Abstract
As causas moleculares pelos quais o crescimento epidérmico tirosina quinase do receptor do factor induz a transformação maligna são em grande parte desconhecido. Para melhor compreender a capacidade de transformação inteiros varreduras genoma EGFs foram aplicadas a um modelo de ratinho transgénico de cancro do fígado e submetidos a métodos avançados de análise computacional para construir redes reguladoras de genes de novo à base de uma combinação de análise de sequência e algoritmos de gráfico-topológico arrastadas. Aqui nós identificaram factores de transcrição, os processos, os nós principais e moléculas que interagem para ligar parceiros ainda desconhecidos ao nível da interacção ADN-proteína. Muitos daqueles pode ser confirmada por ensaio de desvio de bandas electromobilidade em locais de reconhecimento de promotores específicos do gene e por western blotting de proteínas nucleares. Um novo circuito de regulação celular pode, portanto, ser proposto que liga os genes regulados pelo ciclo celular, com componentes da via de sinalização de EGF. análise promotor de genes diferencialmente expressos sugeriu que a maioria dos factores de transcrição regulados para exibir especificidade quer ao pré-tumor ou o estado do tumor. Subsequente pesquisa para os nós principais de transdução do sinal a montante dos factores de transcrio identificados e os seus alvos sugeriu a via do factor de crescimento semelhante a insulina para tornar as células de tumor independente da actividade do receptor de EGF. Notavelmente, a expressão de IGF2, além de muitos componentes desta via foi altamente regulada positivamente em tumores. Juntos, propomos um interruptor na sinalização autócrina para promover o crescimento do tumor que foi inicialmente desencadeada pela EGF e demonstrar a análise promotor forma ganho de conhecimento combinado com a identificação de nó-chave a montante
Citation:. Stegmaier P, Voss N, Meier T , Kel a, Wingender E, Borlak J (2011) métodos avançados Computational Biology Identificar interruptores moleculares para malignidade em um EGF rato Modelo de câncer de fígado. PLoS ONE 6 (3): e17738. doi: 10.1371 /journal.pone.0017738
Autor: Michael Polymenis, Texas A M University, Estados Unidos da América
Recebido: 06 de outubro de 2010; Aceito: 09 de fevereiro de 2011; Publicado: 28 Março 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Stegmaier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Peças de o trabalho foi financiado por subvenções da UE “EURODIA” (LSHM-CT-2006-518153) e Net2Drug (LSHB-CT-2007-037590) ea ETB conceder GlobCell e BMBF TcellTalk projeto, bem como o programa de colaboração intenational do russo Ciências do ministério e da Educação e Ministério da Ciência e da Cultura, Lower Saxony, Alemanha; número de concessão: 25A.5-76251-99-3 /00 a Juergen Borlak. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. PS, NV, AK, EW são funcionários da BIOBASE GmbH, Wolfenbuettel, Alemanha. AK é também um funcionário de Instituto de Biologia de Sistemas Ltd., Novosibirsk, Rússia
Conflito de interesses:. PS, NV, AK, EW e JB são funcionários da BIOBASE GmbH, Wolfenbuettel, Alemanha. AK é também um funcionário de Instituto de Biologia de Sistemas Ltd., Novosibirsk, na Rússia. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha em seu guia para os autores.
Introdução
fator de crescimento epidérmico é um mitogénio importante para hepatócitos para a sua capacidade para modular o proto-oncogene, bem como a expressão do gene específico do fígado. Para entender melhor o papel da EGF na transformação maligna de um rato transgénico modelo foi desenvolvido em EGF foi voltado para o fígado. Notavelmente, ratinhos transgénicos desenvolveram câncer de fígado em torno de 7-8 meses e uma rede dependente do estágio do tumor de genes regulados pelo FEG foi identificado, conforme relatado anteriormente [1]. Encorajados por estes genes descobertas ligadas à tumorigenes e progressão da doença poderia ser proposta. Aqui, nós desejamos analisar os perfis de expressão gênica de carcinoma hepatocelular pré-tumorais e altamente diferenciadas com um método computacional romance que permitiu a identificação de reguladores da cascata EGF sinalização associado à transformação maligna. Um novo método foi desenvolvido com base na análise da sequência do promotor de genes expressos diferencialmente. Especificamente, a transcrição de um gene é determinada para uma parte importante da actividade de factores de transcrição, que por sua vez reconhecem segmentos de ADN curto específicos, locais de ligação isto é, do factor de transcrição (TFBSs) que estão muitas vezes situadas na região promotora a montante do local de início da transcrição (TSS). perfis de expressão de gene pode, assim, ser usadas para identificar potencialmente TFs que influenciam a expressão de genes sob certas condições celulares por utilização de vários algoritmos genéticos e matrizes que reconhecem TFBSs. A complexidade dos dados de expressão de gene pode, em seguida, ser reduzida por identificação de TFs comum de genes co-regulados. O método aqui descrito e recentemente desenvolvido centra-se na identificação do factor de transcrição aos sítios com co-ocupação nos promotores de genes expressos diferencialmente ligação de uma forma estatisticamente significativa. Esta geração hipóteses habilitado e uma identificação de fatores de transcrição que actuam em tal promotor definido com o objetivo final de identificar “gatilhos moleculares” na rede de transcrição forçando hepatócitos em transformação maligna. Com base em factores de transcrição tais análise foram identificados como efetores candidatos de transformação maligna que pode funcionar no interruptor do FEG sobre a expressão para o estado maligno. A fim de validar experimentalmente as previsões computacionais experiências de transferência de Western de proteínas nucleares e ensaios de desvio de bandas de EMSA foram realizados para determinar a actividade de ligação do ADN de vários factores de transcrição. Reconstrução de cascatas de sinalização a montante desses TFs permitiu-nos a sugerir os alvos a jusante de sinalização EGF nestes dois tipos de estados celulares, ou seja, transgenia e câncer de fígado. Como resultado, propomos redes reguladoras que ajudam a entender melhor doenças malignas induzida por EGF. Num esforço para procurar moléculas chave na rede de sinalização a montante da transcrição identificados os factores da via do factor de crescimento semelhante à insulina foi identificado que de facto pode representar um interruptor molecular a partir da via da cinase de tirosina receptor de EGF ao estado do tumor tornando deste modo as células malignamente transformados independente da actividade do receptor de EGF. Outra evidência para esta hipótese foi obtida quando a expressão gênica de IGF2 e os seus parceiros a jusante foi investigado e determinado a ser altamente significativamente induzida em células tumorais como eram muitos componentes desta via.
Em geral, este estudo tem como objetivo para um melhor compreensão da capacidade EGF transformadora e combina diferentes linhas de evidência para um possível mecanismo da doença
resultados
a expressão diferencial em transgênica (pré-tumoral) e tecido tumoral:. sub classificação de conhecidos biomarcadores de câncer de fígado por perfis de expressão gênica
explicar 2.3 mapeados conjuntos de sonda Affymetrix a 10.262 genes do mouse. Análise da expressão diferencial com Ebarrays detectado 303 e 355 até genes regulados, bem como 95 e 141 genes baixo regulados em células transgénicas e tumorais, respectivamente. A tabela 1 resume informações sobre listas de genes obtidos e Figura 1 mostra a distribuição do fator de transcrição conhecido vinculativo Implantações de acordo com a versão do banco de dados TRANSFAC 12,1 (ver Material e Métodos, cálculo dos valores P para pontos da prova, para mais detalhes). Tabela S1 fornece todos os símbolos MGI gene, nomes molécula TransPath, se disponível, e as mudanças mais altas ou mais baixas dobra medidos para conjuntos de sondas de até regulamentada ou genes regulados para baixo, respectivamente. A modificação manual menor foi introduzido ao gene ajuste 5 (Tabela 1), onde um conjunto de sonda mapeada para quatro parálogos estreitamente relacionados Bcl2a1a-d. Utilizou-se o software de alinhamento mafft [2] e Jalview [3] para inspecionar os alinhamentos múltiplos de promotores Bcl2a1 (Figura S1). Desde sequências de promotores destes genes são muito semelhantes, um viés no promotor análises realizadas neste trabalho poderia ser esperado e que, portanto, removidos três genes Bcl2a (b-D) do gene definir 5.
A linha vermelha indica o pico da distribuição em relação -115bp ao TSS.
transgênicos e tumorais estados compartilhada 144 até genes regulados e 25 genes regulados para baixo (conjuntos de 3 e 8, Tabela 1). Em sucessivas análises também considerada uma sobreposição potencialmente maior, quando um conjunto de sonda foi estatisticamente significativa em um contraste e alcançou uma mudança alta dobra na outra (define 2, 4, 7 e 9). Assim, para 77 dos 303 até genes regulados em células transgénicas (conjunto 2), um conjunto de sonda detectada por análise estatística também teve uma variação vezes 2 em células tumorais, e estes 77 genes foram adicionados aos 355 genes até regulamentada tumor para obter um conjunto alargado de até genes regulados em células tumorais. Correspondentemente, 103 dos 355 genes até regulamentadas de tumor foram anexados ao conjunto transgênica para derivar um conjunto alargado de até genes regulados em células transgênicas (ajuste 4). Da mesma forma, conjuntos de genes da resposta regulação para baixo foram ampliadas em uma mudança vezes abaixo de 0,5. subconjuntos restantes (conjuntos de 1, 5, 6 e 10) foram consideradas especialmente regulado no respectivo estado de progressão.
De acordo com o módulo de doença da Biblioteca do Conhecimento BIOBASE (BKL) [4], carcinogênese induzida por EGF causada expressão diferencial de 39 genes conhecidos biomarcadores associados com carcinoma de fígado /neoplasias (Tabela S1). Como mostrado na Figura 2, estes biomarcadores caracterizado diferentes padrões de expressão sugerem uma mais sub classificação no que diz respeito à sua resposta no pré-estado do tumor e do tumor. Três genes, ou seja, Myc, Glul, aveia, foram transitoriamente para cima ou para baixo regulada durante o início da doença e podem assim servir como marcadores precoces de câncer de fígado, que discriminam o estado do tumor (Figura 2A). A análise estatística também sugerido Dnmt3a, ITGA6, e Shc1, no entanto alterações elevados de dobragem foram medidos para estes genes em células de tumores como discutido acima. Expressão de 14 genes biomarcadores mudou detectável em ambos os estados de progressão (Figura 2B), indicando um conjunto adicional de marcadores de câncer de fígado cedo putativos. Finalmente, CCND1, GPC3, MVK, PPARg, Rbl2, e Robo1 exibiram uma resposta específica de tumores (Figura 2C), onde foram observadas mudanças de expressão adversos para PPARg, que apareceu regulados negativamente em células transgénicas (dobre mudança 0,4) e significativamente -se regulada em tumores. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem uma interpretação refinada de biomarcadores conhecidos para o câncer de fígado /neoplasias. Entre respectivos genes foi possível identificar várias assinaturas informativas que indicam marcadores pré-tumorais e tumorais específicas e mostram que as mudanças de alguns biomarcadores conhecidos de expressão podem de fato servir como indicadores precoces de início da doença.
Os gráficos mostram log-Fold mudanças de biomarcadores conhecidos que foram diferencialmente expressos em células transgénicas (a), ambos os estados (B), ou de tumores (C). Dobram alterações de alguns genes indicada expressão diferencial nos dois estados, embora a análise estatística atribuído los a um só Estado (linhas tracejadas). Vários biomarcadores conhecidos apresentaram respostas específicas do estado de progressão, o que pode subserve derivação de pré-tumorais e tumores assinaturas (linhas em negrito).
regulação do ciclo celular e metabolismo lipídico mudanças progressivamente em hepatocarcinogênese induzida por EGF
com conjuntos definidos de (des) genes diferencialmente expressos em mãos, partimos para identificar as alterações funcionais que acompanham hepatocarcinogênese induzida por EGF. Para este fim, calculou-se os valores de P de enriquecimento para todos GO categorias de processos biológicos associados com pelo menos um gene na transgénicos ou conjuntos de genes do tumor e aplicou-as como uma medida da importância relativa de uma função biológica particular para um determinado conjunto de genes. Para limitar o efeito dos resultados falsos negativos durante a análise da expressão diferencial, valores P de enriquecimento foram calculados para conjuntos de genes prolongados compostas por conjuntos de 1-4 (até regulados em células transgênicas), 2-5 (até regulados em células tumorais), 6- 9 (regulados negativamente em células transgénicas), e 7-10 (regulados negativamente em células tumorais) (Tabela 1). Resultados da comparação P-valor são mostrados na Figura 3. No seguinte vamos nos concentrar nos 15 grupos ir com maiores diferenças entre-p-valores de log como obtido em análises de ambos conjuntos de genes regulados positivamente ou regulados negativamente. Parcelas de transgênica versus valores P tumorais (Figura 3, A e C) ilustram que o procedimento ordenou categorias de acordo com a sua distância para a (linha vermelha) diagonal. Pontos na diagonal indicam nenhuma diferença entre valores P. Nos 15 principais processos biológicos selecionados, P-valores variaram de cerca de 2-6 ordens de magnitude entre os estados transgénicas e tumorais. De acordo com esta análise, a regulação positiva de genes alterados durante tumorigenes mais fortemente funções do ciclo celular (Figura 3B). Note-se que as lendas das Figuras 3B e 3D preservar a ordenação por diferença log-P-valor. Todas as cinco principais categorias GO, “divisão celular”, “ciclo celular”, “fase M”, “mitose”, e “fase M do ciclo celular mitótico” aludem às mudanças no ciclo celular e foram mais significativamente enriquecido no tumor conjunto de genes, enquanto que a regulação positiva em células transgénicas foi mais fortemente dirigida a mecanismos de motilidade celular, bem como organização componente celular e biogénese. Além das alterações do ciclo celular, comparação funcional aponta mudanças na regulação dos genes que participam nos processos de desenvolvimento, crescimento celular e desenvolvimento de estrutura anatômica (Figura 3B), que implicam eventos desdiferenciação potenciais. Análise das respostas downregulation revela que a regulação do metabolismo lipídico foi fortemente modificada durante tumorigênese. As próximas duas funções mais alto classificados pertencem a desubiquitinação proteína e síntese de ácidos biliares (Figura 3D). Tabela S2 fornece detalhes adicionais sobre genes correspondentes alguns grupos de processos biológicos selecionados e seus valores P em qualquer estado de progressão. Categorias do ciclo celular altamente classificados por comparação dos conjuntos de genes regulados positivamente foram afetados significativamente em ambas as células transgénicas e tumorais, o que mostra que estas funções sofrer alterações progressivas. Em particular, os genes associados com o desenvolvimento de estrutura anatómica foram fortemente enriquecido em transgénicos e conjuntos de tumor (linha de ponto amarelo e, a Figura 3, A e B). Notavelmente, as diferenças não se manifesta apenas na regulação positiva de genes adicionais na célula do tumor; por exemplo. o grupo ciclo celular das células transgénicas compreende Foxc1, Gadd45a, Hic1, Hus1, Myc, e Uhmk1, que não foram detectados no tumor (apesar de aumentar a lista de genes). As mudanças mais dramáticas foram observadas na regulação de genes metabólicos lipídicas. Transgénicos e conjuntos de genes do tumor envolvidas nesta função diferiam por 21 genes e valores P de enriquecimento aumentou em cerca de seis ordens de grandeza. Além disso, desubiquitinação proteínas e ácidos biliares metabolismo exibem um regulamento switch-like, onde a expressão diferencial foi detectado pela primeira vez no tumor
(A e B – Análise de genes regulados positivamente, C e D – Análise de genes regulados negativamente). . A e C) Cada ponto representa uma categoria GO no espaço de dois valores P. B e D) Top 15 termos ir com maior diferença log-P-valor entre transgênicos e tumor. Pontos que correspondem a categorias constantes do B e D são destacados em A e C, respectivamente.
desregulação do ciclo celular foi previamente identificado como um mecanismo causal de carcinogenicidade genotóxica [5]. Também é conhecido que o cancro do fígado implica perturbações metabólicas lipídicos incluindo o metabolismo do colesterol [6]. Os resultados aqui apresentados mostram que o início da doença foi acompanhada por alterações progressivas nas respectivas funções. A via da ubiquitina-proteassoma é relativamente novo alvo para terapia de câncer [7]. De acordo com nossos dados de expressão de genes, hepatocarcinogênese causada regulação baixa de três genes desubiquitinação, Dub1, Dub2 e Dub2a, especificamente no estado do tumor (Tabela S1). Recentemente, uma enzima deubiquitinating, BaP1, com um papel na regulação do ciclo celular foi descrito como supressor de tumor [8], apoiando a importância de encontrar a categoria GO correspondente entre as 15 principais funções alteradas, apesar de um P-valor enriquecimento moderada no gene tumor definido (P 0,0001). Desativação de genes desubiquitinação está em conformidade com os resultados anteriores, como Ventii e co-autores também observaram deficiência na actividade deubiquitinating em mutantes associados ao câncer. Em resumo, foi observada mudanças progressivas na regulação do ciclo celular, funções metabólicas lipídico de desenvolvimento e chaperoned hepatocarcinogênese induzida por EGF, enquanto potencial regulamentação switch-como para pequenos grupos de genes definidos pela desubiquitinação proteína e biossíntese dos ácidos biliares, um componente do metabolismo do colesterol hepático . Estas funções biológicas podem abrigar novos biomarcadores para o início da doença e tumorigênese.
Clusters de moléculas de transdução de sinal upregulated em células transgénicas e tumorais integrar fatores de crescimento, ciclo celular, quimiocinas e citocinas sinais
Redes de interagir proteínas exercem uma grande parte das funções celulares. Análise de moléculas expressas diferencialmente no contexto de vias de sinalização conhecidas permite a identificação de redes moleculares alvo de alterações de expressão observados. Nós aplicamos análise de cluster de rede para propor contexto funcional para componentes codificados por genes diferencialmente expressos de células transgênicas e de tumor, juntamente com o apoio de topologias de rede construídos a partir de reações de sinalização experimentalmente comprovadas sinalização. As redes foram construídos para conjuntos de regulação positiva e de regulação negativa dos genes ampliados descritos acima. Como resultado, obteve-se um conjunto para cada genes regulados positivamente de células transgênicas e de genes regulada de células tumorais. Uma pequena rede de genes regulados negativamente foi encontrada em células tumorais, em que o EGF e beta-c interagir com Shc e um complexo compreendendo EGF, ErbB1, SHC-1, Grb2 e Sos (não mostrado). As duas redes de genes regulados positivamente foram constituídos por 85 e 88 componentes, incluindo 39 e 41 moléculas upregulated em células transgênicas ou tumorais, respectivamente. Diagramas de aglomerados de transgênicos e de rede tumor são mostrados nas Figuras 4 e 5. Outras informações sobre moléculas diferencialmente expressos e genes que codificam é dada na Tabela S3
nós vermelhos: apenas na rede de transgênicos;. luz vermelha: prega mudança foi, pelo menos, dois maior do que no tumor; Luz verde: prega mudança foi, pelo menos – 2 menor do que no tumor, Azul: Molécula regulada com a mudança vezes semelhante em transgênica e tumor. Por favor, veja o texto para descrição detalhada
nós vermelhos: apenas na rede de tumor;. Luz vermelha: dobrar mudança era pelo menos 2 pontos mais elevado do que em células transgénicas; verde-claro: dobrar mudança era pelo menos 2 pontos mais baixos do que em células transgénicas, Azul: molécula regulada positivamente com alterações dobra similar em transgénicos e de tumor. Por favor, veja o texto para descrição detalhada.
Ambas as redes apresentam uma mistura de categorias funcionais, tais como o fator de crescimento de sinalização, por exemplo, através de receptores ErbB, InsR, ou FGFR-1, cascatas de ciclo-regulação celulares, por exemplo, envolvendo ciclina B1, Cdk1, Aurora-A, ou p53, assim como a citocina e quimiocina sinalização através de IL-1RI e CXCR4. A lista combinado dos componentes supra-regulada consiste em 48 proteínas, dos quais 7 são específicas para a rede transgénico e 9 apenas uma parte da rede de tumor (Tabela S3). Para 19 das moléculas compartilhadas 32 uma mudança quantitativa na expressão durante a tumorigénese pode-se supor, como indicado pelo nó de coloração em diagramas de rede (verde e nós vermelhos de luz, as figuras 4 e 5). Notavelmente, esta aplica-se a um módulo compacto de reguladores do ciclo celular, ou seja, a survivina, ciclina B1, Cdk1, Plk1, e Bub1, cuja expressão aumentada cerca de 2 vezes no tumor contra células transgénicas de acordo com alterações de dobragem medido. Além disso, a análise sugere rede de um outro módulo, específico de tumor de reguladores do ciclo celular formados por p107, p130, p15INK4b, e Wee1 (Figura 5). Estes resultados suportam a hipótese de a carcinogênese EGF-induzida é impulsionado em parte por alterações progressivas da regulação do ciclo celular, que, como as redes mostram, também pode se manifestar por meio de mudanças quantitativas de expressão.
Os cachos de rede apresentados revelam efeitos potenciais sobre a atividade do TFS upregulated como c-Fos, c-Jun, c-Myc, PPAR-gama1, Smad3, Egr-1 e c-Ets-2. C-Myc e PPAR-gama1 foram restringidos ao transgénico e a rede do tumor, respectivamente. Cada fator integra sinais de várias moléculas a montante com expressão alterada. Curiosamente, conhecido TFs associados ao câncer, como c-Fos, c-Jun, Smad3 e c-Ets-2 apresentaram níveis bastante constantes de regulação positiva em toda a tumorigênese. Além disso, um número relativamente elevado de ambas as reacções de activação e inibitórios da p53-alvo, o que era desprovido de expressão diferencial detectável em qualquer estado de progressão.
Uma cascata envolvendo a VCAM-1, alfa-4-integrina, e PIA foi encontrada especificamente no a rede transgénica (Figura 4). Alpha4-integrina mostra regulamentação específica para o estado de progressão com regulação positiva em células transgênicas e regulação negativa em células tumorais (Tabela S3). As integrinas estão ligados a invasão de tecidos por células de hepatocarcinoma [9] e desempenham um papel na apoptose [10]. BMP7, uma molécula especifica para a rede de tumor, pode actuar como factor de transcrição e pode, como tal, contribuir para a regulação positiva de c-Myb [11], bem como de c-fos, podendo esta última por outros meios [12]. BMP7 foi previamente relatado para participar na regulação de apoptose em células do músculo liso vascular [13]. Dada a sua associação com a apoptose e seus perfis de expressão específica do estado de progressão, alfa4-integrina e BMP7 pode representar componentes de mecanismos de comutação de carcinogênese.
Os cachos de rede revelar circuitos reguladores que poderiam ser exploradas para novas intervenções terapêuticas. De facto, os antagonistas de PPAR-gama está a ser investigada como tratamento de várias doenças malignas, incluindo os cancros do fígado. cascatas reguladoras alvo PPAR-gama através de cinases a montante e fosfatases, como M3 /6, JNK1, MEKK2, mkp3, MEK2, ou ERK2, dos quais M3 /6, MEKK2, e foram induzidos durante a carcinogênese 3-MFP, sugerem possibilidades adicionais para desenvolvimento de medicamentos. Além disso, o ligando de insulina e receptores semelhantes a insulina, IGF-2, foi fortemente regulada positivamente em células tumorais, ao passo que houve mudanças moderadas em células transgénicas (não detectadas pela análise da expressão diferencial). O papel potencial deste ligando autócrino na regulação do crescimento de células de cancro foi previamente discutido na literatura [14] e posteriormente analisados no nosso estudo (ver abaixo).
Promotor análise e identificação de sequências reguladoras
os fatores de transcrição são importantes contribuintes para mudanças de expressão gênica coordenados como os observados nos dados do estudo. É uma abordagem padrão para testar a sobre-representação de sites em promotores de genes co-regulados contra um fundo de promotores de ligação TF. Foram quantificados enriquecimento local de ligação pelo 0,01-quantil da proporção de duas distribuições beta modelização do odds ratio de sítios de ligação previstos e os promotores e os primeiro e segundo planos conjuntos de genes. O valor de 0,01-quantil, na seguinte denotado
Q-
valor, calcula o valor da razão de probabilidade, de modo que a verdadeira proporção é maior com 99% de probabilidade (ver Métodos). Para cada um dos 578 PWMs TRANSFAC, o algoritmo começou com um limite de pontuação baixa PWM (P-valor 0,05) e iterativa ajustado o ponto de corte (incrementando) para maximizar o valor q.
locais de ligação foram predito por partida em regiões promotoras que cobrem -1.000-100 relação ao TSS. Nós construímos conjuntos fundo separadas para células transgénicas e tumorais por amostragem aleatória de 1000 genes com alterações vezes entre 0,9 e 1,1 no respectivo estado de progressão. Os seguintes conjuntos de primeiro plano foram analisados: regulação positiva (Tabela 1: define 1-3 e 3-5), supra-regulação específica (tabela 1: 1 define e 5), a regulação negativa (Tabela 1: define 6-8 e 8-10), e downregulation específico (Quadro 1: conjuntos de 6 e 10). Além disso, a ligação de enriquecimento local foi testada em promotores de genes regulados positivamente associados com o ciclo celular e de genes regulados negativamente associados com o metabolismo dos lípidos.
Na Figura 6, valores de Q de motivos TRANSFAC optimizado para conjuntos de primeiro plano transgénicos são representados graficamente contra q-valores de conjuntos de primeiro plano tumor correspondentes. Além disso, foram extraídas as principais PWMs ordenados por valores de Q na Tabela S4. Identificadores de matrizes TRANSFAC cujos pontos são destaque na Figura 6 estão em negrito-digitado na Tabela S4. Extracção de matrizes seguido a regra para mostrar as 15 melhores PWMs, ou com todo o enriquecimento de pelo menos 2 vezes, em qualquer dos conjuntos transgénico ou tumor, ou todos os PWMs em destaque na Figura 6, o que resultou no maior número de motivos. Também extraída genes do factor de transcrição (Tabela S5) de acordo com PWMs identificados (sublinhado na Tabela S4) e realizada análise de rede a montante com conjuntos de factor de transcrição (ver abaixo).
Cada ponto representa um sítio de ligação TRANSFAC (= sequência motivo) posicionado por enriquecimento vezes na transgénico (eixo x) e de tumor (eixo dos y) conjuntos de primeiro plano. valores quantílicas superiores a 1 indicam enriquecimento local de ligação. Vários motivos são destacadas que foram deslocados da diagonal sugerindo importância diferente do TFS para a regulamentação correspondente em ambos estados transgênicos ou tumorais. Por favor, veja o texto para descrição detalhada. A) Análise de enriquecimento local de ligação em todas as genes regulados B) Análise de enriquecimento do sítio de ligação em genes especificamente para baixo regulados, tanto de estados transgênicos ou tumorais C) Análise de enriquecimento local de ligação em todos os genes regulados D) Análise de enriquecimento do sítio de ligação em especificamente os genes regulados, tanto de estados transgênicos ou tumorais e) Análise do local de ligação enriquecimentos em até genes do ciclo celular regulamentados F) Análise de enriquecimento do sítio de ligação em genes do metabolismo lipídico baixo regulado.
Como resultado, a análise revelou promotor motivos TF especificamente, ou mais articuladamente sobre-representadas em conjuntos de primeiro plano transgénicos ou tumorais, bem como com motivos enriquecimento comum em ambos os estados de progressão. Em 5 de 6 conjuntos de primeiro plano, motivos POU foram mais fortemente associado com o estado transgênico do que com o estado do tumor (Figura 6A-E). Esta diferença foi mais pronunciada em análises de expressão reduzida (Figura 6A) e conjuntos de genes regulados negativamente específicas (Figura 6B), onde pontos que representam matrizes POU (diamantes azuis) estão localizados longe da massa de pontos. Notavelmente, alguns locais de motivos POU também eram mais de duas vezes enriquecida em promotores de genes regulados negativamente em tumor. matrizes OCT1 foram topo motivos classificados em genes reprimidos reprimidos e específicos no tumor (Tabela S4). No entanto, os promotores de genes regulados positivamente foram detectável enriquecido com locais POU no estado transgênica única (Figura 6C-E). Estes resultados sugerem que factores POU contribuiu para o interruptor de transgénicos para estado do tumor. Além disso, a sua actividade pode representar uma importante causa de eventos downregulation observados. Entre os fatores de transcrição POU representados por matrizes identificadas nas análises, o perfil de expressão de Pou5f1 (Oct4) assemelhava-se assim o enriquecimento específico progressão do estado observado de seus sítios de ligação (Tabela S5). O gene Pou5f1 exibiu uma mudança alta vezes (2,75) no estado transgênica, que tinha diminuído no estado do tumor (dobre a mudança 1,70). Com efeito, o gene Pou5f1 é expresso especificamente em células estaminais embrionárias e em células tumorais, mas não em células de tecidos diferenciados [15]. Os fatores de transcrição com um domínio forkhead também mostrou associação com o estado transgênica. Este sinal foi melhor observada em conjuntos de genes sobre-regulação do ciclo celular e (Figura 6Cand E), mas o enriquecimento sutil na promotores transgênicos também poderia ser detectado em infra-regulação específica (Figura 6B) e sobre-regulação específica, onde o motivo FREAC2 classificada entre as 15 melhores PWMs ( tabela S4). No conjunto de regulação positiva, sítios de ligação FOXD3 mostrou o sinal mais forte após locais OCT1 (Tabela S4). Isto suporta um papel potencial de Oct4, como corepression através de sobreposição de locais de ligação de Oct4 e FoxD3 foi previamente relatada [16]. De acordo com as medições de expressão, FOXD3 foi potencialmente regulados negativamente em ambos os estados de progressão (Tabela S5), embora as diferenças de expressão medidos não foram estatisticamente significativas. Em vez disso, a expressão Foxc1 paralelo com o enriquecimento dos locais mais fortes em conjuntos de ligação do promotor transgénicos forkhead, como é especificamente regulada no estado de início de progressão (Tabelas S1 e S5).
promotores de genes regulados positivamente em tumores foram associadas com a ligação locais de reguladores do ciclo celular, como fatores AP1-like, STAT, e E2f (Figura 6C-e), dos quais ATF3, Jun e E2F3 foram significativamente upregulated em ambos os transgênicos e células tumorais (Tabelas S1 e S5). Esta descoberta apoia a regulação mais forte dos processos do ciclo celular em tumores detectados por análise GO comparativa. A análise dos promotores de genes do ciclo celular sugere fatores E2F como os reguladores mais importantes em ambos os estados, enquanto foi observada uma tendência para valores q maiores no conjunto de tumor por vários motivos E2F (Figura 6E). Notavelmente, a proteína de dedo de zinco-Myc associada foi detectada no conjunto de genes do ciclo celular transgénica (Tabelas S4 e S5), o que sugere que indirectamente Myc impactado regulação do ciclo celular em células transgénicas, mas não, ou em menor escala em células tumorais. Isto seria apoiado pelo perfil de expressão de Myc com regulação positiva significativa no estado inicial e regulação positiva sutil ou ausente no tumor.
Finalmente, os conjuntos de genes do metabolismo lipídico mostram forte associação da HNF6 (Onecut1) e PPAR-gama com o estado do tumor (Figura 6F). Destes, HNF6 foi significativamente regulada negativamente em tumores, ao passo que o PPAR-gama exibiu um perfil específico estado de progressão com regulação negativa no estado transgénico e regulação positiva significativa no tumor
.
Enquanto muitos dos factores de transcrição acima mencionadas são bem conhecidos proto -oncogenes, como Jun Myc, ou E2F3, ea ligação entre HNF6, PPAR-gama e metabolismo lipídico é compreensível, outros fatores revelados pela nossa análise são novos no que diz respeito ao seu papel na carcinogênese hepática. locais de Kaiso (Zbtb33) Encadernação foram mais fortemente sobre-representadas em genes tumorais reprimidos. Kaiso foi mostrado para silenciar genes supressores de tumor no cancro colorectal [17], e seu papel no câncer foi previamente analisado [18]. Além disso, os motivos de factores de caixa HMG foram associados com conjuntos de genes em transgénicos regulação negativa (Figura 6A, LEF1 PWMS) e a regulação positiva específica (Figura 6D, Sry). [29].