Abstract

Objectivo

procianidinas de semente de uva (PC) são os oligómeros e polímeros conhecidos pela sua actividade biológica no intestino flavan-3-ol. extracto de semente de uva (GSE) têm sido relatados para reduzir a lesão intestinal num modelo de rato da mucosite. Buscou-se investigar os efeitos das frações PC purificadas diferem em grau médio de polimerização (MDP) combinados com quimioterapia sobre a viabilidade das células cancerígenas do cólon (Caco-2) 5-fluorouracil (5-FU).

Design

SixPC frações (F1-F6) foram isolados a partir de sementes Cabernet Sauvignon em dois estádios de maturação: verdes pré-veraison (imaturos) e maduros, gradiente passo (madura), utilizando, cromatografia de baixa pressão numa coluna Sephadex LH-20 resina. As fracções foram testadas em células Caco-2, sozinhos ou em combinação com 5-FU. As fracções eluídas foram caracterizados por cromatografia de permeação de gel e phloroglucinolysis. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio) (MTT).

Resultados

Todas as fracções isoladas significativamente reduzida Caco-2 a viabilidade celular em comparação com o controlo (P 0,05), mas F2 e F3 (MDP 2-6) foram as fracções mais activas (imaturo F2 = 32% MDP 2,4, F3 = 35% MDP 5,8 e amadurecer F2 = 13 % MDP 3,6 e F3 = 17% MDP 5,9; percentagem de células viáveis ​​restantes) em células Caco-2. Quando combinada com 5-FU, as fracções imaturos F1-F3 aumentou os efeitos de toxicidade celular de 5-FU por 27-73% (

P 0,05

). fracções de PC semente madura (F1-F4) aumentou significativamente a toxicidade de 5-FU por 60-83% contra as células Caco-2 (

P 0,05

). Além disso, algumas frações isoladamente foram mais potente em diminuir a viabilidade em células Caco-2 (

P

0,05; frações imaturas = 65-68% e frações maduros = 83-87%) em comparação com somente 5-FU ( 37%).

Conclusões

PCs de MDP 2-6 (imaturos F1-F3 e F1 maduro e F4) não só aumentou o impacto do 5-FU em matar células Caco-2, mas também superou padrão quimioterapia 5-FU como um anti-câncer agent.The bioatividade do PC é, portanto, atribuído principalmente aos PCs de baixo peso molecular

Citation:. Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy JA, Bastian setembro (2014) Baixo Peso Molecular Procyanidins a partir de uvas Sementes aumentar o impacto de 5-fluorouracil quimioterapia em

Caco-2

células de cólon humano. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10.1371 /journal.pone.0098921

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de novembro de 2013; Aceito: 07 de maio de 2014; Publicação: 06 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cheah et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Professor Gordon Howarth é apoiado por um Senior Research Fellowship Saúde e Instituto de Pesquisa médica do Conselho Câncer da Austrália do Sul. O presente estudo foi realizado no âmbito da colaboração entre a Ciência Wine and Business Group, da Universidade de Adelaide e do Instituto Australian Wine Research (AWRI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer colorretal tem a segunda maior taxa de mortalidade, e é a quarta forma mais frequentemente diagnosticado de câncer nos Estados Unidos [1]. O tratamento primário para câncer de cólon envolve a ressecção intestinal cirúrgico e quimioterapia, na maioria das vezes por 5-fluorouracil (5-FU) [2]. Infelizmente, a quimioterapia não pode discriminar entre células normais e cancerosas, e tem como alvo áreas onde as células são substituídas em uma taxa elevada, como na boca e intestino [3]. Isto leva ao desenvolvimento de mucosite (a toxicidade gastrointestinal). tratamentos de mucosite atuais são ineficazes como eles têm como alvo apenas os sintomas, mas não a patogênese da doença [3]. Assim, é importante procurar novos tratamentos alternativos que não só visam mucosite, mas também aumentam a ação quimioterápica sem comprometer o bem-estar dos pacientes.

Cada vez mais, extratos de semente de uva (GSEs) estão sendo estudados devido à sua relataram benefícios de saúde para uma variedade de doenças como o cancro [4], doenças cardiovasculares [5], [6] e colite ulcerativa [7], [8]. Os efeitos benéficos de GSE têm sido atribuídas a procianidinas polifenólicos (PCs) [9], que compreendem subunidades de flavan-3-ol. O comprimento do polímero de PC é descrita por o grau de polimerização (DP). Devido à sua estrutura de polimerizado, a absorção celular está restrito para oligómeros com um DP mais baixo, deixando as moléculas de DP maiores para adsorção no lúmen do intestino após a administração oral [10], [11]. Uma série de estudos têm relatado a polimerização e galloylation de PCs para ser responsável por seus efeitos anti-proliferativa em células transformadas [9], [12], [13] GSEs sugerindo.

Há crescentes evidências são eficazes a redução da proliferação de células cancerosas, sem serem citotóxicos para as células normais [14]. Além disso, a GSE demonstrou melhoria parcial de dano intestinal num modelo de rato de mucosite intestinal e reduziu a toxicidade celular gastrointestinal após o tratamento de quimioterapia em células IEC-6 intestinais normais [15]. No entanto, os componentes bioactivos em GSE permanecem desconhecidos. O objectivo primário do estudo foi identificar a composição química das fracções bioactivas de PC, e investigar o seu potencial em combinação com a quimioterapia 5-FU, os seus efeitos sobre a viabilidade das células de cancro do cólon. Quando em combinação com 5-FU, certas frações PC reforçada toxicidade em células de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

declarações éticas

amostras de uvas Cabernet Sauvignon foram obtidos a partir comercial vinhedos, elogios Vinhos (Orlando) na região de Langhorne Creek crescente de South Australia, que tem uma latitude 35 ° 16’11.56 “S e longitude 139 ° 00’14.47” e, com uma elevação de aproximadamente 28 m acima do nível do mar. Não foi necessário nenhum licenças para o estudo descrito, que respeitou todas as normas relevantes

amostragem Uva e preparação

amostras de uvas foram colhidas em diferentes estágios de maturação:. imaturo (preveraison, sementes verdes) e madura (25-26 ° Brix, sementes marrom) durante a estação de crescimento de 2009. bagos de uva foram preparados de acordo com um método anteriormente descrito [16], no qual as uvas foram recolhidos e mantidos congelados a -20 ° C. Enquanto ainda congelado, as sementes foram removidas da carne com um bisturi. As sementes foram, em seguida, limpa de carne com uma toalha de papel e re-congeladas a -20 ° C antes da extracção.

Preparação e extração de sementes procianidinas (PCs)

extração PC começou por extrair sementes (100 g) durante a noite durante 18 h em 70% de acetona (200 ml, v /v) e ácido ascórbico (1 g /L). O extracto foi concentrado sob pressão reduzida a 35 ° C (evaporador rotativo HeidolphLaborota 4011, John Morris Scientific, Adelaide, Austrália), e liofilizou-se para um pó seco (Dynavac FD3 liofilizador, Dynavac Pty Ltd, Sydney, Austrália). Os rendimentos para cada amostra foram: imaturo 6,31 g e madura 10,29 g. pó de semente de PC (5 g) foi dissolvido em 50 mL de metanol (60%, v /v) contendo ácido trifluoroacético (TFA) (0,05%, v /v) e, em seguida, aplicado (~18.3 mL /min) e um 300 mm x 21 mm de coluna de vidro (Michel-Miller, Vineland, NJ, EUA), contendo resina de cromatograf ia de Sephadex LH20 (Amersham, Uppsala, Suécia) com um volume de leito de aproximadamente 93 ml, e lavado em 250 mL de metanol (60%, v /v) contendo TFA (0,05%, v /v) para remover monómeros de baixo peso molecular. PC foi então recuperado em 150 mL de acetona aquosa (70%, v /v) e os extractos foi concentrada num evaporador rotativo a 35 ° C para remover a acetona. A solução aquosa foi extraída com hexano para remover o material lipofílico residual usando um funil de separação. O extrato aquoso foi em pó liofilizado e recuperado montante para dois extratos foram; imaturo, 2,5 g e madura, 0,9 g, respectivamente. Os pós foram mantidas sob atmosfera de azoto e à temperatura de -20 ° C antes do fraccionamento.

Para o fraccionamento de PCs, pó de semente de PC (0,5 g) foi dissolvido em metanol (60%, v /v) contendo TFA (0,05% , v /v) e aplicadas à mesma coluna sob condições idênticas. extracto de semente de PC foi fraccionado de acordo com um método de eluição em gradiente escalonado descrito anteriormente [16] para produzir 6 fracções com o aumento do grau médio de polimerização (MDP) e pesos moleculares de PCs designados como F1 a F6. As fracções eluídas foram concentradas sob pressão a 35 ° C para remover os solventes orgânicos e liofilizou-se ainda mais em pó seco. As fracções isoladas foram armazenadas a -20 ° C antes da análise. extrato de semente de uva foi uma oferta generosa da Tarac Technologies (GraPex tanino sementes; North Adelaide, Austrália do Sul) e foi incluída no estudo como um controle. GSE (1 g) foi dissolvido em metanol (60%, v /v) contendo TFA (0,05%, v /v) e fraccionado em conformidade.

catálise ácida de PC na presença de excesso de f loroglucinol (Phloroglucinolysis)

Phloroglucinolysis foi usado para determinar a composição de subunidades, MDP e galloylation de PC. Pholoroglucinolysis foi realizada de acordo com um método anteriormente descrito [16]. fracções de sementes foram dissolvidos em metanol (10 mg /ml, v /v) e volumes iguais (25 ul) de extracto e uma solução de floroglucinol (0,2 N de HCl e 100 g /L de f loroglucinol e 20 g /L de ácido ascórbico) para se obter uma última PC concentração de 5 g /L. A reacção phloroglucinolysis foi realizada a 50 ° C durante 25 min e analisada por RP-HPLC, utilizando (-) -. Epicatequina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) como padrão quantitativo

Cromatografia de Permeação em Gel ( )

cromatografia de permeação em gel GPC foi realizada com base num método descrito anteriormente [16]. A técnica GPC caracteriza informação sobre a distribuição do tamanho de PC para cada fracção. amostras fraccionadas (10 mg /mL) foram dissolvidos em metanol e em seguida diluído com 4 volumes de fase móvel de HPLC (

N, N-dimetilformamida

contendo ácido acético glacial (1%, v /v), água (5 %, v /v) e cloreto de lítio 0,15 M). A taxa de fluxo foi mantida a 1 ml /min com uma temperatura de coluna de 60 ° C e a eluição foi monitorizada a 280 nm. A quantidade máxima de PC injectada na coluna foi de 40 ug. frações de sementes de PC de um estudo anterior [17] foram utilizadas como padrões para calibração. As curvas de calibração de PCs fracionados com a sua distribuição da massa acumulada foram tabulados e a massa molecular média das frações foi previsto em 50%.

férrico reduzindo o poder antioxidante (FRAP) de ensaio

Este ensaio foi realizado na sequência de um protocolo modificado [18]. Resumidamente, o reagente FRAP foi preparado (300 mM de tampão de acetato, pH 3,6, 10 mM de 2,4,6-tri [2-piridil] -s-triazina () TPTZ solução em HCl 40 mM, cloreto de 20 mM ferroso; em 10: 1:01 v /v) e mantidos no escuro a 37 ° C antes da análise. As fracções foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) (0,1 mg /ml) e 15 ul foram adicionados a placas de 96 poços. 15 ul de reagente de FRAP foi adicionado às cavidades contendo as fracções e a placa foi lida a 593 nm após 4 min (Multiskan Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finlândia) usando o software SkanIt 2.2. Sulfato ferroso (0,1-1 mM) foi usada para construir uma curva padrão e valores de FRAP compostos de teste foram expressas como mMFe (II) /g de amostra. Cada tratamento foi testado em triplicado e toda a experiência foi repetida três vezes. Os dados são expressos como média ± SEM de 3 experiências independentes.

preparação celular e tratamento experimental

A linha de células de cancro do cólon humano, Caco-2 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EUA). As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) a 37 ° C e em 5% de CO

2 incubadora. Os meios foram substituídos por duas vezes em cada semana. fracções de PC foram dissolvidos em DMSO e manteve-se a -20 ° C antes da análise. células Caco-2 foram semeadas a 1000 células /poço em placas de 96 poços de cultura de tecidos (Grenier Bio-One, Victoria, Austrália) e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 48 h para permitir a ligação. Após 48 h de incubação, os meios foram substituídos com diferentes concentrações de fracções de sementes dissolvidos em DMEM (ug /ml), contendo 0,025% (v /v) de DMSO e 5-FU (100 uM) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd., Victoria, Austrália). As células foram adicionalmente incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 para 24, 48 e 72 horas.

Ensaio MTT

O (3- (4,5-dimetiltiazol-2il ) -2,5-difenil-tetrazólio) (MTT) foi realizada com base num método descrito anteriormente, com ligeiras modificações [19]. Após exposição aos tratamentos (extractos de sementes e 5-FU), 50 ul de MTT (1 mg /mL em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina) foi adicionado a cada poço e ainda incubada a 37 ° C, 5% de CO

2 para 4 h. Após 4 h, o meio foi aspirado e 100 mL de DMSO adicionados para dissolver o produto de formazano. As placas foram colocadas num incubador com agitação durante 15 min e lidas a 570 nm por um espectrofotómetro de UV. Cada tratamento foi testado em triplicado e toda a experiência foi repetida três vezes. Os dados são expressos como média ± SEM de 3 experiências independentes. Os dados foram expressos como o número de células viáveis ​​em comparação com a percentagem de células de controlo tratadas com meio DMEM isento de soro. As células de controlo representam qualquer célula tratada com DMEM isento de soro apenas, ou de células tratadas com 100 uM de 5-FU.

A análise estatística

Cada experiência à base de células foi realizada pelo menos 3 vezes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando XLSTAT versão 12.0 para Windows ou PASW versão Estatística 18. A análise estatística foi determinada por ANOVA de duas vias com o teste de Tukey

post-hoc

.

Um coeficiente de correlação de Pearson foi calculado para determinar a relação entre a viabilidade de células, a composição PC e valor antioxidante. A significância estatística foi considerada em

P

. 0,05

Chemicals

A acetona, ácido ascórbico, metanol, ácido trifluoroacético (TFA), floroglucinol, (-) – epicatequina, N, N-dimetilformamida, cloreto de lítio, acetato de sódio (CH3 COO), 2,4,6-tri [2-piridil] -s-triazina (TPTZ), cloreto ferroso e o metanol foram adquiridos a Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis , MO. O ácido clorídrico (HCL), ácido acético glacial, reagente de Folin-Ciocalteau e sulfato ferroso foram adquiridos a AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Austrália. soluções de cultura de tecidos incluem de Eagle Modificado por Dulbecco Meio Mínimo Essencial (DMEM), com fosfato de Dulbecco tamponado salino, sulfóxido de dimetilo (DMSO) e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio) (MTT) foram comprado de Gibco BRL, vida Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. Ltd.

Instrumentação

Um modelo Agilent 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd., Melbourne, Austrália) foi utilizado com software Chemstation para análise cromatográfica.

Resultados

Caracterização das frações PC

GSE foi incluído no estudo atual como um controle. A composição de GSE PC é ilustrada na Tabela 1. Em comparação com extractos de sementes de Cabernet Sauvignon, GSE tinha conversão baixa massa (23,8% w /w) e também uma massa molecular mais baixo, tal como medido por GPC e phloroglucinolysis. As subunidades terminais PC em GSE foram maioritariamente dominado por (-) – epicatequina-3-

O

-gallate. Devido à aparentemente baixo contribuição de PCs em GSE, foram isoladas PCs de fresco semente Cabernet Sauvignon colhidas em diferentes estágios como relatórios anteriores mostraram uma alta conversão em massa em sementes de uva não transformados [16].

Comparando purificada PC de ambas as amostras de sementes, a semente imatura teve maior conversão em massa (87%) em comparação com sementes maduras (71%) (Tabela 2). Os PCs purificados foram ainda mais fraccionadas em 6 fracções com o aumento da massa molecular ou MDP. O rendimento de conversão da massa para a conversão de PC em PC conhecido foi 49%, excepto para a mais elevada MDP F6 (aproximadamente 37%). As principais diferenças entre as fracções de sementes imaturos e maduros foram que frações maduros tiveram uma maior proporção de (-) – subunidades terminais epicatequina (9-30%) em comparação com as frações imaturos (2-11%). Ambas as fracções de sementes maduros e imaturos mostraram um padrão semelhante de diminuição (-) – epicatequina subunidades terminais com o aumento do MDP. Curiosamente, os aumentos de polimerização ou o peso molecular foram controladas principalmente por (-) – epicatequina-3-

O

subunidades de extensão -gallate. O galloylation de fracções imaturos variou 15-35% e fracções maduras variar 9-24%. Imaturo F2 teve a maior galloylation (35%), impulsionado principalmente por uma alta proporção de (-) -. Epicatequina-3-

O

-gallate (88%)

Antioxidante capacidade de fracções de sementes

a capacidade antioxidante das fracções de semente foi medida pelo ensaio de FRAP (Figura 1). GSE, que continha uma mistura de oligómeros e polímeros de computadores, foi incluído como um controlo positivo para determinar a actividade antioxidante das fracções de sementes. Em comparação com GSE (5 mM /g), todas as fracções tinham valores de FRAP mais elevados, variando 5,4-8,8 mM /g. A capacidade antioxidante das fracções diminuiu nas fracções PC mais polimerizados. Os valores de FRAP foram negativamente correlacionados com MDP (r

2 = -0,81,

P Art 0,05).

Os resultados são expressos como média ± SEM de 3 experiências independentes. A análise estatística foi determinada por ANOVA de uma via com

post-hoc

teste de Tukey. Valores com letras diferentes (a, b, c) em cada coluna são estatisticamente diferentes em P . 0,05

Efeitos de frações de sementes sobre a viabilidade das células Caco-2

A efeitos citotóxicos de fracções de sementes em células Caco-2 foram determinados pelo ensaio de MTT (Figura 2). células Caco-2 foram expostas a semente fracções durante 72 horas e os dados expressos como IC

50, definido como a dose de cada composto que inibe a viabilidade celular de 50%, o que representa o valor médio de três experiências independentes. Todas as fracções mostrou um grau de toxicidade conforme indicado pelos valores de absorvância diminuiu. A IC

50value (média de três experiências independentes) para fracções de sementes imaturas (F1-F6) variou 17,7-70,2 jig /ml (Figura 2A). O número de células viáveis ​​foi positivamente correlacionada com o PDM de frações de sementes imaturas (r

2 = 0,48,

P Art 0,05), ou seja, as frações com maior MDP (F5 e F6) foram menos tóxicos para as células Caco-2. tendências similares em termos de efeitos citotóxicos também foram observados para a aplicação de fracções semente madura (Figura 2b), onde o número de células viáveis ​​foi de forma semelhante correlacionada com o MDP das fracções (R

2 = 0,50,

P

0,05). fracções semente madura exibiu citotoxicidade mais forte em comparação com as fracções de sementes imaturas (Figura 2A e 2B).

Os dados são expressos como IC

50 ou com a dose (ng /mL) inibindo a viabilidade das células a 50% (média ± SEM ) de 3 experiências independentes. A análise estatística foi determinada por ANOVA de uma via com

post-hoc

teste de Tukey. Valores com letras diferentes (a, b, c) em cada coluna eram estatisticamente diferentes em P . 0,05

O efeito combinado das fracções de sementes isoladas e 5-FU sobre a viabilidade das células Caco-2

O efeito combinado das fracções de sementes e 5-FU sobre as células Caco-2 foi investigado (Figura 3). Para as fracções de sementes imaturas, a viabilidade das células Caco-2 foi significativamente inibida por todas as fracções de sementes (Figura 3A). Comparado a GSE (67%), F2 e F3 dos extratos de sementes imaturas foram mais tóxicos para as células Caco-2 (F2, 32% e F3, 35% do valor de controle,

P Art 0,05). No entanto, quando as fracções de sementes estavam presentes com 5-FU (100 uM), os efeitos inibidores do crescimento de 5-FU foram significativamente melhoradas (

P

0,05) (Figura 3A). 5-FU reduziu significativamente a viabilidade celular para 62% dos valores de controlo (

P

0,05). F1-F3 aumentou significativamente a actividade inibidora do crescimento de 5-FU (27%, 73% e 56% respectivamente, comparado com o controlo 5-FU;

P

0,05). F2 pode, portanto, ser considerado um agente de quimioterapia mais potente que não fraccionada disponível comercialmente IGE, que só aumentou o efeito inibidor do crescimento de 5-FU por 55% (

P

0,05; em comparação com o controlo 5-FU). Além disso, também descobrimos que F2 imaturo (32%) e F3 (35%) eram mais potentes do que o 5-FU (62% do valor de controlo;

P

0,05) na redução de Caco-2 viabilidade.

Os dados são apresentados como a percentagem de viabilidade celular relativa a viabilidade das células de controlo. Os dados são expressos como média ± SEM de 3 experiências independentes. A análise estatística foi determinada por ANOVA de duas vias com

post-hoc

teste de Tukey. Valores com letras diferentes (A, B, C) em cada coluna eram estatisticamente diferentes em P 0,05. * Indica diferença significativa em 5-FU grupo tratado quando comparado com o controlo 5-FU.

fracções semente madura comportou-se de um modo semelhante ao fracções de sementes imaturas (Figura 3B). frações de sementes maduras reduziram significativamente a viabilidade celular (

P Art 0,05). F2 e F3 foram mais citotóxica para as células Caco-2 (13% e 17%, respectivamente,

P

0,05) do que GSE (47%) (Figura 3B). Quando as células foram expostas às sementes fracções e 5-FU, todas as fracções de semente melhorada a capacidade de 5-FU para reduzir a viabilidade das células. GSE aumentou significativamente a inibição de crescimento de 5-FU por 49%. No entanto, F1-F4 aumentou significativamente o efeito inibitório de crescimento de 5-FU (62%, 83%, 80% e 60% respectivamente, comparado com o controlo 5-FU;

P

0,05). Além disso, o F2 (13%), F3 (17%) e F4 (50%) fracções foram mais potentes do que o 5-FU sozinho (65% do valor de controlo;

P

0,05) (Figura 3B ).

Discussão

PCs de semente de uva foram relatadas para exercer propriedades de promoção da saúde, especialmente no intestino [14], [15], [20], [21]. Em adição à sua eficácia anti-cancro, GSE foi demonstrada para reduzir a toxicidade gastrointestinal após o tratamento de quimioterapia de animais saudáveis ​​e em células intestinais normais [15]. Embora haja cada vez mais provas para apoiar as propriedades quimioterápicos de GSE em câncer de cólon, a identificação dos componentes bioativos responsáveis ​​permanece indefinida.

No estudo atual, frações PC isoladas de comercialmente disponível GSE apresentaram diferentes PDMs e tamanhos moleculares. No entanto, estas fracções tinha rendimentos muito baixos de conversão ( 37%), o que indica que menos de 40% das fracções foram caracterizadas utilizando as técnicas de análise seleccionados, o que é inaceitável para este estudo. A explicação para o rendimento de conversão baixa em PC fractionsmay ter sido devido à oxidação que ocorre durante a geração de GSE do processo de vinificação. Assim, decidiu-se isolar frações PC a partir de uvas frescas, coletadas em diferentes vencimentos: imaturo (pré-pintor) e maduro (maduro). Esta decisão foi baseada na observação de que sementes imaturas têm um rendimento de conversão maior do que sementes maduras [22], justificados pelo estudo. Além disso, estudos utilizando espectrometria de massa são necessários para definir ainda mais a pureza de PCs isoladas de sementes de uva.

Os efeitos citotóxicos de frações de PC sobre as células cancerosas têm sido relatados anteriormente [9], [12], [13 ]. No entanto, se esses efeitos se deu por meio de sinalização extracelular ou na sequência de absorção de PCs não foi tentada. O presente estudo mostrou que as frações mais ativas que afetam a viabilidade das células Caco-2 continha oligómeros menores: F2 e F3. Os efeitos citotóxicos mais potentes observadas em frações de sementes Cabernet Sauvignon, em comparação com GSE pode ter refletido um rendimento PC menor em GSE (~24%) em comparação com PC isolado a partir de uvas frescas (-60%).

A absorção de PC através das membranas celulares foi muito dependentes de seus PDMs [23], [24]. Apenas certos menores PCs MDP são absorvidos durante o trânsito no intestino, deixando as maiores PCs MDP (MDP 7) depositados no lúmen intestinal. Este resultado suporta os dados actual, em que F2 e F3 (6/2 MDP) e susceptível de ser absorvida através das membranas celulares foram mais potentes do que as fracções com um maior MDP, que exercem apenas um efeito de superfície. No entanto, F2 e F3 foram mais bioativo de F1, possivelmente devido à sua maior percentagem de galloylation e proporção de epicatequina-3-

O

-gallate subunidades como terminais, em comparação com F1. Este resultado está de acordo com outros estudos em que frações de PC com maior galloylation eram mais citotóxico do que frações PC com menor galloylation quando testado em células cancerígenas do cólon [9], [25]. No entanto, o verdadeiro mecanismo de PCs no crescimento das células permanece desconhecido. PC absorvida pode desempenhar um papel vital no interferir com vias de sinalização celular. Computadores têm sido referidos como sendo inibidores de receptores de androgénio em células de cancro da próstata [26], [27] e receptores de factor de crescimento epidérmico nas células de cancro do cólon [28]. Além disso, os computadores são conhecidos para atenuar a PI3-quinase (serina /treonina-proteína-quinase) via de [14], que pode levar à indução da paragem do ciclo celular na fase G1 [20] e a activação da via de indução de apoptose [29]. Futuros estudos que investigam os pontos finais do crescimento celular e apoptose, incluindo a captação PI, 3 atividade da caspase e conteúdo de DNA sub-G1 são garantidos.

resultados anteriores demonstraram que os efeitos citotóxicos de PCs são dependentes de sua MDP [9] , [13]. No entanto, o estudo mostrou que as frações com maior MDP (7-16) não exercem efeitos citotóxicos em células cancerígenas do cólon. No entanto, o estudo utilizou um sistema de solventes diferentes para isolar fracções de PC em comparação com outros estudos [9], [30]. Este sistema solvente isola fracções de PC com uma ampla gama de massa molecular (619-6063 g /mol) e MDP (2-9) em comparação com outros métodos (massa molecular de 552-1.232 g /mol, MDP 1-4); o que implica que os estudos anteriores medido apenas fracções de PC limitado ( 1200 g /mol). para as suas actividades biológicas

A capacidade antioxidante dos PCs é extremamente dependente do seu grau de polimerização e galloylation [9]. A redução de iões metálicos, como medido pelo ensaio de FRAP, acredita-se estar positivamente correlacionado com o número de grupos hidroxilo presentes nas moléculas, e que os pontos de fixação para a transição iões metálicos nas moléculas de flavonóides são no

o

-catechol grupo de anel B [31]. No entanto, este não foi o caso no estudo atual. frações de PC com maior MDP foram antioxidantes mais fracos, o que está de acordo com estudos anteriores, [33] [32]. Fracções com subunidades maiores tendem a auto-agregado e causar impedimento estereoquímico [33], [34], expondo menos grupos hidroxila para atividades de eliminação de radicais. Futuros estudos devem ser realizados para abranger as propriedades antioxidantes dos PCs de semente de uva, incluindo o impacto sobre a capacidade antioxidante celular.

O presente estudo foi realizado com base com base em um estudo anterior do GSE e quimioterapia sobre a viabilidade de cólon células de câncer [35]. As doses de fracções de semente de uva no presente estudo foram seleccionados com base na base do presente estudo anterior. 5-FU é uma droga anti-metabolitos que bloqueiam a síntese de ADN através da inibição da timidilato-sintase [3] fracções de extracto de semente de .Quando foram combinadas com 5-FU, não só aumentou o impacto de 5-FU em matar células Caco-2, mas também ultrapassou os 5-FU como um agente anti-cancro. No presente estudo, os efeitos de fracções de PC e 5-FU sobre a viabilidade das células Caco-2 foram examinados ao longo de 24-72 h. 5-FU (100 uM) reduziu significativamente o câncer células viabilidade de 60-80%, toxicidade gastrointestinal em doentes com cancro. Exposição da fracção PC e 5-FU às células durante 24-48 h, mostrou uma tendência para um efeito sinérgico, mas não foi significativo (dados não apresentados). Além disso, um maior tempo de exposição (72 horas) para fracções de PC e 5-FU resultou em maior redução da viabilidade celular. O estudo também revelou que frações de sementes maduras foram superiores às frações de sementes imaturas como agentes quimioterápicos contra o câncer de cólon

in vitro

. O perfil química das fracções mostrou que a semente madura estes efeitos podem ser movidos por sua maior proporção de (-) – epicatequina subunidades como terminais em comparação com o extracto de semente imatura. Outra explicação possível poderia ter sido a distribuição no interior de cada fracção de uma percentagem mais elevada de material de baixo peso molecular nas sementes maduras do que as sementes imaturas.

O presente estudo mostrou que as fracções mais activas que afectam a viabilidade das células Caco-2 foram F2 e F3. No entanto, se estes efeitos ocorreram por meio de sinalização extracelular ou na sequência de captação de PCs não é conhecido. Mais estudos são necessários para determinar a absorção intestinal de frações PC em linhas de células intestinais normais. ensaio TheMTT é uma medida indireta da viabilidade celular com base na atividade metabólica. A redução de viabilidade celular observada no presente estudo poderia ser atribuído a um efeito sobre o ciclo celular ou proliferação celular. Assim, estudos adicionais investigar ciclo celular, a proliferação celular e actividades de morte celular (Anexina V /coloração PI, ensaio de libertação de LDL, caspase-3 e Bcl-2) quantificação poderia fornecer evidências do impacto de tamanhos específicos de PCs oncell sinalização. frações PC testes em outras linhas de células de cólon (normais e neoplásicas) pode excluir toxicidade geral e fornecer mais uma prova do potencial de PC.

Em conclusão, mais estudos são necessários para determinar o mecanismo molecular de F2 e F3 em vias celulares associado a neoplasia do cólon. Maduros extratos de semente de PC não só tem usos potenciais na saúde humana, mas alsoin vez de valor agregado para a indústria de produção de vinho, como as sementes de uvas maduras são a principal subprodutos da vinificação. Nossos dados fornece evidências convincentes de que a combinação de frações PC e 5-FU pode ser um agente quimiopreventivo potencial nos regimes de tratamento de câncer de cólon; no entanto, ainda de confirmação

in vitro

estudos são necessários, com diferentes classes de medicamentos de quimioterapia seguido de

in vivo

ensaios modelo câncer para definir melhor o papel potencial dos PCs de semente de uva contra o câncer de cólon.