Abstract

A acrilamida, um possível carcinógeno humano, é formado em certos alimentos ricos em carboidratos processados ​​em altas temperaturas. Nós avaliamos se acrilamida na dieta, em doses (0,5, 1,0 ou 2,0 mg /kg de ração), refletindo níveis superiores encontradas em alimentos humanos, modulada tumorigênese cólon em dois modelos de roedores. ratos F344 macho foram randomizados para receber dietas sem (controlo) ou com acrilamida. 2 semanas mais tarde, os ratos em cada grupo receberam duas injecções subcutâneas semanais de qualquer azoximetano (AOM) ou solução salina, e foram sacrificados 20 semanas após as injecções; cólons foram avaliadas para os tumores. Os ratinhos macho nu atímicos (

nu /nu), rolamento

adenocarcinoma de cólon humano HT-29, células derivadas de xenoenxertos de tumor receberam as dietas sem (controlo) ou com acrilamida; crescimento do tumor foi monitorado e os ratinhos foram mortos 4 semanas mais tarde. No estudo de rato F344, não foram encontrados tumores nos cólons dos ratos injectados com soro fisiológico. No entanto, a incidência de tumores de cólon foi de 54,2% e 66,7% no controle e os 2 mg /grupos com injeção de OMA tratadas com acrilamida kg, respectivamente. Embora a multiplicidade de tumores foi semelhante em todos os grupos de dieta, o tamanho do tumor e carga foram maiores no grupo de acrilamida de 2 mg /kg em comparação com o controlo de AOM. Estes resultados sugerem que a acrilamida por si só não é um “agente cancerígeno completo”, mas age como um “co-agente cancerígeno” pelo aumento dos efeitos de OMA. O estudo nua de rato não revelou diferenças no crescimento de xenoenxertos de tumor do cólon humano entre os ratinhos tratados com acrilamida e de controlo, sugerindo que a acrilamida não ajudar na progressão de tumores estabelecidos. Assim, acrilamida de origem alimentar em níveis comparáveis ​​aos encontrados em alimentos para seres humanos não é nem um carcinogéneo independente nem um promotor de tumores no cólon. No entanto, nossos resultados caracterizar um perigo potencial de acrilamida como um co-carcinógeno cólon em associação com conhecidos e possivelmente outros iniciadores de tumor ambientais /promotores

Citation:. Raju J, Roberts J, Sondagar C, Kapal K, Aziz SA, Caldwell D, et al. (2013) Risco de cancro do cólon Insignificante de Food-Borne acrilamida Exposição em ratos F344 masculinos e Nude (

nu /nu

)-ratinhos portadores de cólon humano xenoenxertos de tumores. PLoS ONE 8 (9): e73916. doi: 10.1371 /journal.pone.0073916

editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de maio de 2013; Aceito: 23 de julho de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Raju et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro para esta pesquisa foi fornecido a partir do Plano de Gestão de Substâncias Químicas, a Health Canada, Governo do Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A descoberta de acrilamida, um provável agente cancerígeno de classe 2A humano [1] e de roedores cancerígeno [2-5], em alimentos populares e rápidos [6] tem levantado preocupações de saúde pública [7]. Níveis elevados de acrilamida são formadas em alimentos processados ​​a altas temperaturas (bicarbonato de fritura e) através da reacção de Maillard entre o grupo amino de asparagina e o grupo carbonilo de açúcares redutores [8]. Alimentos como batatas fritas, batatas fritas e tortilha, alimentos cozidos, cereais matinais e café torrado conter a acrilamida em partes por milhão concentrações [9-13]. Um estudo recente descobriu que as crianças não-amamentadas com idades entre 6-12 meses foram expostos a acrilamida de alimentos comerciais com o nível de acrilamida média determinada a ser 73 mg /kg em pó produto fórmula e 10,5 mg /L no produto potável [14]. Uma vez ingerido por seres humanos, a acrilamida e o seu metabolito glycidamide epóxido pode ligar-se a hemoglobina e o DNA para formar aductos, e pode interagir com outras proteínas a nível celular [15]. A toxicocinética, resposta à dose e risco de identificação de acrilamida foram elegantemente revisto por Shipp et al. (2006) [15]. A literatura está repleta de dados experimentais de apoio à caracterização do risco de acrilamida como uma substância cancerígena, genotoxin e neurotoxina.

Em um estudo com um roedor de 2 anos realizado de acordo com a OECD-451, acrilamida (administrado na água de beber ) aumentou a incidência de tumores na glândula tiróide e cavidade oral em ambos os sexos, bem como da glândula mamária em mulheres, e testículos nos machos [4]. Estudos em vários modelos de ratinho de cancro do pulmão e da pele demonstraram que a acrilamida pode actuar tanto de forma independente como um iniciador de tumor ou dependia de um agente de promoção para a sua actividade carcinogénica, dependendo da escolha do modelo animal e a via de administração [2,3]. Em um estudo de tempo de vida de roedor, de acrilamida (em água de beber), aumentou a frequência de tumores na glândula da mama em mulheres e em homens glândula testicular [5]. Num estudo realizado em hamsters sírios, toxicidade induzida por acrilamida (administrados através da água potável) causou perturbações nervosas periféricas, hematotoxicidade e toxicidade testicular [16]. O bioensaio de 2 anos câncer [4] e do estudo de carcinogenicidade tempo de vida [5] forneceram dados seminais descrevendo a carcinogenicidade da acrilamida, e cólon não foi identificado como um órgão-alvo para a ação de acrilamida. A avaliação recentemente publicado em profundidade toxicológica de acrilamida pelo Programa Nacional de Toxicologia do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos confirmaram esses achados [17]. No seu relatório, o estômago de ratinhos B6C3F1 do sexo masculino e do sexo feminino foi identificado como um alvo adicional de acrilamida nos estudos de 2 anos de carcinogenicidade (acrilamida administrada na água de beber a 0,0875, 0,175, 0,35 ou /kg de peso corporal 0,70 mm), com evidência clara de uma incidência relacionada com a dose de papiloma de células escamosas pança ou carcinoma [17]. Resultados de dois estudos epidemiológicos sugeriram que não existe nenhuma associação entre acrilamida na dieta eo risco de câncer de cólon em mulheres [18] ou homens [19]. Contrariamente a estas evidências experimentais epidemiológicos e outros, Zhang (2009) relatou em um estudo realizado com ratos Sprague-Dawley, dirigindo-se a indução de focos de cólon criptas aberrantes (ACF, lesões pré-cancerígenas do cólon putativo) e formação de tumor por injecção i.p. exposição a acrilamida a uma dose de 10 mg /kg de peso corporal, administrada 5 dias por semana durante um período de 8 semanas [20]. Foi relatado que o número de ACF cólon induzida por acrilamida e os tumores foram significativamente maiores nos ratos em dieta suplementada com óleo de milho 10% em comparação com aqueles na dieta basal [20]. Em outro estudo, os ratos alimentados com rações suplementadas com óleo de oliva 10% e óleo de peixe 10% mostraram diminuição da formação ACF induzida por acrilamida, em comparação com aqueles em dietas basais [21]. Estes dois estudos implicam acrilamida como um carcinogéneo cólon independente, especialmente na ausência de qualquer agente cancerígeno conhecido utilizado no seu protocolo [20,21]. Para abordar se acrilamida dietético em doses conhecidas por causar vários tumores em roedores iria aumentar o risco de cancro do cólon, que anteriormente realizado um bioensaio de curto prazo (desenho de estudo de 8 semanas), utilizando o azoximetano (AOM) induzida por ACF roedor cólon como um biomarcador substituto [22]. Nós relatado que a acrilamida na dieta (5 a 50 mg /kg de dieta) não aumentar a formação de ACF por comparação com o controlo (sem acrilamida na dieta) quer em regimes de baixa ou alto teor de gordura da dieta; No entanto, observou-se uma tendência para aumentar a ACF com a dose testada mais baixa (5 mg por kg de dieta acrilamida) [22]. Os modos de acção exacto de acrilamida no processo cancerígeno de múltiplos passos, como iniciador tumoral, promotor ou co-carcinogénio, permanecem pouco claros a partir destes estudos. Além disso, o âmbito do efeito da exposição a baixa crónica e acrilamida por via oral, especialmente em níveis reflectindo os encontrados em alimentos para seres humanos, não é clara. As doses de acrilamida usados ​​na maioria dos estudos com animais são significativamente mais elevados do que aqueles a que são expostos os seres humanos através da dieta. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi avaliar se a acrilamida na dieta, em doses que refletem os níveis de exposição humanos mais elevados, faz com que qualquer carcinogenicidade no cólon, usando dois modelos animais estabelecidos. acrilamida na dieta não iniciou de forma independente a formação de tumor de cólon em ratos F344; No entanto, quando administrado juntamente com AOM, uma cólon cancerígena específica, acrilamida (2 mg /kg de dieta) aumentou o tamanho dos tumores do cólon, sugerindo um efeito de co-cancerígenos no cólon. Além disso, a acrilamida na dieta não exacerbar o crescimento de xenoenxertos de tumor do cólon humano in nude (

nu /nu

) camundongos.

Métodos

declaração Ética

o protocolo experimental animal desse estudo foi aprovado pelo Comitê de Saúde do Canadá Ottawa animal Care (ACC No. 2010-015), e os animais foram tratados de acordo com as orientações do Conselho canadense para o cuidado de animais.

animais , criação e dietas

ratos F344 masculinos e (

nu /nu

) ratos nus, desmamados para uma dieta semi-sintético [23], foram adquiridos de Charles River Laboratories (Quebec, Canadá ). Na chegada às nossas instalações de alojamento dos animais, os animais foram aclimatados por 1 semana em condições de laboratório. A temperatura e humidade relativa eram controladas a 22 ° C e 55%, respectivamente, com um de 12 h de luz /12 horas de ciclo escuro. Animais tiveram livre acesso às dietas experimentais e água potável

ad libitum

. As dietas foram obtidos a partir de dietas Research, Inc. (New Brunswick, New Jersey, EUA) sob a forma de pó e foram baseadas nas AIN-93G fórmula semi-sintética modificada para conter 7% de óleo de milho [23]. Acrilamida (≥ 99% pura; Sigma Chemical Co., Missouri, EUA) em doses de 0,5 mg, 1,0 mg e 2,0 mg por kg de dieta foi misturada com as dietas usando um misturador Hobart e, em seguida, feita em pastilhas utilizando uma prensa de peletização (temperatura nunca excedeu 35 ° C) em nossas instalações de preparação dieta. A dieta sem qualquer adição de acrilamida (0 mg), representado com a dieta basal. As dietas foram armazenadas no escuro a 4 ° C até à sua utilização. As dietas foram reabastecido e consumo alimentar foi medido semanalmente. Os ratos foram monitorizados todos os dias e os seus pesos corporais foram registados duas vezes por semana. Os animais foram sacrificados por sangria sob anestesia com isoflurano antes da recolha tumores e órgãos. O delineamento experimental específico para os dois estudos utilizando ratos F344 e camundongos nus são mostrados na Figura 1.

Os números em caixas representam o tempo (em semanas) depois que os animais chegaram na nossa unidade habitacional. Em ambos os estudos, um período de aclimatação de uma semana foi mantida antes de intervenções específicas. As dietas basearam-se em AIN-93G formulação semi-sintéticos e os quatro dietas experimentais diferiam uns dos outros no nível de acrilamida adicionada: 0 (controlo), 0,5, 1,0 e 2,0 mg /kg de dieta. Todos os animais permaneceram nas respectivas dietas experimentais até necropsia.

Cálculos

desenho experimental e tumorais

estudo F344 rato.

ratos F344 masculinos (7 semanas de idade) foram randomizados para um dos quatro dietas experimentais. Após 2 semanas, os ratos em cada grupo de dieta foram sub-divididos para receber s.c. quer injecções de AOM (Sigma Chemical Co., Missouri, EUA; 15 mg /kg de peso corporal, n = 24 ratos /grupo de dieta) ou solução salina (0,2 ml /rato; N = 8 ratos /grupo de dieta), uma vez por semana durante 2 semanas (ver Figura 1). Todos os ratos estavam nas dietas experimentais durante 20 semanas após injeções AOM /salinas, após o que foram mortos. Dois pontos foram dissecados, lavada com PBS gelado, e fenda aberta ao longo do comprimento do ânus para o ceco em uma placa fria. lesões macroscópicas e tumores foram avaliados para o tamanho e localização ao longo do cólon, foram dissecados e congelados instantaneamente em RNA

depois

™ agente de estabilização (Life Technologies, Grand Island, Nova Iorque, EUA) em líquido N

2 por análise molecular ou armazenados em formalina a 10% tamponada para a patologia. Segmentos (1 cm) das secções distais e proximais dos cólons foram dissecados e fixados plana entre papéis de filtro em formalina a 10% tamponada para a patologia; o resto dos cólons (distal e proximal separadamente) foram raspadas com lâminas de vidro para recolher a camada mucosa e congeladas em N líquido

2 para análise futura. tumor do cólon parâmetros derivados a partir dos dados de tamanho de tumor e a localização registadas no momento da necropsia incluem: (a) a incidência de tumores (percentagem do total de animais com tumores); (B) a multiplicidade de tumores (número médio de tumores por rato portador de tumor); (C) média tamanho do tumor (mm

2) por grupo; e carga tumoral (d) (média de área de tumor total por rato portador de tumor), como descrito por 24.

estudo do rato

Nude (nu /nu).

Homem atímicos nu (

nu /nu

) murganhos (6 semanas de idade) foram alojados em instalações de isolamento Nível-II e mantido sob condições estéreis. Uma semana após aclimatização, os ratos foram injectados por via subcutânea na pata direita com HT-29, células de adenocarcinoma do cólon humano (2 × 10

6 células) suspensas em 100 ul isento de soro de McCoy meios 5A (Hyclone Laboratories Inc., South Logan, Utah, EUA). Após 3 semanas, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente a um dos 4 dietas experimentais (n = 12 ratinhos /grupo de dieta) (ver Figura 1). Camundongos foram apalpadas duas vezes por semana e tumorais xenotransplantes medições foram registrados de forma independente por dois técnicos. Quatro semanas mais tarde, os ratos foram mortos; os xenoenxertos de tumor foram pesadas e armazenadas em 10% de formalina tamponada para patologia, juntamente com un-envolvido tecido circundante ou congelados instantaneamente em N líquido

2 para análise molecular. As medições do tumor foram registrados por 5 períodos de tempo, a partir da semana as dietas de acrilamida foram introduzidas até necropsia. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula 0,5236 × G

1 (L

2)

2, em que L

1 e L

2 estão os diâmetros de cada tumor no mais longo e os pontos mais curtos , respectivamente. O crescimento do tumor foi calculado como a mudança no volume do tumor por semana (representada como uma percentagem) começando na introdução das dietas experimentais (3 semanas após a injecção com as células) para um total de 4 semanas.

tumor patologia

formalina tumores do cólon fixo (em conjunto com a mucosa aparentemente normal adjacente) a partir de ratos F344 injectados com AOM e os xenoenxertos de tumores de ratinhos nus foram embebidos em parafina, seccionadas a 5 um e coradas com hematoxilina e eosina (H E) para a classificação patológica. tumores do cólon dos ratos F344 foram classificados de acordo com Whiteley et al. (1996) [25], e os xenoenxertos de tumor do cólon de ratinhos nus foram classificados de acordo com o esquema da OMS para os tumores do cólon e do recto [26]. No estudo do ratinho nu, para além dos tumores de xenoenxerto de cada rato, outros órgãos (cérebro, fígado, pulmão, e do nó de linfa inguinal) foram recolhidas e examinadas microscopicamente para metástases.

quantificação da proliferação e imuno-histoquímica apoptose

secções não coradas (5 mm de espessura) dos xenoenxertos do cólon dos ratinhos nus foram utilizados para todas as detecções de imuno-histoquímica. Para a proliferação, as secções foram primeiro submetida a recuperação de antigénios por meio de aquecimento em /L de tampão citrato de sódio 10 mmol em um micro-ondas durante 2,5 minutos. O antigénio nuclear de célula monoclonal de ratinho anti-proliferação (PCNA), a uma diluição de 1 (Cat # M0879 DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA.): 10.000 foi usado como o anticorpo primário. O EnVision + ™ Sistema (Cat. # K4007, DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA), utilizando um anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano e detecção subsequente com diaminobenzidina, foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Para a apoptose, a ApopTag® Além disso peroxidase In Situ A apoptose Kit (Cat # S7101;. Chemicon Inc., Canadá) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Este método baseado em ensaio desoxinucleotidilo transferase dUTP nick rotulagem extremidade terminal (TUNEL) detecta apoptose precoce através de fragmentação do DNA, rotulando enzimaticamente a livre 3′-OH terminais com nucleotídeos modificados. Resumidamente, as secções foram submetidas a uma enzima de digestão de proteínas para matar a peroxidase endógena, seguindo-se aplicação de um tampão de equilíbrio e a incubação com a enzima de TdT, antes de parar a reacção por adição de tampão de conjugado anti-digoxigenina. Isto foi seguido por incubação das secções de substrato de peroxidase e contracoloração utilizando verde de metilo.

Para a determinação do índice de marcação das células mitóticas (positivos a PCNA) e células apoptóticas (TUNEL positivo), dez campos bem orientadas foram avaliados por seção cólon xenotransplante. O índice de marcação PCNA /apoptose foi calculado usando o software do Norte Eclipse Versão 7.0 (Empix Imaging, Inc., Mississauga, ON, Canadá). A proporção de mitótico /células em apoptose por seção foi calculado.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​por ANOVA de uma via utilizando SigmaStat® software 3.1 (Systat Software Inc., Point Richmond, Califórnia, EUA). Em todos os testes estatísticos,

p Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

estudo em ratos F344

Observações gerais.

O peso corporal (média ± SEM) de ratos no início da experiência (no momento da primeira injecção) foi 228,8 ± 5,5 g e 225,7 ± 3,6 g para os grupos salinos e AOM, respectivamente. Não houve diferenças significativas no ganho de peso corporal entre o controle (0 mg de acrilamida) e ratos tratados com acrilamida foram encontrados em ambos os grupos de OMA (Figura 2) solução salina ou. peso corporal final dos ratos não diferiu significativamente entre os diferentes grupos de dieta em saline- ou ratos AOM-injetados (Tabela 1). Não foram observadas diferenças em pesos de fígado e baço (calculada como g por kg de peso corporal) entre os grupos tratados com acrilamida e os seus respectivos controlos em ambos os grupos tratados com saline- ou AOM (Tabela 1). O consumo alimentar foi calculado como valores médios (g por kg de peso corporal por dia), e não foi diferente entre ratos tratados com acrilamida em ambos os grupos (Tabela 1 AOM) ou solução salina de controlo e. Com base no consumo de alimentos registado para cada grupo de dieta individual nos ratos tratados com solução salina, a ingestão de acrilamida para concentrações de 0,5, 1 e 2 mg de acrilamida por kg de dieta utilizadas no nosso estudo foram calculados como 0,017, 0,035 e 0,070 mg de acrilamida per kg de peso corporal por dia, respectivamente. Uma tendência similar foi observada nos ratos tratados com AOM, com a ingestão calculada de 0,018, 0,036 e 0,072 mg de acrilamida por kg de peso corporal por dia para as concentrações de 0,5, 1 e 2 mg por kg de dieta acrilamida, respectivamente.

de peso corporal (média ± SE, g) por semana de ratos injectados com F344 (a) solução salina ou (b) tratado com AOM e acrilamida a 0 (controlo), 0,5, 1,0 e 2,0 mg /kg de dieta.

Controle

acrilamida

0,5 mg /kg

1,0 mg /kg

2,0 mg /kg

ratos (com injecção de Saline

n

= 8 /grupo) corpo Weight459.5 ± 7.9483.9 ± 7.4469.5 ± 9.8465.6 ± 5,9 (g) Liver3.14 ± 0.043.19 ± 0.053.13 ± 0.033.08 ± 0,06 (g /100g BW) Spleen0.173 ± 0.0020.182 0.0040.180 ± ± 0.0030.181 ± 0,002 (g /100 g BW) intake35.4 Food ± 0.234.8 0.134.7 ± ± 0.235.2 ± 0,1 (g /kg de peso corporal /dia ) ratos injetados com OMA (

n

= 24 /grupo) corpo Weight424.4 ± 5.7440.3 ± 7.5436.0 ± 5.9436.2 ± 5,9 (g) Liver2.79 ± 0.032.80 ± 0.062.77 ± 0.052.75 ± 0,04 (g /100 g BW) Spleen0.216 ± 0.0230.215 0.0230.187 ± ± 0.0030.189 ± 0,003 (g /100 g BW) intake36.3 Food ± 0.535.8 0.435.9 ± ± 0,435. 5 ± 0,4 (g /kg pc /dia) Tabela 1. corpo e os órgãos pesos de ratos saline- e AOM-injetados alimentados com dietas com ou sem acrilamida durante 24 semanas.

a, b

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Independentemente do tratamento dietético, nenhum dos ratos apresentaram sinais de toxicidade, desconforto ou anomalias comportamentais até 18 semanas pós-injecção OMA /solução salina. No entanto, as injecções aos 19 semanas pós-OMA /solução salina, mais de 30% dos ratos injectados com AOM tinha sangue nas fezes, enquanto que nenhum dos ratos injectados com solução salina tinham tais sinais. Ao comparar este efeito (percentagem de ratos com sangue nas fezes /grupo) em grupos de dieta, a única observação notável foi que mais ratos injectados com AOM na dose mais elevada de acrilamida (2 mg /kg de dieta) tinha sangue nas fezes ( 41,7%) em comparação com o controlo (29,2%) e os outros dois grupos com doses de 0,5 e 1 mg /kg (25,0% e 29,2%, respectivamente). O estudo foi, portanto, encerrado em 20 semanas, 6 semanas antes do tempo originalmente proposto.

Dados do tumor.

No final da injeção de pós-OMA /soro fisiológico, nenhum dos salina 20 semanas ratos -injected em ambos os dietas de controle ou de acrilamida tinham desenvolvido tumores de cólon (Tabela 2). A incidência de tumor do cólon de 54,17% foi observada nos ratos injectados com AOM sobre a dieta de controlo. Não foram observadas diferenças significativas na incidência de tumores entre o controlo e os grupos tratados com acrilamida (

p

= 0,695). Tumor multiplicidade foi semelhante entre os diferentes grupos alimentares. No entanto, o tamanho médio de tumores por rato e o peso do tumor (a área total do tumor por rato portador de tumor) foi significativamente maior (

P

0,05) no grupo da dose mais elevada de acrilamida de 2 mg /kg de dieta em comparação com o controlo. Não houve diferença no tamanho do tumor e carga foi observado nos outros dois grupos de acrilamida de 0,5 mg /kg de dieta (

P

= 0,933,

P

= 0,959, respectivamente) e de 1 mg /kg de dieta (

p

= 0,978,

p

= 0,741, respectivamente).

Controle

acrilamida

0,5 mg /kg

1,0 mg /kg

2,0 mg /kg

ratos injectados com soro fisiológico

total de ratos

8

8

8

8

ratos portadores de tumor

0

0

0

0

incidência de tumores

b

0

0

0

0

AOM-injetada ratsTotal rats24242424Tumor-bearing rats13141216Tumor incidência

b54.1758.3350.0066.67Total Tumors22191625Tumor multiplicidade

c1.69 ± 0.321.36 ± 0.181.33 ± 0.141.56 ± 0.24Tumor tamanho

c ( mm

2) 10,68 ± 1.856.91 ± 1.1613.68 ± 4.0425.18 ± 8,34 * carga tumoral

c, d (mm

2) 19,27 ± 3.928.75 ± 2.7417.93 ± 3.1135.52 ± 9,96 dietas * Tabela 2. parâmetros de tumor do cólon de ratos saline- e AOM-injetados alimentados com ou sem acrilamida durante 24 semanas.

a

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no âmbito classificação sugerida por Whiteley et al. (1996) [25], os tumores do cólon em ratos injectados com AOM caiu nas seguintes categorias: (a) o adenoma tubular (TA), no qual pelo menos 75% da massa consiste em túbulos bem diferenciados; (B) adenocarcinoma (AC) -2 invadindo a submucosa; (C) AC-3 representando tipo mucinoso lesão invadindo a submucosa; (D) AC-4 representando lesão mucinoso invadindo a túnica muscular; e (e) CA-5 representando lesão mucinoso invadindo a serosa (Figura 3). No controlo (OMA sozinho, sem acrilamida) grupo, 80% das lesões eram adenomas (tipo TA) e 20% eram adenocarcinomas (tipo AC-2). Uma tendência similar foi observada no grupo de acrilamida mais baixa (0,5 mg /kg de dieta), excepto que os adenocarcinomas eram do tipo mucinoso (AC-3) (Figura 3). Apenas 55% e 44% adenomas foram encontrados no meio (1 mg /kg de dieta) e elevadas (2 mg /kg de dieta) grupos acrilamida, respectivamente, a parte restante cai sob adenocarcinomas mucinosos com características mais avançadas (Ac-4 e Ac- 5) (Figura 3).

Um dos cinco tipos de tumor foram observadas nos dois pontos. adenoma tubular (TA) é mostrado no painel (a), com túbulos displásicas que formam o adenoma polipóide (seta preta) e as glândulas não neoplásicas no talo do tumor (seta vermelha). Adenocarcinoma com invasão de submucosa (AC-2) é mostrado no painel (b), com estruturas glandulares neoplásicas (seta preta) na submucosa com uma mucosa clara muscular (donut preto) e da resposta inflamatória scirrhous de tumor (seta vermelha). adenocarcinoma mucinoso com invasão de submucosa (AC-3) é mostrado no painel (C), caracterizado por as células tumorais formam estruturas glandulares (seta vermelha) em submucosa com uma mucosa muscularis claro (donut preto) e as células em anel de sinete distendidos por mucina ( flecha Negra). adenocarcinoma invadindo túnica muscular mucinoso (AC-4) é mostrado no painel (d), caracterizada por células tumorais invasoras túnica muscular (seta preta) e que substitui a mucosa normal (donut preto) e uma serosa intacta (seta vermelha). Mucinoso invadindo serosa adenocarcinoma (AC-5) é apresentado no painel (E), com células tumorais em estruturas vasculares em túnica muscularis (seta preta), muco e detritos na glândula tumor dilatada (donut preto), e uma serosa (seta vermelha) . Tipo de tumor como uma percentagem, em cada grupo de dieta é representado no painel (F).

Além de tumores do cólon, observou-se os tumores do intestino delgado (duodeno, jejuno ou íleo) na AOM- ratos injetados com uma incidência de 12,5% no grupo controle, e de 20,8%, 25,0% e 8,3% no de 0,5 mg /kg, 1,0 mg /kg e 2,0 mg /kg de acrilamida /grupos de dieta, respectivamente.

estudo nu (nu /nu) do mouse

observações gerais.

Não há diferenças no ganho de peso corporal entre o controle (0 mg /kg de acrilamida /dieta) e os três grupos de acrilamida foram encontrados (Figura 4). Os ratos pareceram saudáveis, sem sinais visíveis de toxicidade, desconforto ou anomalias comportamentais, tanto durante a fase de formação de tumor (primeiras 3 semanas após a injecção das células cancerosas) e a fase de alimentação de acrilamida. O consumo de alimentos não foi diferente entre o controle e os ratos tratados com acrilamida, e independentemente de tratamentos dietéticos foi registrado como 12,30 ± 0,52 g /kg de peso corporal /dia. A ingestão de acrilamida para doses de 0,5, 1 e 2 mg por kg de dieta acrilamida usados ​​no estudo ratos foram calculados como 0,006, 0,012 e 0,025 mg de acrilamida por kg de peso corporal por dia, respectivamente.

Os pesos corporais ( significa ± SE, g) de nu (

nu /nu

) camundongos injetados com HT-29 células humanas do cancro do cólon tratados com acrilamida a 0 (controle), 0,5, 1,0 e 2,0 mg /kg de ração.

dados Tumor de xenotransplante.

Três semanas após HT-29 células de adenocarcinoma de cólon humano foram injetados na região haste direito de ratos nus, massas subcutâneas apareceu nos locais de injecção em todos, mas 4 ratos . As massas foram discreto, firme, palpável, e sentiu-se localizada na região subcutânea. A quatro ratinhos que não tinham xenoenxertos de tumores palpáveis ​​foram excluídos do estudo. O resto dos ratinhos receberam o controlo ou uma das três dietas experimentais (0,5, 1,0 e 2,0 mg de acrilamida /kg de dieta) para um total de 4 semanas.

Na terminação, todos os xenoenxertos de tumores pareciam ter pele intacta, exceto por dois ratos (um de cada nos grupos de dieta 0,5 e 1,0 mg de acrilamida /kg) que tinham ulcerações focais nos xenoenxertos tumorais. Um rato do /grupo de dieta kg 1,0 mg de acrilamida tinha um gânglio linfático aumentado (inguinal), sem metástase quando observado histologicamente. Não houve diferença no crescimento do tumor entre o controlo e os grupos tratados com a acrilamida em qualquer um dos 4 pontos de tempo (com início uma semana após o início da dieta acrilamida), incluindo na necropsia (Figura 5). O peso úmido dos tumores no momento da necropsia foi semelhante entre os grupos de dieta, sem qualquer alteração relacionada com a acrilamida (Figura 5).

Efeito da acrilamida na dieta a 0 (controle), 0,5, 1,0 e 2,0 mg /kg de ração em crescimento (média ± EP,%) mostrado no painel (a), e os pesos molhados (média ± EP, g) mostrados no painel (b), HT-29 xenoenxertos de tumor do cólon humano in nude (

nu /nu

) ratinhos. O crescimento do tumor foi calculada com base no volume de cada tumor gravados em diferentes pontos de tempo a partir do início da dieta acrilamida até à necropsia, pesos húmidos e foram registados no momento da necropsia

H . secções E de todos fixos xenoenxertos de tumor foram avaliadas. A morfologia dos tumores era muito semelhante entre os 4 grupos de dieta. Consistentemente, todos os tumores foram claramente delineados, não encapsulados, massas densamente celulares de células tumorais que foram divididos em lóbulos de tamanho variável por um estroma fibrovascular fino (Figura 6). Grandes áreas de necrose no interior das massas foram uma constante, com a periferia dos tumores infiltrada por uma população mista de leucócitos. Sob o microscópio, a baixa objectivo, os tumores apareceram sólido e sem diferenciação glandular; a alta objetiva, ocasional para pequenas lumens freqüentes ocorreram entre as células cancerosas. As células tinham um elevado rácio de núcleo /citoplasmática, marcado anisocariose (variação de diâmetro de núcleo), e densamente corados com cromatina grandes nucléolos únicas ou múltiplas. células mitóticas, incluindo os atípicos, eram frequentes. células multinucleadas foram uma característica comum. Cinza muco estava presente no citoplasma tanto como pequenas inclusões ou era tão volumosa quanto a causar compressão nuclear (células em anel de sinete).

xenoenxertos de tumor do cólon humano de nu (Fixed 29 HT-

nu /nu

) ratos foram seccionados a 5 ^ m. O painel (a) mostra um representante H E a secção dos xenoenxertos de tumor como um carcinoma indiferenciado típico com folhas viáveis ​​sólidas de células tumorais (área marcada pela linha a tracejado preto) e margem subcutâneo claramente delimitada (seta vermelha); características-chave incluem cinza citoplasma da célula tumoral de distensão (seta preta) e a área de necrose (donut preto). Representante coloração imuno-histoquímica de PCNA é mostrada no painel (b) com as células em proliferação células coradas visto como castanhos escuros. TUNEL é mostrado no painel (c), com células em apoptose observadas como manchas escuras (seta vermelha). O gráfico de barras no painel (d) mostra a razão entre os índices (média ± SE) de proliferação de células (positivos a PCNA) e apoptose (TUNEL positivo) para cada dieta: acrilamida a 0 (controlo), 0,5, 1,0 e 2,0 mg /kg de dieta.

a imuno-histoquímica para determinar as análises mitótico (PCNA-rotulados) e contagem de células apoptóticas foram realizados em secções coradas dos xenoenxertos de tumor (Figura 6). Uma proporção dos índices de rotulagem de mitótico e células apoptóticas foram calculados para cada xenoenxertos de tumor; não houve mudanças nesta relação entre os grupos tratados com acrilamida controle e (Figura 6).

Discussão

A acrilamida é conhecido por causar tumores em vários órgãos em bioensaios de roedores [1,2,4 ]. No entanto, nestes estudos, o cólon não foi identificado como um órgão-alvo para o efeito cancerígeno da acrilamida. Dois estudos epidemiológicos humanos não observou qualquer relação entre a ingestão de acrilamida e o risco de desenvolver câncer de cólon [18,19], com uma reiteração deste ponto por um estudo de meta-análise recente [27]. Contrariamente a estes resultados e aqueles dos experimentos de carcinogenicidade, um estudo realizado em ratos Sprague-Dawley informou que i.p. exposição a acrilamida (peso de 10 mg /kg de corpo 5 dias por semana durante 8 semanas) induzida por ACF cólon e a formação de tumor [20]. Além disso, em comparação com ratos em uma dieta basal, aqueles que foram alimentados com dietas suplementadas com óleo de milho 10% e 10% de sebo bovino tinha mais, e aqueles alimentados com dietas suplementadas com óleo de oliva 10% e óleo de peixe 10% tinham menos acrilamida induzida cólon ACF [21], usando uma dose de acrilamida semelhante ao descrito anteriormente [20]. Os estudos de Zhang (2009) e Xichun (2009) sugerem que a acrilamida pode ser envolvido numa acção cancerígena directa no cólon e que as lesões do cólon induzida por acrilamida são passíveis de regulação do crescimento de lípidos dietéticos [20,21].