Abstract

Cancro células-tronco (CSCs) podem invadir e metástase por epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) . No entanto, como eles escapam vigilância imunológica não é clara. B7H1 é molécula co-estimuladora negativo crucial, mas pouca informação sobre se ele funciona em CSCs. Por isso, determinou-se a expressão de marcadores B7H1 e EMT-associados no cancro colorectal células estaminais-como para investigar uma possível maneira immunoevasion de CSCs. Nós enriquecido CD133

+ células de câncer colorretal que se manifestam as propriedades CSCs-like tais como níveis mais elevados de outros marcadores de células-tronco Oct-4 e Sox-2, esfera tumor capacidade de formação e mais tumorigênicos em camundongos NOD /SCID. Estes CD133

+ células possuem perfil EMT expressão gênica incluindo maior nível de Caracol, Twist, vimentina, fibronectina e menor nível de E-caderina. Além disso, CD133

+ células, tanto na linha de células e tecidos de cancro colorrectal expressas alto nível de negativo co-estimular B7H1 molécula. Além disso, alguns B7H1 células

+ de câncer, também mostrou a característica de EMT, indicando células EMT poderia escapar ataque do sistema imunológico durante a metástase. expressão B7H1 e fenótipos EMT em CSCs indica um possível caminho immunoevasion

Citation:. Zhi Y, Z Mou, Chen J, Ele Y, Dong H, Fu X, et al. (2015) Expressão B7H1 e epitelial para mesenquimal Transição fenótipos no cancro colorectal células-tronco-like. PLoS ONE 10 (8): e0135528. doi: 10.1371 /journal.pone.0135528

editor: Giuseppe Pirozzi, Istituto Nazionale Tumori, ITALY

Recebido: 08 de março de 2015; Aceito: 22 de julho de 2015; Publicação: 18 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (a ZM, No. 30.872.466), Programa Nacional de Key Projeto de Pesquisa básica (973 Programa) da China (a ZM, No. 2010CB529404). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é o terceiro tipo de câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda em mulheres [1], mas os avanços da terapia anti-câncer foram feitas limitadamente nos últimos 50 anos. A falha da terapia anti-cancro é atribuída a uma subpopulação de células cancerosas chamado cancro de células estaminais (CCC), que são as células de iniciação de cancro putativos com as características das células estaminais normais, tais como a auto-renovação, multipotência e proliferação ilimitada potencial [ ,,,0],2]. Além disso, CSCs são pensados ​​para ser crucial para [3] fármaco-resistência. Portanto, acredita-se que os CSCs são “sementes” de formação de cancro e difícil de ser eliminado. CSCs colorretais também foram isolados e caracterizados com base no CSCs marcadores, tais como CD133 [4-9].

CSCs desempenhar um papel crucial na invasão e metástase do cancro. Para compreender como a metástase das células cancerosas, o papel da transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) tem sido extensivamente estudado ao longo da última década. EMT confere características invasivas e metastáticas, resistência a terapias e CSCs fenótipos em células cancerosas em modelos experimentais [10-15]. células de cancro submetidos a EMT regular negativamente as proteínas associadas com a adesão celular, tal como E-caderina, e regular positivamente as proteínas expressas em células mesenquimais, tais como a vimentina, N-caderina e fibronectina [13], e os factores de transcrição incluindo

Snail

,

torção

, e

Slug

bem [16]. EMT também facilita a sobrevivência de células de cancro após tratamento com drogas anti-cancerígenas, que têm como alvo receptores em células epiteliais [12, 17]. Além disso, a indução de EMT em células de cancro com medicamentos ou a sobre-expressão de factores de transcrição EMT resulta na aquisição de propriedades mesenquimais e na expressão de marcadores de células estaminais [18-20]. Por outro lado, as células de cancro a seguir ao tratamento com drogas anti-cancro, os quais foram mostrados para enriquecer CSCs, manifestar os fenótipos e a expressão do gene como EMT [21]. Estes resultados indicam a estreita associação entre CSCs ea aquisição de EMT. No entanto, a maioria dos patologistas ainda são refratários à teoria EMT porque a prova definitiva de EMT acontecendo em tumores humanos está faltando até agora.

CSCs possuem características biológicas intrínsecas para formar tumor e podem invadir os tecidos através da EMT. Mas não está claro que a forma como eles fugir vigilância imunológica para a sobrevivência final em hospedeiros imunocompetentes. Immunoevasion pode ajudar CSCs sobrevivam e, em seguida, formar tumor [3]. Os relatórios anteriores sugeriram conexões intrínsecas entre a supressão imunológica e EMT, como que as células T reguladoras EMT induzida induzida por Caracol e células dendríticas com deficiência [22]. Tomados em conjunto, nossa hipótese immunoevasion é importante para CSCs que sofrem EMT através da região inflamação paraneoplastic sem autorização imunológico e, em seguida, implementar invasão e metástase. No entanto, os dados ainda são escassos os mecanismos de immunoevasion CSCs em [3].

B7H1, um ligando de uma morte celular programada (PD-1), tem sido bem conhecido como uma molécula co-estimuladora importante e desempenha um papel importante na indução e manutenção da tolerância periférica [23]. B7H1 é regulada positivamente em tipos considerável de células cancerosas, que oferece sinais negativos e conduz a imunossupressão através da interacção PD-1-B7H1 entre células cancerosas e células T [24, 25], o que resulta na disfunção de células T que se infiltram no tumor e recrutamento Treg [26] . Estas características fazem B7H1 se tornar um alvo promissor para controlar o câncer. No entanto, a expressão B7H1 em CSCs não se sabe bem em câncer colorretal. Assim, detectamos expressão B7H1 no cancro colorectal neste estudo e mostrou B7H1 expressão e EMT fenótipos em câncer colorretal células-tronco-like, que pode ser mecanismos de CSCs para escapar vigilância imunológica e invadem tecidos distantes.

Materiais e métodos

declaração Ética

os tecidos com cancro colorectal humanos foram obtidos no Hospital Southwest ao abrigo de protocolos éticos aprovados pela Comissão de Ética da Terceira Universidade médica Militar, Chongqing, China. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. Experiências com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Terceira Universidade Médica Militar. Todos os procedimentos estavam em conformidade com o Instituto Nacional de Saúde Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

tecidos de câncer e linha de células

Os tumores colorretais humanos foram histologicamente avaliadas e classificadas pelo tumor- -metástase (TNM) sistema de estadiamento (Tabela 1). As células linhagem de células do cólon HT29 (número de catálogo: Tchu 103, comprado em 29 de maio de 2010 a partir do celular Banco da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China) foram cultivados em 5A de McCoy (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, EUA).

célula triagem magnética

HT29 células foram colhidas em fase de crescimento exponencial com 0,25% de tripsina ( continham EDTA), em seguida, classificados por CD133 celular Kit de Isolamento (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células mortas foram removidas por Dead Kit celular Removal (Miltenyi Biotec) antes da separação. O CD133

+ e CD133

– frações foram recolhidos separadamente e corados com 2 (293C3) anticorpo CD133 humano conjugado com PE /(Miltenyi Biotec). ratinho conjugado com PE IgG2b (Miltenyi Biotec) foi usado como anticorpo de controlo de isotipo. A pureza das células foi avaliada por citometria de fluxo (BD FACSCanto Ⅱ, San Jose, CA, EUA).

ensaios tumorigénica em ratinhos

-SCID LtSz /scid (SCID NOD /) camundongos NOD /(Comprado de Beijing animais de Laboratório Centro de Pesquisa, China) foram criados e mantidos no individual ventilado Jaula sistema nas condições aprovadas pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Terceira Universidade médica Militar. CD133

+ e CD133

– as células foram classificadas e contadas antes da inoculação. As células cancerígenas foram suspensos numa mistura 1: 1 dos meios de comunicação e Matrigel (BD Biosciences, Bedford, UK) e injectado subcutaneamente nos flancos de 4 ratinhos (cerca de 8-10 semanas de idade). Cada flanco foi injetado 1 × 10

4 células. O crescimento dos tumores foi monitorizado semanalmente e medido o volume de comprimento x largura x largura /2. Todos os ratinhos foram sacrificados após 7 semanas transplante. Os enxertos foram removidas, fixadas com formalina a 10% tamponada, e corados com hematoxilina e eosina (HE)

Sphere formação de ensaio

O CD133 classificadas

+ e CD133

. – As células foram cultivadas em meio isento de soro (SN-se um meio basal, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) mais 10% NS-a Suplementos de proliferação (Humana) (StemCell Technologies), factor de crescimento epidérmico (EGF) (20 ng /ml) (StemCell Technologies), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (10 ng /mL) (StemCell Technologies) e heparina (2 ug /mL) (Invitrogen). O meio de cultura foi substituído a cada 3 dias. As imagens de esferas foram capturados depois de 20 dias por microscópio e contados os números abaixo de 100 vezes em campos visuais aleatórias. Algumas esferas foram corados com 2 (293C3) anticorpo conjugado com PE CD133 /(Milteny Biotect). Algumas esferas tumorais foram dissociadas por colagenase Tipo Ⅳ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e, em seguida, cultivadas em meio isento de soro como menção acima para determinar se poderia formar esferas de novo.

extracção de ARN, ADNc síntese e Q-PCR

CD133

+ e CD133

– células HT29 foram coletados, respectivamente, e acrescentou TriPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA) para extrair RNA. 500 RNA ng para cada amostra foi reversamente transcrito em uma mistura de reação de 20 mL (TOYOBO Bio-Technology, Xangai, China). O nível de expressão de cada gene foi determinada por PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR). Nível de produto foi determinada por SYBR Green (TAKARA Biotecnologia, Dalian, China). Q-PCR foi realizada pelo sistema Mx3000P qPCR (Agilent Technologies) com o seguinte programa: desnaturação inicial de 2 minutos a 95 ° C seguido de 45 ciclos de PCR (95 ° C durante 10 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos). Depois que um ciclo concebido pelo software Mx3000P (95 ° C durante 60 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 95 ° C durante 30 segundos) foi adicionado para a análise de curva de fusão. As sequências dos iniciadores foram listadas na Tabela 2. fosfato desidrogenase gliceraldeído (GAPDH) foi utilizado como controlo do gene da limpeza.

Imunofluorescência coloração

As secções congeladas de tecidos de câncer foram coradas de acordo com on-line protocolo (https://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm). Os anticorpos contra CD133, B7H1, a E-caderina e vimentina humana foram utilizados para determinar a expressão de marcadores de células positivas EMT positivos ou B7H1 CD133. Do mesmo modo, os anticorpos contra CD133 humano, B7H1 e EpCAM foram usadas para detectar a expressão CD133 e B7H1 em tecidos de cancro. Os detalhes de selecção foram os anticorpos listados na Tabela 3. Os anticorpos secundários foram adquiridos à Beyotime Instituto de Biotecnologia, Xangai, China. -Diamidino-fenil Índole (DAPI) (Beyotime Biotechnology) foi utilizado para corar núcleo. Os controlos incluíram: 1) em branco: tampão de diluição usado anticorpo (5% de albumina de soro de bovino em solução salina tampão fosfato, pH 7,2), apenas; 2) controlo negativo: usado tampão de diluição de anticorpo mais anticorpos secundários; 3) controlo de anticorpo de isotipo usado IgG a partir de espécies de anticorpos diluídos por tampão de diluição de anticorpo mais anticorpos secundários. Os controlos foram utilizados para evitar a fluorescência inespecífica.

HT29 células protocolo de coloração era semelhante aos tecidos de cancro, mas antes que as células foram semeadas em poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) desliza de cobertura pré-revestido, cultivadas em meio de McCoy 5A ‘durante 24 h e, em seguida, fixo com Fixação e permeabilização Solução (BD Biosciences).

Após a coloração, as lâminas foram todos mantidos em câmaras humidificadas ao abrigo da luz a 4 ° C até que a captura de imagem.

imagens de captura e expressão análise

Todas as imagens confocais foram capturados por varredura a laser confocal microscópio de fluorescência (Leica TCS-SP5, Alemanha). Os controles foram usados ​​para ajustar a condição de captura adequada para evitar a interferência de fluorescência inespecífica. O mesmo marcador em diferentes lâminas foi detectada nas mesmas condições. as taxas de expressão foram medidos por contagem das células positivas correspondentes nas imagens de captura. Cada lâmina foi medido mais de 5 campos e contadas pelo menos 1000 células.

A análise estatística

As diferenças de volumes de xenotransplante, números de esfera e nível de expressão de mRNA entre CD133

+ e CD133

– as células foram analisadas por Estudante de

t

-teste. A

p

-valor 0,05 foi considerado diferença significativa. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (versão 13.0).

Resultados

CD133

+ células possuem capacidade de formação potencial e tumor esfera mais tumorigênico

Como os debates de ainda existirem CSCs marcadores [27, 28], verificamos o câncer características estaminais-como de ordenada CD133

+ células primeiro. CD133

+ e CD133

– células HT29 foram coletadas para determinação da tumorigenicidade de células. A percentagem de CD133

+ células era cerca de 90% (Fig 1A). Dez milhares de CD133

+ e CD133

– foram injectados por via subcutânea em diferentes flancos de NOD /SCID. A partir de 5 semanas após a injecção, os tumores derivados de CD133

+ células começaram a ser significativamente maior do que os derivados de CD133

– células (Fig 1B e 1C). O CD133 xenotransplantes

+ celulares mostrou histologia maligna, como o cancro do cólon (Fig 1D), sugerindo que CD133

+ células são mais tumorigénico. Além disso, a formação de esfera é um dos traços de CSCs [4], determinou-se a formação de esfera de CD133

+ células e descobriram que CD133

+ células formadas significativamente mais esferas de tumor do que CD133

– células sérica meio de cultura livre

in vitro

(Fig 1E). Além disso, quase todas as células CD133

+ células derivadas de tumores esferas expressa elevado nível de CD133 (Fig 1F). Além disso, após a dissociação com colagenase de células, as células tumorais poderia formar esferas de novo em meio isento de soro (Figura 1G), o que indica a capacidade de auto-renovação das células CD133

+ células. No geral, estes resultados indicaram que CD133

+ células possuíam propriedades CSCs-like.

HT29 células foram purificados com CD133 esferas magnéticas. A pureza das células CD133

+ células foi determinada por citometria de fluxo (A). 1 × 10

4 CD133

+ e CD133

– as células foram injectados por via subcutânea em diferentes flancos de NOD /SCID. Curva de crescimento de tumores de xenoenxerto em ratinhos NOD /SCID mostra diferente capacidade de tumorigénese em duas subpopulações (B). A cinética do tamanho do tumor foi monitorizada uma vez por semana (n = 4, média ± DP, **,

P 0,01

) .A representativo de ratos é mostrada em 7 semanas após a inoculação (C). As seções de xenoenxertos (D) do CD133

+ células (esquerda, 200 × ampliação) e CD133

– células (direita, 200 × ampliação) foram analisadas com hematoxilina e eosina (barra = 100 mm). CD133

+ células mostrar muito mais poderosa de formação de esfera de CD133

– os (E). Os shows do histograma do número de esferas derivadas de diferentes subpopulações (**

p

0,01). esferas tumorais expressam CD133 (F, top: luz neutra; bottom: fluorescência, vermelho; bar = 100 mm). Após a dissociação, as células formaram esferas novamente (G, inferior) em meio de cultura isento de soro como sua geração mais velha (G, em cima) (barra = 100 mm).

CD133

+ HT29 células expressar a haste moléculas associados a células e EMT-associados

CSCs são as células iniciadoras de câncer putativos com as características de células-tronco normais expressam marcadores de pluripotência, como Sox-2 e Oct-4 [29-31] . Para determinar se CD133 células

+ HT29 também expressam os fatores associados a células-tronco, ao nível da transcrição de Oct-4 e Sox-2 expressão foi medida. Tal como esperado, dois marcadores de células estaminais Oct-4 e SOX-2 foram expressos significativamente maior em CD133

+ subpopulação (

P

0,05) do que o CD133

– células (Fig 2A), o que é consistente com Oct-4 e Sox-2 superexpressão em tumores pouco diferenciados [32].

níveis de expressão de mRNA relativas dos marcadores de células tronco Out-4 e Sox-2 (a), EMT associados fatores de transcrição twist and Snail (B), e EMT marcadores de e-caderina, fibronectina, e vimentina (C) foram determinadas por PCR em tempo real quantitativa e normalizado para a expressão de GAPDH. *,

p

0,05; **,

p .

0,01

estudo anterior mostrou que a EMT está envolvido na conversão de tumores em fase inicial em malignidades invasivas [33]. Curiosamente, acumulando evidências indicam que a indução de EMT fenótipos por diferentes factores também induz CSC-como células [15]. No entanto, não está claro se os fenótipos de exibição CSCs EMT. Para resolver esta questão, foi detectada expressão de moléculas de EMT-associados em células HT29, incluindo fatores de transcrição Snail e Twist, epitelial proteína caderina-E, marcadores mesenquimais vimentina e fibronectina. CD133

+ células expressaram níveis significativamente mais elevados de Caracol, Twist, vimentina e fibronectina que CD133

– células (

p

0,05) (Fig 2B e 2C). Por outro lado, expressão da caderina-E em CD133

+ células foi significativamente menor (

p Restaurant 0,05). (Fig 2C), indicando CD133

+ células manifestam características EMT-associados

CD133

+ células nos tecidos do paciente exibir EMT fenótipos

Apesar de EMT foi amplamente estudada

in vitro

, a questão-chave sobre EMT se que a evidência direta desse fenômeno acontecendo em humanos tecidos de câncer foi falta. Para abordar esta questão, a expressão de CD133 e moléculas EMT-fenotípicos foi analisado em tecidos de câncer colorretal em humanos. CD133 foi expressa dispersa ao lado do ninho adenocarcinoma (Figura 3), mas não no tecido paraneoplastic (Fig S1). Curiosamente, verificou-se que alguns CD133 vimentina

+ células expresso (Fig 3B), mas não de E-caderina em 13/20 detectado tecidos de cancro colorrectal humano (Fig 3A). Através da coloração estas três moléculas na mesma secção, que confirmou uma porção de CD133

+ células em diferentes amostras (20% -40%, no total, CD133

+ células) mostrou que este fenótipo (Fig 3C). Ele indicou que a evidência direta de que alguns CD133

+ câncer de células estaminais-como tinha fenótipos EMT em tecidos de câncer humanos.

A expressão de CD133 (vermelho), E-caderina (verde) (A) ou CD133 (vermelho) e vimentina (verde) (B) ou CD133 (vermelho), e-caderina (verde) e vimentina (azul) (C) foram determinados por imunofluorescência. Os núcleos foram coradas com DAPI (A, B: azul; C: cinza). Mostra-se um representante de cólon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Bar = 20 mm)

Co-expressão de B7H1 e CD133 na linha de células HT29 e tecidos de cancro colorrectal

Para investigar o mecanismo como CSCs escapar vigilância imunológica, foi determinada expressão B7H1 na linha de células HT29 e tecidos de cancro colorrectal. Descobrimos que a co-expressão de B7H1 e CD133 foi ubíqua em células HT29 (Fig 4A). Para determinar mais uma expressão B7H1 em tecidos de pacientes, tecidos com cancro colorectal foram recolhidos. EpCAM, um marcador epitelial luminal, foi usada para distinguir os ninhos de cancro e região do estroma [34]. Descobrimos que B7H1 foi expressa, principalmente, em células cancerosas em mais de metade (11/20) de tecidos de cancro colo-rectal (Tabela 4). Mais interessante, cerca de 50% de células cancerosas que expressam CD133 expresso B7H1 (Figura 4B e 4C, Tabela 4). Além disso, B7H1 e CD133 foram sempre co-expressos em EpCAM

+ células (FIG 4B e 4C). Ele indica CD133

+ CSCs pode escapar vigilância imune, expressando molécula inibidora B7H1.

A expressão de CD133 (vermelho) e B7H1 (verde) em células HT29 (A) (Bar = 20 mm), e expressão de EpCAM (azul), CD133 (vermelho) e B7H1 (verde) em tecidos câncer colorretal (b) (Bar = 50 mm) foram determinados por imunofluorescência. Os núcleos foram coradas com DAPI (cinza). A área do retângulo na imagem é ampliada (C) e mostra uma co-expressão típica de CD133 e B7H1 (indicado por setas). É mostrado um rectal representante adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0.

células B7H1 expressar exibir fenótipos EMT em tecidos colorretais

Nós descobrimos que B7H1 foi expressa em CD133

+ células e pode desempenhar um papel na immunoevasion de câncer de células estaminais-like. Seria interessante saber se a expressão de B7H1 está relacionada com EMT. Para lidar com isso diretamente, expressão B7H1 em células fenotípicas de EMT foi determinada em 11 amostras de cancro colorrectal humanas em que CD133 foi co-expressa com B7H1. Semelhante a estudos anteriores [35], B7H1 foi expressa em células de câncer, especialmente na borda de câncer (Fig 5). Nestes casos, especialmente quando parecia que tumor de brotamento, verificou-se que 20% a 40% das células cancerosas B7H1expressing down-regulamentado E-caderina (Fig 5A). Além disso, 10% -25% de B7H1

+ células cancerosas expressaram vimentina, um marcador mesenquimais (Figura 5B), não existem indicando fenótipo EMT em certa B7H1

+ células. Tomados em conjunto, ele sugeriu que a superexpressão de B7H1 pode ser um dos mecanismos immunoevasive não só para CD133

CSCs +, mas também para as células cancerosas EMT fenotípicas transitórios.

A expressão de B7H1 (verde) e E- caderina (vermelho) (A) ou B7H1 (verde) e vimentina (vermelho) (B) foram determinados pela técnica de imunofluorescência. Uma das células que expressam B7H1 é indicado com uma seta. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Mostra-se um representante de cólon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Bar = 20 mm)

Discussão

CSCs são consideradas as “sementes” de cânceres e pode ser enriquecida por células de classificação com base em alguns marcadores de superfície específicos. Embora os marcadores de CSCs ainda são discutíveis, as células cancerosas que expressam certas moléculas específicas exibir CSCs-como as propriedades [9]. CD133 é um dos marcadores de células estaminais hematopoiéticas e ser considerada como um marcador CSCs em cancro colo-rectal [5-7, 27, 28, 36]. Neste estudo, CD133

+ células tinham CSCs-como características, mostrando a capacidade da esfera formando e tumorigenicidade, expressando níveis mais elevados de marcadores de células tronco Out-4 e Sox-2 que foram sobre-expressos tumores em pouco diferenciadas [29, 31] . Além disso, estas células de EMT manifestada perfil de expressão do gene, que tinha sido considerada uma característica importante para os CSCs ligando [15].

Os nossos resultados das CSCs características semelhantes de CD133

+ células foram consistentes com estudos anteriores [5-7]. Ao contrário, há alguns outros resultados mostraram que as células negativas CD133 possuía propriedades CSCs-like vez [27, 28]. Por exemplo, uma linha celular negativa CD133 (NANK) foi estabelecida a partir de xenoenxertos de que derivados a partir de amostras cirúrgicas frescas de cólon primário humano e seus tecidos de cancro do ovário metastáticos transplantados em ratinhos NOD /SCID [28]. células NANK possuía características CSCs semelhantes, tais como a formação de esfera e tumorigenicidade em camundongos NOD /SCID. Comparado com o nosso estudo, ele pode ser encontrado que a origem das células cancerosas eram muito diferentes, o que pode interferir a consistência dos resultados. Além disso, as células NANK diferiu do seu original do cancro, bem como, como a que CD133 e CD44 foram expressos em cancro originais, mas fracamente em NANK. Portanto, parece que este contraste implica o complexo de câncer, em vez de os erros dos métodos de investigação. Embora não seja rigorosa o suficiente para usar CD133 sozinho para identificar CSCs, ele confirmou que CSCs foram enriquecidos em CD133

+ subpopulação e tornou exibir características CSCs-like. É interessante e valioso para explorar os traços desta subpopulação.

CD133

+ células de câncer colorretal em ambas as linhas de células cancerosas e tecidos manifesta as características fez especial e mais fácil de invadir e metástase. Neste estudo, descobrimos que CD133

+ HT29 células mostraram fenótipos EMT e co-expressa B7H1, indicando CSCs podem expressar B7H1 para fugir vigilância imunológica quando invadem através de EMT. Semelhante às células HT29, o nível de expressão de CD133 em tecidos de cancro colorectal foi variável em células diferentes. Estudos anteriores mostraram que a CD133 foi expressa em células cancerosas, mas não hemócitos [4, 5] e a maioria das células do carcinoma expressa uma glicoproteína de membrana de EpCAM [34], que é considerado como um dos marcadores CSC em vários tipos de carcinoma [37] verificaram que .que CD133 foi expressa em EpCAM

+ células (Fig 4), indicando os CD133 células que expressam são células de câncer colorretal. Embora EMT é indicada como a característica de CSCs, se existe ligação inerente entre elas permanecem obscuros. Em estudos anteriores, os CSCs-como células poderia ser gerado por activação EMT induzida em linhas celulares ou modelo de rato [19, 38]. Assim, pensamos que fenômeno semelhante pode existir no cancro colorectal. Na experiência actual, microscópio confocal foi utilizada para detectar diferentes marcadores de expressão em cancros, o que poderia observar expressão várias proteínas em cada célula ao mesmo tempo. Como esperado, verificou-se que CD133

+ células em tecidos de câncer colorretal em humanos teve fenótipos EMT, downregulating E-caderina e upregulating vimentina. Este fenómeno ocorreu em uma porção de células positivas CD133, que pode ser relacionada com o motivo que foi um curso de EMT dinâmico e difícil de apanhar o interruptor. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam a conexão direta entre CSCs e EMT em tecidos de cancro colorrectal.

CSCs têm características biológicas intrínsecas para formar tumor e pode metástase através da EMT. Seria interessante para determinar como eles fugir vigilância imunológica para a sobrevivência final, especialmente em hospedeiros imunocompetentes. B7H1 é uma molécula fundamental negativo co-estimulação levando a immunoevasion em cancros. expressão B7H1 em CD133

+ células cancerosas indica que B7H1 pode desempenhar um papel na CSCs. Recentemente ensaios clínicos mostraram que o bloqueio de PD-1-B7H1 via resulta em bom prognóstico em relação na terapia anti-câncer e expressão B7H1 em tecidos de câncer está associado com o resultado do tratamento [39]. Com base no que encontramos aqui, este resultado notável pode estar relacionado a controlar CSCs segmentação por via PD-1-B7H1. B7H1 é considerado um alvo melhor do que outra molécula de co-estimulação negativa, CTLA-4, porque a distribuição de B7H1 /DP-1 é eixo dentro do microambiente do tumor mais selectivamente [40, 41]. Nossos resultados sugerem que a segmentação B7H1 pode ferir o “principal culpado” de câncer, as células-tronco do câncer, no cancro colorectal. Além disso, alguns B7H1

+ manifestado EMT-como fenótipo, sugerindo a ligação potencial do immunoevasion e EMT. No modelo de camundongos transgênicos, que tinha sido provado que a regulação positiva de B7-H1 na pele de células epiteliais promovido EMT e acelera carcinogênese [42], que foi consistente com a nossa constatação de que B7H1 células cancerosas expressando teve fenótipos EMT em tecidos de cancro colorrectal.

em conjunto, nossos resultados mostraram expressão B7H1 e fenótipos EMT em CD133

+ células, indicando os mecanismos potenciais para CSCs para escapar vigilância imunológica e invadem tecidos distantes. Embora alguns estudos dúvida sobre CD133 para marcador ‘CSCs, nossos resultados sugerem que no CD133

+ subpopulação incluiu uma seção de células possui características que ajudam as células invadem e metástase, especialmente nos quais fenótipos e EMT manifestos expressar B7H1. Tais uma pequena parte das células cancerosas têm tumorigenicidade poderoso e poderia invadir e metástase sem ataque do sistema imunológico, que pode fechar as CSCs teóricas em aspectos funcionais. No entanto, ainda é incerto se a expressão EMT e B7H1 de CSCs são dois eventos independentes ou regulados pela mesma via de sinalização, ao mesmo tempo. Foi demonstrado que o sinal de mTOR e factor de -1α indutível por hipoxia, o que era um factor importante para induzir EMT, CD133 expressão regulada em células cancerosas [43], indicando que a expressão de CD133 e EMT fenótipos foram associados à hipoxia e pode ser regulado por mTOR sinal. Além disso, B7H1 foi regulamentada pelo PTEN através da PI3K /AKT /mTOR sinalização em câncer pancreático [44]. Estes estudos sugerem que a sinalização mTOR podem estar envolvidos na relação entre EMT e evasão imune em CSCs. Depois disso, estamos tentando descobrir o caminho importante preocupado com EMT e immunevasion em CSCs em um estudo mais aprofundado, que pode ser um alvo crucial na terapia do cancro.

Informações de Apoio

S1 Fig. CD133 é pouco expresso em tecido paraneplastic.

Imunofluorescência de congelação da amostra de câncer de cólon mostra que há uma região de relativa normal ao lado de ninhos de câncer, onde CD133 (vermelho) é bastante mais fraco (à esquerda) do que no ninho câncer (à direita) . DAPI (cinzento) foi utilizado para corar nuclear. Mostra-se um representante de cólon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Bar = 50 mm)

doi: 10.1371 /journal.pone.0135528.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Dr Yongwen Chen para comentários perspicazes, Prof. Lieping Chen para o anticorpo B7H1 e Wei Sun e Liting Wang para excelente assistência técnica para a coleção de imagens por varredura a laser confocal microscópio de fluorescência.