controlo endógeno. Os valores são média ± SEM de 3 experiências. *,

P

0,05 relativamente aos tumores gerados a partir de esferóide. (E) IHC com anticorpos anti-CD56 que mostra uma maior densidade de células de NE em tumores gerados a partir de esferóide a partir de células DU145 (20 ×). (F) Q-PCR visualizadas nível de ARNm CGA em tumores. Os resultados são expressos como proporções entre o gene-alvo e o controlo GAPDH endógena e representam a média ± SEM de 3 experiências independentes. *,

P

0,05 em relação aos tumores gerados a partir de esferóide. (G) Um representante análise de FACS mostrando a presença de CD44

+ CD24

– células em tumores gerados a partir da injecção de um esferóide em ratinhos. Tumores provenientes da injecção de 5.000 células DU145 mostrou um CD44 comparável

+ CD24

– população de células (dados não mostrados)

tumores gerados a partir de esferóides mostrou também um maior número significativo de. vasos sanguíneos (

P

0,0001), conforme verificado por coloração com o CD31 endotelial marcador de células (Figura 3C, esquerda), quando comparados com os tumores originados a partir de células DU145 (Figura 3C, à direita). Estes resultados foram confirmados pela análise do nível de expressão de ARNm de CD31 (Figura 3D) e indicam activo neoangiogénese em tumores gerados a partir de esferóides. Além disso, a análise imuno-histoquímica (IHC) mostrou um maior número de células positivas para CD56, um marcador de células NE, em tumores invasivos mais do que em tumores menos invasivos (Figura 3E). Esta observação foi confirmada por análise em tempo real de PCR CGA, um outro marcador de células NE (Figura 3F). Além disso, a análise FACS de tumores extirpados e digeridos revelou que ambos os tipos de neoplasia continha um CD44

+ CD24

comparáveis ​​- população de células (Figura 3G). Estes resultados fornecem evidências de que a CSC foram capazes de gerar tumores altamente invasivos em ratinhos nus. No entanto, a injecção de células tumorais com CSC DU145 diferenciado (isto é, injecção de células DU145 não separados) resultou no crescimento de tumores de baixo grau de agressividade.

efeito do meio condicionado de células DU145 na diferenciação de CSC

Tendo em conta as conclusões acima referidas, foi investigada a influência de células diferenciadas DU145 on selected CD44

+ CD24

– próstata CSC

in vitro

. esferóides dissecados foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS (para simular a injecção de esferóides em ratinhos) ou em DMEM suplementado com FBS em que as células DU145 foram previamente crescidas durante 3 dias (meio condicionado (CM), para simular a injecção de células DU145 grandes quantidades em ratinhos). Em ambas as condições de cultura, a CSC contido em esferóides cresceu em monocamada, mas a sua proliferação foi significativamente reduzida quando eles foram cultivadas durante 20 dias em CM (-47%; Figura 4A). A inibição da proliferação de esferóide foi ainda mais melhorada aumentando a concentração de CM (dados não mostrados). Além disso, verificou-se muito evidente que as células cultivadas em FBS contendo meio foram bastante independente das interacções célula-célula enquanto cresceram principalmente individualmente ou em pequenos grupos, com forma irregular, e a sua morfologia e padrão de crescimento foram semelhantes aos de DU145 células (Figura 4B, painel esquerdo). Pelo contrário, as células cm foram apertados uns aos outros e cresceu ilhas principalmente como arredondados (Figura 4B, painel da direita). Curiosamente, após 20 dias e apenas nas placas contendo o meio suplementado com FBS, observou-se o aparecimento de células exibindo a morfologia dendrite semelhante típica de células NE (Figura 4B, painel esquerdo e a Figura 4C). A identidade destas células foi confirmada pela avaliação da expressão de CD56 nos grânulos citoplasmáticos de células de NE (Figura 4C, painel da direita). A análise da expressão de marcadores de células diferenciadas e haste realçado que depois de 20 dias em meio contendo FBS, as células exibiram níveis de E-caderina, β-catenina e vimentina comparáveis ​​aos apresentados por células DU145 (Figura 4D). Pelo contrário, as células cultivadas durante 20 dias em CM exibiram níveis de expressão intermédios entre aqueles mostrado pelo controle de CSC e células DU145, mas mais perto dos níveis de CSC. Em particular, uma redução na expressão de E-caderina e β-catenina e um ligeiro aumento no nível de vimentina no que diz respeito a controlar esferóides foi evidente (Figura 4D). É de interesse notar que tanto a alta expressão de moléculas de adesão e a baixa expressão da vimentina indicou fortes interacções célula-a-célula e reduzir a motilidade celular, respectivamente, o qual concordou muito bem com o crescimento celular peculiar como ilhas. Estes resultados indicam que a CSC cultivadas em condições permissivas foram capazes de gerar células terminalmente diferenciadas, nomeadamente células DU145 e NE. No entanto, factores difusíveis libertados a partir de células DU145 impediu a diferenciação de CSC.

(A) A proliferação de CSC contido em esferóides cultivadas em meio contendo FBS ou em CM a partir de células DU145 foi avaliada em diferentes tempos de cultura. Os dados são apresentados como a média ± SEM de 3 experiências. Os asteriscos indicam um efeito inibidor significativo de CM no que diz respeito ao meio de FBS (*,

P

0,05). (B) O contraste de fase (10 x) de células após 20 dias em meio contendo FBS ou em CM mostrando o padrão diferente de crescimento celular. No painel da esquerda, o rectângulo destaca a presença de células NE. (C) O contraste de fase (esquerda, 20 ×) e se a coloração (direita, 40 ×) de células NE ramificada gerados a partir CSC cultivadas em FBS médio. Em particular, o painel da direita mostra a expressão de CD56 no citoplasma e nos processos celulares longos. (D) As transferências de Western representativa mostrando as alterações na expressão de E-caderina, β-catenina, e vimentina em esferóide CSC cultivadas em diferentes condições de cultura no que diz respeito a controlar esferóides e células DU145. Os níveis de expressão das 3 proteínas foram determinadas por análise densitométrica das bandas respectivas e normalizadas para os níveis de p-actina. Valores reportados nos histogramas são a média ± SEM de 3 experiências independentes.

Perfil

A expressão gênica da CSC e células DU145

Para investigar a resposta celular envolvidos na tumorigênese, tanto a nível de a expressão do gene e a nível de splicing de pré-ARNm, foi realizado um conjunto do genoma, análise de microarray sensível ao splicing de células DU145 e o seu CSC seleccionado. As amostras de ARN preparadas a partir de cada população de células foram hibridadas com Exão Humana 1,0 ST matrizes, que permitem a definição de ambos os padrões de transcrição (análise ao nível do gene) e eventos de maturação de pré-ARNm alternativa (análise ao nível de exão). De nível Gene perfil de expressão foi detectada pelas estatísticas modelo linear usando um método de Bayes empírico para moderar os erros padrão. Para avaliar as modificações da transcrição, analisamos as mudanças de expressão gênica em esferóide CSC

vs células

DU145. Para identificar genes diferencialmente expressos, foi aplicado um log absoluta mudança

2 vezes ≥ +/- 1 e um P-value≤0.05 como cortes. A complexidade do conjunto de dados foi reduzido por remoção dos conjuntos de sondas não significativas (aqueles que não expressa e aqueles que não mudando). Desta forma, mais de 400 genes cujos níveis eram significativamente diferentes em CSC e foram seleccionadas células DU145. Uma lista completa dos genes diferencialmente expressos é encontrado na Tabela S1.

Análise dos genes selecionados

Os genes diferencialmente expressos foram analisados ​​para as suas funções moleculares e celulares e vias associadas usando a Análise Ingenuity Pathways software (IPA 7.0, Ingenuity Systems). A análise IPA identificou mais de 70 classes funcionais, e entre eles, foram selecionadas as 8 classes mais consistentes encontrados enriquecido dentro do conjunto de genes diferencialmente expressos (ou seja, câncer, movimento celular, crescimento e proliferação celular, morfologia celular, a morte celular, celular desenvolvimento, do ciclo celular, a sinalização célula-a-célula e interacção; Figura 5A) que eram adequados para caracterizar células CSC e DU145. Nós combinamos os genes das 8 classes funcionais selecionados, detectando 22 genes comuns ainda mostrando ligações funcionais. Estes foram em seguida separados de acordo com a sua localização celular. Curiosamente, uma análise dos genes da sub-seleccionado mostrou que 17 dos 22 produtos de genes foram localizadas na membrana plasmática ou foram segregadas no espaço extracelular (Figura 5B), fortalecendo as nossas descobertas anteriores que mostram a importância das interacções entre CSC eo microambiente. Embora os genes seleccionados proteínas codificadas com uma ampla variedade de funções, 4 grupos principais podem ser identificadas: 1) factores pró-angiogénicos angiopoietina 2 (ANGPT2), vasculares factor de crescimento endotelial C (VEGFC) e rica em cisteína indutor angiogénico 61 (Cyr61) foram encontrados regulada para baixo em relação à CSC com células DU145; 2) Os genes que codificam moléculas de adesão E-caderina (CDH1), integrina beta 6 (ITGB6) ea junção placoglobina (JUP) foram expressos mais no CSC, de acordo com o paralelo down-regulação da proteína cavéolas (CAV1); 3) os genes supressores de tumor lipocalina 2 (LCN2), peptidase-4 dipeptidil (DPP4), proteína de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina 3 (IGFBP3), tioredoxina interagindo proteína (TXNIP) e Kruppel-like factor de 4 (KLF4) foram supra-regulados no CSC; 4) difusível factores relevantes na manutenção de células estaminais nicho, tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), a proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e factor de crescimento transformante beta 2 (TGFB2) também foram expressos de forma diferente em células DU145 e CSC. Notável, 19 dos 22 genes que identificamos anteriormente não foram descritas a serem anormalmente expressa na próstata CSC. Estes dados confirmam que as interacções com o microambiente têm um papel crucial no controlo do fenótipo de CSC e sugerem um número limitado de genes cuja relevância na sinalização CSC terá de ser investigada. Além disso, a maioria dos 22 genes identificados podem ser novos marcadores de próstata CSC.

(A) seleccionado de topo 8 funções biológicas encontrados enriquecido dentro do conjunto de transcritos modulados em CSC em relação ao número total de células DU145 por análise de microarray. (B) Os 22 genes desregulados, como determinado pelo IPA, é posicionado em layouts subcelulares, e as relações são marcadas por setas: Setas linha preenchida e tracejadas marcar interacções directas e indirectas, respectivamente. Genes em vermelho mostraram aumento da expressão na CSC, enquanto os genes em verde foram regulados negativamente. (C) diferenças de expressão do gene em determinados por análise de microarray foram confirmados por Q-PCR, escolhendo 7 genes representativos seleccionados entre 22. Os resultados são expressos como a relação entre cada gene alvo e o controlo GAPDH endógena. Expressão em CSC foi comparado com o que foi observado em células DU145 ao qual um valor igual a 1 foi arbitrariamente atribuído. Os valores são média ± SEM de 3 experiências. *,

p Art 0,05 em relação a células DU145

Validação da expressão do gene

Para confirmar as diferenças na expressão dos genes encontrados por análise de microarray, Q-. O PCR foi realizado durante 7 genes diferencialmente expressos (CDH1, Cyr61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). Em todos os casos, as diferenças nos níveis de ARNm foram confirmados (Figura 5C).

papel da via de E-caderina na diferenciação de CSC

análise Q-PCR mostrou que a expressão do mRNA de lipocalina 2 e e-caderina seguiu uma tendência comparável em CSC, células DU145 e na CSC cultivadas durante 20 dias em FBS contendo meio ou no CM. Em particular, os níveis de ARNm de ambos os genes foram muito elevados em CSC contido em esferóides, foram reduzidos em CSC cultivadas em CM e eram significativamente mais baixa e comparável em CSC cultivadas em FBS a médio e em células DU145 (Figura 6). Esta tendência foi, de acordo com a modulação da expressão β-catenina anteriormente observada nas mesmas condições de cultura (Figura 4D). Colectivamente, estes resultados indicam que o caminho da E-caderina foi modulada durante a diferenciação CSC.

Q-PCR mostrando as mudanças nos níveis de mRNA para lipocalina-2 e E-caderina nas células DU145, CSC contido em esferóides de controle, e CSC cultivadas durante 20 dias em FBS a médio ou CM a partir de células DU145. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências individuais. Os asteriscos indicam uma diferença significativa (*,

p Art 0,05).

Discussão

tumorigenicidade de próstata CSC

CD44

CD24 +

– células isoladas de linha celular de carcinoma da próstata DU145 usar marcadores de superfície celular foram capazes de crescer como esferóides não aderentes em meio isento de soro suplementado com factores de crescimento específicos. Como resultado da divisão de células estaminais esferóides assimétricas foram enriquecidas em células estaminais cancro (CSC), mas também realizada uma percentagem de células diferenciadas que se aproximam necrose. Deve notar-se que a CSC eram capazes de sofrer divisão assimétrica também

in vivo

porque após a injecção em ratos, ambos produzidos células diferenciadas que constituíam a massa do tumor, e se auto-renovar como demonstrado pela presença de CD44

+ CD24

– células em todos os tumores extirpados

a diferença marcante na capacidade tumorigénica foi mostrado pelas diferentes incidência e latência dos tumores originários de esferóide CSC ou injeção de células DU145, com o primeiro. população de células a ser mais tumorigénico. Sugere-se que o atraso na formação de tumores após a injecção de 5.000 células DU145 poderia ser atribuído ao número insignificante de CSC realizada em células DU145 injectados em comparação com a quantidade de CSC enriquecido contido em cada esferóide. Estas conclusões e esta sugestão foram ainda confirmadas pela injeção de 3 × 10

6 DU145 células, que detinha uma quantidade maior de CSC de 1 esferóide e geraram tumores em apenas 1 semana

.

É importante ressaltar que quanto mais