Abstract

Small Cell Lung Cancer (SCLC) é um subtipo específico de cancro do pulmão apresentando como doença altamente metastático com extremamente pobre prognóstico. Apesar de responder inicialmente bem à quimioterapia ou radioterapia, SCLC quase invariavelmente reincide e desenvolve resistência à quimioterapia. Esta é suspeita de estar relacionada com as subpopulações de células tumorais com características diferentes que se assemelham a células estaminais. Epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é conhecida por desempenhar um papel fundamental em processos metastáticos e no desenvolvimento de resistência à droga. Isto também é verdadeiro para NSCLC, mas existe muito pouca informação sobre os processos EMT em CPPC medida. CPPC, em contraste com as linhas celulares de NSCLC, cresce principalmente em agregados de células e uma parte menor de células aderentes flutuante. Nós comparamos estes morfologicamente diferentes subpopulações de linhas de células SCLC para EMT e características epigenéticas, detectar diferenças significativas nas subpopulações aderentes com níveis elevados de marcadores mesenquimais, como vimentina e fibronectina e níveis muito baixos de marcadores epiteliais como a E-caderina e Zona occludens 1. Além disso, a expressão de factores de transcrição relacionados com o EMT, como caracol /Snai1, Slug /Snai2, e Zeb1, padrões de metilação do DNA dos genes da indicação EMT, respostas funcionais como migração, invasão, secreção de metaloproteases de matriz, e a resistência ao tratamento com droga quimioterapêutica todos diferiu significativamente entre as sublinhas. Esta variabilidade fenotípica pode refletir a heterogeneidade de células tumorais e EMT durante a metástase

in vivo

, acompanhado pelo desenvolvimento da doença refratária em recaída. Propomos que a regulação epigenética desempenha um papel fundamental durante as mudanças fenotípicas e funcionais em células tumorais e pode, portanto, oferecer novas opções de tratamento para doentes com CPPC

Citation:. Krohn A, Ahrens T, Yalcin A, Plönes T, Wehrle J , Taromi S, et al. Heterogeneidade Cell (2014) Tumor no Small Cell Lung Cancer (SCLC): Diferenças fenotípicas e funcionais associadas com epitelial-mesenquimal Transição (EMT) e DNA metilação Alterações. PLoS ONE 9 (6): e100249. doi: 10.1371 /journal.pone.0100249

editor: Bernard W. Futscher, da Universidade do Arizona, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de fevereiro de 2014; Aceito: 22 de maio de 2014; Publicação: 24 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Krohn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), C3 projeto, CRC 850 (a MB), eo Deutsche Krebshilfe (110.213 para BH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma neoplasia pulmonar altamente maligno e agressivo representando cerca de 10-15% de todos os cânceres de pulmão relatados. Cerca de 30000 casos por ano são diagnosticadas nos Estados Unidos [1], [2]. Como um sub-grupo de pulmão-cancro separada, distinta de não pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC, incluindo carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma), SCLC é caracterizada por metástases muito cedo e de prognóstico reservado. A maioria dos pacientes apresentam metástases, e dois terços já tem metástases à distância no momento do diagnóstico [3]. Apesar de responder inicialmente bem à radioterapia e quimioterapia, a grande maioria recaídas com uma taxa de 1 ano de sobrevivência para SCLC de apenas 40% e sobrevida de 5 anos menos de 5 [4]%. Enquanto que o tratamento progrediu NSCLC, nos últimos anos, o tratamento SCLC permanece insatisfatória [5]. Temos assistido há avanços significativos em seu tratamento ao longo dos últimos 30 anos desde que o regime padrão de etoposídeo em combinação com cisplatina ou carboplatina foi estabelecido durante os meados da década de 1980 [6]; ressecção cirúrgica é a exceção e só pode beneficiar uma minoria de pacientes cuidadosos selecionados [7]. Existe, obviamente, uma necessidade urgente para novas abordagens para compreender e tratar este subtipo específico do cancro do pulmão.

SCLC supõe uma grande variedade de aparências morfológicas histopatologicamente, com células tumorais geralmente menores do que o tamanho de 3 linfócitos em repouso. No entanto, existem amostras contendo células alcance tão grande quanto 7 linfócitos, demonstrando a sua variabilidade morfológica [8] no interior do tecido do tumor. características citológicas típicas são finamente granulada cromatina, a falta de nucléolos proeminentes e fronteiras celulares, e a expressão de marcadores neuroendócrinos [8]. Desde 2004, a classificação da OMS de SCLC descreve dois subtipos: SCLC pura com grandes células inferior a 10%, e combinado SCLC com componentes não-pequenas células mais de 10% [9]. Os tumores com uma elevada quantidade de componentes de células não-pequenas são descritos como sendo mais resistente à terapia de CPPC puro [10]. Ele também tem sido postulado que os tumores SCLC adquirir quimioterapia e radiorresistência durante o tratamento, evoluindo para SCLC combinado [11].

Para metástase, as células precisam mudar seu fenótipo. As células individuais ou pequenos grupos de células adquirem a capacidade de migrar e invadem através da membrana basal do tecido circundante. Durante este processo, as células tumorais dissolver ligações célula-célula, perdendo a sua polaridade basal-apical, acompanhado por alterações morfológicas que revelam uma forma de fuso, depois do qual microvilosidades, filopodia e microtentacles tornaram pronunciadas em vez disso. Além disso, as proteases tais como metaloproteinases de matriz (MMPs) tornam-se regulada positivamente, facilitando a degradação da matriz extracelular. Estes processos são também conhecidos como a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e têm sido descritas em uma variedade de tipos de cancro [12] – [15]. No entanto, não há quase nenhuma informação sobre os processos de EMT em SCLC até agora [16]. Há evidências de que EMT é crítica para ambos metástases e, em conjugação com quimioterapia e radiorresistência [17]. EMT é um processo de vários estágios envolvendo plasticidade celular pronunciada e numerosas alterações genéticas e epigenéticas distintas [18]. Os fatores de transcrição, tais como Caracol /Snai1, Slug /Snai2, Zeb1, FSP e outras causam o para cima e regulação negativa de vários genes. E-caderina tem sido descrito como um factor central na transição entre o epitélio e o fenótipo mesenquimal. Zeb1 e caracol /Snai1 se ligam ao promotor de E-caderina e reprimir a transcrição de moléculas de adesão celular [19]. Considerando que a caderina-E e Zona occludens 1 são normalmente regulados negativamente durante EMT, genes de mesenquimais, tais como vimentina, fibronectina, e as MMPs são regulados positivamente. As mudanças epigenéticas, como metilação do DNA, modificações de histonas e microRNAs são conhecidos por estar envolvidos na regulação de genes relacionados com a EMT [15] e, portanto, também pode ser responsável por alterações no fenótipo celular, a fim de permitir a divulgação e adaptação às novas micro-ambientes.

neste estudo foram analisados ​​diferentes subpopulações de células em linhas de células SCLC, especialmente em células NCI-H69, as diferenças de genes-chave de EMT e características funcionais. Nós comparamos os agregados de células flutuante (NCI-H69) com aderente de crescimento subpopulações variantes (NCI-H69V). NCI-H69V foi seleccionada a partir da linha celular parental NCI-H69 e é uma variante devido aos baixos níveis de marcadores neuroendócrinos [20]. Comparando as sublinhas de NCI-H69 revela claramente um padrão de expressão diferente de marcadores de EMT e a metilação do DNA, o qual é por sua vez associada a consequências funcionais, tais como a capacidade de invasão, migração, a secreção de MMP e de activação, proliferação celular, e quimioresistência. Em resumo, este estudo postula que existe uma proporção de células mesenquimais dentro de linhas de células de SCLC, que pode reflectir o

in vivo

situação na SCLC com tumores que contenham as subpopulações de células tumorais heterogéneas com mais ou menos células epiteliais e /ou mesenquimais características que podem estar associados com as respostas funcionais durante os processos de metástase.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

linhas de células SCLC humano NCI-H69, NCI-H82 e NCI-N592 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, EUA). NCI-H69 e NCI-N592 foram verificadas por autenticação LGC Standards celular Line. NCI-H69V foram gentilmente cedidas pela BIOSs Toolbox (Freiburg, Alemanha). Além disso, as células NCI-H69 e NCI-H69V foram comparados através de array de SNP (dados não mostrados), que provou mesma origem celular. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco-BRL, Grand Island, Nova Iorque, EUA) numa atmosfera humidificada atmosfera (5% de CO2) a 37 ° C. A fim de selecionar para subpopulações aderentes, as células aderentes dentro NCI-H69, NCI-H82 e NCI-N592 foram mantidas em cultura, enquanto que as células flutuantes foram eliminados ao longo de várias passagens.

As taxas de crescimento e tempo de duplicação da população

As taxas de crescimento do NCI-H69 e NCI-H69V foram determinados 3 * 10

6 células (em triplicado) em frascos de cultura de tecidos. As células foram contadas no dia 2, 4 e 6 usando um hemocitómetro. Para calcular o tempo de duplicação da população (PDT), a fórmula PDT = h * ln (2) /ln (C2 /C1) foi utilizada de acordo com as directrizes da ATCC. Coloração

Imunofluorescência de vimentina, E-caderina, Zona occludens e Ki-67

As células foram fixadas em 2% de PFA, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C durante 10 min e bloqueadas com PBS contendo 5,0% (v /v) de soro normal de cabra e 0,3% (v /v) de Triton X-100. imunofluorescência foi realizada com mAb Ki-67 (Dako, Hamburgo, Alemanha), vimentina XP coelho mAb, mAb e coelho de E-caderina Zona occludens mAb (Cell Signaling Technologies, MA, EUA), e anticorpos secundários adequados (cabra-anti -mouse IgG-Alexa488 e de cabra anti-IgG de coelho-Alexa467, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). As lâminas foram então montadas com ouro Prolong Antifade Reagente com DAPI (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

A transcrição reversa PCR análise

O ARN total foi isolado utilizando o Kit RNeasy Mini ( Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, seguindo-se a digestão de ADN com ADNase I (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Reino Unido). Para a síntese de ADNc 1 ug de RNA total foi transcrito usando o kit iScript (

Bio-Rad

, Hercules, CA, EUA). O ADNc foi amplificado utilizando

Taq

polimerase (Qiagen, Hilden, Alemanha) utilizando seguinte programa de PCR para todos os iniciadores: 94 ° C durante 5 minutos, seguido por 28 ciclos de 94 ° C 30 seg, 55 ° C 30 seg e 72 ° C durante 30 seg e o último ciclo de amplificação a 72 ° C durante 5 min. Os produtos de PCR foram analisados ​​num gel de agarose a 1,0%, visualizado e fotografado sob luz UV. Para quantificação, as bandas de PCR foram analisados ​​por ImageJ 1.42q. Para as sequências de iniciador ver Tabela 1.

Preparação de extractos de células e análise por Western blot

As células foram lavadas com PBS gelado e lisadas usando Qproteome proteína de mamífero Prep Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou por tampão de lise contendo Tris 20 mM /HCl a pH 8,0, KCl 150 mM, EDTA a 1 mM, Na3VO4 0,2 mM, 1% de Triton X-100, PMSF 0,5 mM com um cocktail inibidor de proteína (completa, Roche Applied Science, Basileia, Suíça). Quantidades iguais de amostras de proteína foram desnaturadas a 95 ° C durante 5 minutos, separados por 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de PDVF. As membranas foram então bloqueados com leite em pó a 5% não gordo em PBS /0,1% de Tween-20 e incubadas durante a noite com os seguintes anticorpos: ZO-1 Mab, vimentina XP coelho mAb mAb de E-caderina, coelho mAb caracol, Slug de coelho O anticorpo mAb, TCF8 /ZEB1 coelho mAb, β-catenina de coelho IgG de mAb anti-coelho, de GAPDH coelho mAb, ligado a HRP (epitelial-mesenquimal de transição (EMT) Anticorpo Sampler kit # 9782 a partir de Cell Signaling Technologies, MA, EUA) e L -Dopa (# 8786 Cell Signaling Technologies, MA, EUA), enolase específica do neurônio (NSE) (# 9536 Cell Signaling Technologies, MA, EUA). Finalmente, as bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e o sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemanha) |

pirossequencia�o

O DNA genômico foi extraído usando DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Hilden, Alemanha) e quantificado usando um Espectrofotómetro NanoDrop 1000 (peqlab, Erlangen, Alemanha). ADN foi bissulfito-tratados utilizando o kit de ADN-ouro EZ metilação (Zymo Research, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e armazenados em alíquotas a -20 ° C até à sua utilização. Os iniciadores de PCR foram concebidos utilizando pirossequenciao Ensaio Software Design (Qiagen, Hilden, Alemanha) (Tab.2). Uma etiqueta universal foi colocada na extremidade 5 ‘do iniciador de sentido inverso específicos de sequência para CDH1 e um iniciador universal biotinilado correspondente contendo uma etiqueta 5’ biotina foi adicionado a estas reacções de PCR. A extremidade 5 ‘do iniciador de sentido inverso específicos de sequência utilizada para VIM fragmento amplificado um fragmento amplificado e 2 foi marcado com biotina. O amplicon (abrangendo -61 a +18 em relação ao TSS) da CDH1 incluiu sete locais CpG. No caso de vimentina, o fragmento amplificado foi dividido em duas partes, separadas por um intervalo de 73 pb. O primeiro fragmento amplificado de vimentina entre os nt 608-703 no que diz respeito ao TSS continha doze e o segundo fragmento amplificado (abrangendo 468-537 no que diz respeito ao TSS) oito locais de CpG, respectivamente. Cada reacção de PCR continha 25 ul de MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,4 mM, 0,03 U /uL Hot Start Taq ADN polimerase (Invitrogen, CA, EUA), de 0,16 micron para a frente e o iniciador e 1 uL de ADN tratado com bisulfito reversa. Para CDH1 0,16 uM iniciador directo e 0,03 ul atado iniciador inverso e 0,14 uM iniciador biotinilado foi utilizado universal. As condições de amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 5 min para desnaturação inicial; 50 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 segundos, variando a temperatura de recozimento durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s. Os produtos de PCR foram visualizados em geles de agarose a 2%. Cada reacção pyrosequencing foi obtido com 8-10 uL de cada produto de PCR biotinilado e o Kit Pyromark ouro de acordo com as instruções do fabricante sobre um pirossequenciador PyroMark Q96 MD (Qiagen, Hilden, Alemanha). Em resumo, o DNA biotinilado de cadeia simples foi imobilizado em Sepharose High Performance esferas revestidas com estreptavidina (GE Healthcare, Reino Unido) e separadas por desnaturação com NaOH 0,2 N. Após o recozimento do iniciador de sequenciação (0,25 uM /reacção) com o DNA de cadeia simples biotinilado, a mistura foi sujeita a sequenciação. Pirogramas foram analisados ​​utilizando o software Pyro Q-CpG para determinar o nível de metilação de citosinas metiladas e não metiladas em cada sítio CpG no fragmento amplificado. Cada análise foi realizada pyrosequencing independentemente, pelo menos, três vezes. testes desemparelhados t de Student foram realizados para testar diferenças estatísticas nos níveis de metilação média dos amplicons analisados. fibroblastos pulmonares cultivadas isolados de três pacientes sem doenças fibróticas serviram como controle normal. Os pares de iniciadores utilizados para PCR estão listadas na Tabela 2.

ensaio de proteólise Em células vivas

lâminas de câmara LabTek quatro poços foram revestidas com matriz de membrana basal livre de vermelho de fenol, contendo 30 ng /ml de DQ-colagénio IV (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Após 12 min a solidificação, 3 × 10

4 células em meio RPMI livre de vermelho de fenol com FCS a 1% foram colocadas no topo da matriz de membrana basal revestida. Após 48 h de incubação, as células foram fixadas com 2% de PFA, corados com Hoechst e montado. Os produtos de degradação do DQ-substrato (fluorescência verde) foram analisadas num microscópio automatizado (scan∧R – Olympus) usando um 20x, 0,75 NA, com emissão objectivo UPLSAPO Hoechst medida a 440-475 nm e DQ-colagénio a 520-550 nm . A intensidade média de degradação DQ-substrato foi calculado usando o software de análise scan∧R (v. 1.2.0.6) e normalizadas para o número de núcleos celulares.

array anticorpo Matrix metaloproteinases

Matrix metaloproteinases em meios condicionados de células foram analisados ​​com a matriz MMP Humana 1 (RayBiotech, Norcross, GA, EUA). As células foram lavadas com PBS e incubadas com FCS-livre e fenol-vermelho livre de RPMI 1640 durante a noite. Após centrifugação, meio condicionado de células foi aplicado a membranas pré-bloqueados, incubados a 4 ° C durante a noite e processada de acordo com as instruções do fabricante. matrizes de anticorpo foram quantificados com o software ImageJ v. 1.42q.

Gelatina zimografia

MMP-2 e MMP-9 actividades foram avaliadas por zimografia. As células foram lavadas com PBS e incubadas com FCS-livre e fenol-vermelho livre de RPMI 1640 durante a noite. media de células condicionado foram concentradas utilizando Amicon Ultracel 10 k colunas. Após determinar as concentrações de proteínas pelo ensaio de Bradford, quantidades iguais de proteína e 2 ul de controlo zimografia de MMP-2 (ProteaImmun, Berlim, Alemanha) foram sujeitas a electroforese em 7% de gel de SDS-poliacrilamida, contendo 1 mg /mL de gelatina (Merck, Darmstadt, Alemanha) . Os géis foram lavadas em 2,5% de Triton X-100 a solução durante 1 hora, em seguida, incubadas durante a noite em tampão de incubação (Tris 0,05 M /HCl a pH 7,5, NaCl 0,2 M e 0,005 M de CaCl2), a 37 ° C. Os geles foram fixados em 12% TCA, durante 1 hora e coradas numa solução de azul brilhante de Coomassie R250-coloração durante 1 hora, seguida de descoloração. Para controles de carga, as amostras foram carregadas em SDS-PAGE e corados por Coomassie brilhante coloração azul-R250.

Drug Resistance

Para testar quimio-sensibilidade, 3 × 10

4 NCI-H69 ou células NCI-H69V foram semeadas em placas de 6 cavidades, durante 12 h e foram depois tratadas com 200 pM de etoposido (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) durante 48 h como descrito anteriormente [21]. Mais tarde, a viabilidade celular foi testada utilizando iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) e iodeto de 3,3′-dihexyloxacarbocyanine (DIOC6) (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha). As células foram incubadas em meio RPMI 1640 contendo 0,5% de BSA, 10 nM DIOC 6 e 2 mg /ml de PI a 37 ° C durante 20 min e analisada por citometria de fluxo num FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA). Citometria de fluxo dados foram analisados ​​utilizando FlowJo v.7.6.3 software (Árvore Star Inc., San Carlos, CA, EUA).

Transwell migração

A migração de células SCLC foi avaliada usando 24- se placas de microquimiotaxia (Costar, Nova Iorque, EUA), em que 1 × 10

6 células em 100 ul de RPMI 1640 sem FCS, após jejum de 12 horas, foram colocados na câmara superior e a câmara inferior continha meio RPMI com 10% de FCS . Após 24 h de incubação a 37 ° C em 5% de CO

2, as células foram contadas de acordo com as instruções do fabricante. células invadidas na parte inferior da inserção da membrana foram dissociadas com tripsina e contadas utilizando um hemocitómetro. Índice de migração foi calculada como o número de células que migraram dividido pelo número de células que migraram no grupo não tratado. Cada experiência foi realizada em triplicado. Os dados representam a média +/- SD de três experiências independentes

ensaios de invasão

Para invasão ensaios do celular QCMTM 24 Bem Invasão de Ensaio. (ECM 550; Chemicon International, Temecula, CA, EUA) com uma membrana de policarbonato de tamanho de poro de 8 um e uma camada de material ECMatrix semelhante foi usada. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, pelo que 6 × 10

5 células foram deixados em jejum durante 12 h, semeadas para dentro da câmara superior, e incubadas durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO

2. A câmara inferior continha meio RPMI com FCS a 10%. Após 48 h as células na câmara superior foram removidas usando cotonetes, células invadidas na parte inferior da inserção da membrana foram dissociadas com tripsina e contadas utilizando um hemocitómetro. As experiências foram realizadas em triplicado.

A análise estatística

A significância estatística entre os controlos e as condições individuais foi avaliada por meio de software GraphPad Prism 5 utilizando o teste t. * Representa um valor de P 0,01-0,05, ** representa um valor de P 0,01-0,001 e *** representa um valor P menor do que 0,001. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

Os marcadores EMT-chave Vimentina e E-caderina são diferencialmente expressos

linhas de células SCLC como. NCI-H69 normalmente crescem agregados flutuantes como bem-embalados. No entanto, uma proporção consistente (5-10%) do número total de células observável cresce aderente. Para a linha celular NCI-H69 de uma sub-linha aderente foi estabelecida chamado NCI-H69V [20]. coloração de imunofluorescência diferiu consideravelmente quando se comparam NCI-H69 e a sua sublinha NCI-H69V para os marcadores chave de epiteliais e células mesenquimais fenótipos de E-caderina e vimentina: NCI-H69 foram positivas para E-caderina (Figura 1A) e Zona occludens (Figura 1b ), mas não mostrou expressão de vimentina (Figura 1c), enquanto que o aderente NCI-H69V foi negativo para a E-caderina (Figura 1d), mas fortemente positivo para a vimentina (Figura 1F). Maioria das células NCI-H69V foram negativos para Zona occludens (Figura 1e); no entanto, algumas células individuais mostrou ligeira restantes expressão Zona occludens (Figura 1e, asterisco). A expressão de E-caderina e vimentina, como genes característicos da EMT, distingue entre os diferentes subpopulações dentro da linha de células, demonstrando uma maioria de células epiteliais do tipo e menos aderente células em crescimento com um fenótipo mesenquimal semelhante.

As células em suspensão (NCI-H69) são fortemente positivas para e-caderina (vermelho) (a) e na Zona occludens (vermelho) (b), enquanto que as células NCI-H69V aderentes são negativos para a e-caderina (d). Maioria das células NCI-H69V foram negativos para Zona occludens, mas algumas células individuais mostrou ligeira expressão Zona occludens (asterisco, e). As células em suspensão (NCI-H69) são negativos (c), enquanto aderente NCI-H69V são positivos (f) para Vimentin (vermelho). Ki-67 foi co-coradas (verde). As células foram fotografadas pela Zeiss Axioplan microscópio e AxioCam Digital e analisadas por software ZeissAxioVision. Barra representa 20 um.

morfologia das células diferentes dentro de linhas de células SCLC

Nós investigamos a morfologia celular de subpopulações (flutuante vs. aderente) em linhas de células SCLC. Para este efeito, a sub-população aderente foi aumentado pela selecção até que as células cresceram como uma monocamada aderente completamente (Figuras 2b, E, G). As linhas celulares mostraram diferenças na adesão espontânea: NCI-N592 anexado com mais frequência e mais rápido do NCI-H69 (NCI-H69: Figuras 2a, b /NCI-N592: Figuras 2d, e). Um sublinha aderente foi estabelecida para NCI-H69, ou seja, NCI-H69V (Figura 2c) [20]. A linha de células aderentes que se estabeleceu seleccionado revelou morfologia semelhante (Figuras 2b, c). As taxas de crescimento e tempos de duplicação de NCI-H69 e NCI-H69V eram comparáveis ​​com 28 h (± 6,02) para NCI-H69 e 30 h (± 7,34) para NCI-H69V (Figura S1).

linhas de células NCI-H69 CPPC estão crescendo em clusters flutuantes (a) com uma pequena subpopulação de células aderente de crescimento que foram selecionados por eliminação células flutuantes ao longo de várias passagens (b) que se assemelham a sub-linha estabelecida NCI-H69V (c). NCI-N592 e NCI-H82 em aglomerados flutuantes típicos (d, f) e seleccionadas as células aderentes (E, G). subpopulações aderentes revelam uma forma de fuso, filopodia e microtentacles. As células foram fotografadas pela Zeiss Axioplan microscópio e AxioCam Digital e analisadas por Zeiss LSM Image Browser. Barra representa 200 um

Existem diferenças morfológicas impressionantes entre aderentes e células flutuantes em todas as linhas de células SCLC investigados:. Enquanto que as células em flutuante aglomerados parecem pequenas e redondas, com pequenos núcleos, as células ligadas são maiores, espalhar para fora, e ter uma proporção grande citoplasma-para-núcleo. Em particular, as células NCI-H69V ter uma forma de fuso com pseudopodia longo e fibras, fina cromatina granulares e uma falta de nucléolos proeminentes. Além disso, as células aderentes não crescem através de contactos célula-célula apertados até que eles são altamente confluentes.

A expressão de genes relacionados com a EMT e mudanças de metilação do DNA em Vimentin e E-caderina durante EMT

a expressão de ARNm de produtos típicos de genes de EMT foram comparados entre as diferentes linhas de células SCLC e suas sublinhas aderentes seleccionados por RT-PCR (Figura 3a). O gene marcador de E-caderina epitelial foi altamente expressa em flutuante NCI-H69. Em contraste, a expressão de caderina-E foi baixa em aderente NCI-H69V. Vimentina estava ausente nas células NCI-H69 de flutuação, ao passo que foi fortemente expressa em crescimento aderente NCI-H69adh e NCI-H69V (Figura 3a). Estas diferenças na expressão de mRNA também foram detectados em NCI-H82 e NCI-N592 sublinhas, com as células aderentes demonstrando um padrão mais semelhante mesenquimais. No entanto, a conversão não era tão clara como aquela em NCI-H69 /NCI-H69V (Figura 3a).

marcadores EMT e fatores de transcrição são expressos de forma diferente dentro das linhas SCLC (NCI-H69, NCI-H82, e NCI-N592). as células NCI-H69 não expressam marcadores mesenquimais ou indutores em culturas em suspensão, evidente no nível de ARNm por RT-PCR (uma). Zeb1, caracol /Snai1, Slug /Snai2, e FSP são expressos na sub-linha aderente (NCI-H69V), mas de E-caderina é expresso apenas em células em suspensão. marcadores mesenquimais Fibronectina e vimentina são regulados positivamente nas sublinhas aderentes (a). A expressão de ARNm em NCI-H82 e NCI-N592 em comparação com as suas subculturas aderentes geralmente revelou uma tendência semelhante para um fenótipo mesenquimal as células aderentes em (A). análise de transferência de Western exibe uma diminuição dos níveis de proteína no marcadores epiteliais E-caderina e occludens Zona 1, e a expressão de marcadores mesenquimais vimentina e ZEB1 em NCI-H69V. indutores do caracol EMT /Snai1, Slug /Snai2 são expressos em NCI-H69V (b). A mudança na expressão aderente NCI-N592 para um fenótipo mesenquimal semelhante é mais significativo sobre o nível de proteína do que o nível de ARNm (b). A NSE marcadores neuroendócrinos e L-Dopa são expressas na linha celular parental NCI-H69, mas não são detectáveis ​​no sub-linha NCI-aderente H69V (c). Análise de metilação de ADN (d) do gene da marca de vimentina EMT demonstra forte metilação em NCI-H69 e hipometilação significativa em NCI-H69V, E-caderina metilação é significativamente mais elevada em H69V. Como controle, fibroblastos pulmonares cultivadas isolados de três pacientes para níveis de metilação Vimentina e de dois pacientes para níveis de metilação E-caderina, sem doenças fibróticas serviram como controle normal. O bar apresenta a média de três medições independentes. As diferenças entre os níveis médios de metilação do fragmento amplificado analisado foi testado usando o teste t não emparelhado (* valor de p de 0,01-0,05, ** valor p 0,01-0,001 *** e valor de p inferior a 0,001) de Student.

no seu conjunto, a transcrição relacionados com a EMT fatores Zeb1, Caracol /Snai1, Slug /Snai2 e FSP foram expressos variável nas diferentes linhas de células (Figura 3a). Notamos as diferenças mais fortes em NCI-H69V em comparação com NCI-H69 e, portanto, concentrou-se nas células nas experiências seguintes.

Esta conversão a partir de células NCI-H69 epiteliais em um fenótipo mesenquimal (NCI-H69V) foi demonstrou ainda mais, obviamente, sobre o nível de proteína (Figura 3b): nós detectamos regulação baixa significativa da marcadores epiteliais e-caderina e Zona occludens 1 em NCI-H69V acompanhada por regulação positiva de indutores EMT e processadores de efeitos, tais como ZEB1, Caracol /Snai1, Slug /Snai2 e vimentina. Embora a expressão de ARNm de NCI-N592 única tendia para um fenótipo mesenquimal (Figura 3a), a expressão da proteína revelou claramente um padrão mesenquimais (Figura 3b).

Curiosamente, os marcadores neuroendócrinos NSE e L-Dopa foram expressos em a linha celular parental NCI-H69, mas não eram detectáveis ​​em sua sublinha aderente (Figura 3c).

metilação do DNA de vimentina e e-caderina

Para avaliar se regulação epigenética por metilação do DNA promotor pode desempenhar um papel nos níveis de expressão, foi aplicado pyrosequencing quantitativo para as regiões promotoras de vimentina e e-caderina (Figura 3D). Enquanto o promotor de vimentina mostrou níveis de metilação de ADN de 35% em células NCI-H69, os níveis de metilação do DNA em células NCI-H69V foram significativamente inferior com 1,3% (p 0,0001). Isto conduz a transcrição do gene activo, que está em consonância com o aumento observado na vimentina no nível de ARNm /proteína (Figura 1 e 2). fibroblastos pulmonares normais (n = 3) apresentaram níveis de metilação Vimentina de 1,1%. Por outro lado, os níveis de metilação do DNA de E-caderina /CDH1 foram de 31% em H69 e células aumentou para 40% em células NCI-H69V (p = 0,0032). fibroblastos pulmonares normais (n = 2) mostrou 17% e 8% de metilação, respectivamente. Esta correlação inversa entre a expressão e metilação do DNA pode sugerir que a metilação do DNA contribui para vimentina e E-caderina regulação mRNA e expressão de proteínas durante o processo de EMT em linhas de células SCLC.

migração Superior e potencial invasivo de aderentes NCI-H69

Para investigar se estas diferenças fenotípicas dramáticas ter consequências funcionais, realizamos transpo� ensaios de migração e invasão. As células NCI-H69V aderentes demonstraram significativamente maior migração e invasão em proteínas da matriz extracelular no sentido de FCS a 10% contendo meio do que as células NCI-H69 (Figura 4). NCI-H69 mostrou muito pouco potencial de migração e quase nenhuma invasão. A taxa de migração em células em suspensão NCI-H69 foi de 15 células por câmara de migração (± 6 /n = 3), ao passo que NCI-H69V aumentou 11 vezes com 196 células por câmara de migração (± 81 /N = 3) (p = 0,0001 ). O nível de invasão em H69 foi de 7 células por câmara de migração (± 3 /n = 3), ao passo que NCI-H69V foi 16 vezes superior com 118 células por câmara de migração (± 35 /n = 3) (p = 0,0001).

de crescimento aderente de células NCI-H69 demonstram migração significativamente maior (a) e invasão (b) em direcção a 10% de FCS contendo meio em comparação com a linha de células em suspensão (*** p = 0,0001). Índice de migração foi definida como o número de células que migraram dividido pelo número de células que migraram no grupo não tratado (sem FCS) após 48 horas. Índice de invasão foi definida como o número de células contadas em cinco campos exibição dividido pelo número de células que migraram no grupo não tratado (sem FCS) após 48 horas.

imagem de células vivas de actividade proteolítica extracelular indica maior proteolítica potencial de sublinhas aderentes

a invasão de células do cancro é acompanhada pela degradação da matriz extracelular (ECM). Por causa da maior invasão da sub-linha aderente, analisou-se o seu potencial de degradação do colagénio IV. Após 48 h de incubação em Matrigel contendo DQ-colagénio IV, as células NCI-H69V aderentes revelou significativamente maior taxa de degradação do colagénio pericelular que as células NCI-H69, conforme medido por fluorescência verde. A quantificação de células proteoliticamente activas revelou que 77% das células NCI-H69V foram positivos, ao passo que apenas 8% das células em suspensão NCI-H69 foram positivos (Figura 5)

ensaio de proteólise Em células vivas:. Suspensão NCI -H69 e células NCI-H69V aderentes foram incubadas durante 48 horas em Matrigel contendo 30 ng /uL DQ-colagénio IV. (A) A degradação do colagénio é determinada por fluorescência verde que rodeia as células positivas. Barra representa 30 um.