Abstract

carcinogênese bexiga acredita-se seguir dois caminhos alternativos acionados pela perda de cromossomo 9 eo ganho do cromossomo 7, embora outras alterações no número de cópias não aleatórios (CNAs) foram identificados. No entanto, são necessários estudos de confirmação uma vez que muitos aspectos deste modelo permanecem heterogeneidade claro e considerável entre os casos surgiu. Um dos objectivos deste estudo foi avaliar o desempenho de um (ensaio UroVysion) teste alvo amplamente utilizado para a detecção de carcinoma de células transicionais (TCC) da bexiga, em dois tipos diferentes de material derivado do mesmo tumor. Foram comparados os resultados do teste de UroVysion realizada em isolados de fresco interphasic Núcleos (FIN) e fixadas com formalina embebidos em parafina (FFPE) tecidos de 22 TCCs e não encontramos diferenças substanciais. Um segundo objetivo foi avaliar a concordância entre os perfis de matriz-CGH e os perfis cromossómicas alvo de ensaio UroVysion sobre um conjunto adicional de 10 TCCs, a fim de avaliar se UroVysion é um método suficientemente sensível para a identificação de aneuploidias selecionadas e não aleatória CNAs em TCCs. Nossos resultados confirmam a importância de métodos de rastreio genômicas globais, que é baseada em array CGH, para determinar de forma abrangente os perfis genômicos de grande série de tumores TCCs. No entanto, esta técnica tem ainda algumas limitações, tais como não sendo capaz de detectar baixas mosaicismo nível, ou não se detectar qualquer alteração no número de cópias de uma espécie de efeito de compensação, devido à presença de elevada heterogeneidade celular. Assim, é ainda aconselhável a utilização de técnicas complementares como matriz-CGH e peixe, como a primeira é capaz de detectar alterações no nível do genoma não excluindo qualquer cromossoma, mas o último é capaz de manter os dados individuais ao nível da única células, mesmo que se concentra em algumas regiões genômicas

Citation:. Panzeri E, Conconi D, Antolini L, Redaelli S, Valsecchi MG, Bovo G, et al. (2011) aberrações cromossômicas no câncer de bexiga: Fresco contra fixados em formalina parafina tecido embebido e FISH alvejado contra Análise CGH Ampla Microarray-base. PLoS ONE 6 (9): e24237. doi: 10.1371 /journal.pone.0024237

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 8 de junho de 2011; Aceito: 03 de agosto de 2011; Publicação: 01 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Panzeri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associazione Gianluca Strada Onlus e pela Regione Lombardia, chamada por progetti Indipendenti no ambito oncológico 2009. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o sétimo tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1] e o quarto câncer mais comum diagnosticada em homens no. EUA e países europeus [2]. Carcinoma de células transicionais (TCC) compreende a maioria dos cânceres de bexiga que representam mais de 90%. Na apresentação, a maioria (~ 70%) são tumores superficiais, exofíticas, papilares que são bem diferenciados (de baixo grau, LG) e não penetrar a membrana basal epitelial (estádio Ta) [1], [3]; os restantes são músculo invasiva (T2-T4) ou tumores microinvasivos (T1), que tenham penetrado na lâmina própria, mas não estão a invadir o músculo. Neste minoria, o epitélio tumor é pouco diferenciado (de alto grau, HG) e, muitas vezes associado com carcinoma

in situ

(CIS), que apesar de sua superficialidade é composto por epitélio pouco diferenciado. Isto é pensado para ser representativa de uma lesão precursora [1]. O prognóstico para tumores LG Ta é geralmente boa, porque esses tumores raramente, evoluir, mas o monitoramento é necessário, dado o risco significativo de reincidência (até 70%) [4]; isto é necessário também para HG TA (TAG3) e T1 tumores que apresentam um elevado risco de progressão para a invasão do músculo. Para pacientes com tumores invasivos musculares (≥T2), metástase é um problema clínico importante e cistectomias são geralmente indicados. O prognóstico é relativamente pobre com a sobrevivência de apenas 50% em 5 anos desde o diagnóstico [4].

As diferenças biológicas entre estes grupos, provavelmente, reflete a heterogeneidade genética subjacente que leva a caminhos específicos de desenvolvimento e progressão tumoral. Inúmeros estudos localizaram o estado dos oncogenes conhecidos e genes supressores de tumor e revelaram várias alterações recorrentes cromossómica associada à fase patológica e /ou do resultado do tumor [5], [6]. Além disso, com base nas alterações genéticas bem conhecidos de cancro da bexiga, uma fluorescência multi-alvo no ensaio de hibridação in situ (FISH) foi desenvolvido [7]. O sistema de detecção de FISH UroVysion, aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos, é baseado em três sondas centroméricas de cromossomos 3, 7 e 17 e uma quarta sonda para a região 9p21, para a detecção de aneusomy cromossômica e /ou deleção de 9p21 lócus , que são comuns alterações genéticas em TTCs [8], [9]. UroVysion foi inicialmente utilizada na última década apenas para a vigilância, mas recentemente também como uma ferramenta de rastreio do cancro da bexiga em pacientes com hematúria [10] – [12]. No entanto, outros métodos têm sido aplicados para detectar alterações no número de cópias associados com o desenvolvimento e progressão do tumor da CTP. estudos convencionais de hibridização genômica comparativa (CGH) têm proporcionado uma grande quantidade de informações, incluindo a identificação de uma série de regiões genômicas de amplificação de DNA contendo oncogenes conhecidos ou candidatos [13] – [15]. Por outro lado, a localização de genes supressores tumorais em grande parte TCC foram identificados pela perda de análise heterozigosidade (LOH) [16]. Com a utilização do mapeamento de alta resolução de CGH baseado em matriz, foram identificadas novas alterações no número de cópias (ANC) em muitas regiões genómicas pequenas que não foram detectados em estudos anteriores [17] – [19]. Os dados recolhidos até à data, para além da identificação de, pelo menos, duas vias citogenéticas para o desenvolvimento do tumor, isto é, a perda do cromossoma 9 e o ganho do cromossoma 7 [20] – [22], pode ser útil na concepção de novas terapias individualizadas. No entanto estudos de confirmação são necessários uma vez que muitos aspectos deste modelo permanecem obscuros, em particular na ordem cronológica das aberrações durante a progressão da doença. Para uma identificação sensata dos genes subjacentes às anormalidades cromossômicas, torna-se crucial para usar técnicas de confiança e passar pelo processo de validação de dados. Esta questão foi recentemente abordada por próstata e câncer de mama, gliomas e mieloma múltiplo [23] – [27], mas não para o câncer de bexiga. Embora formalina parafina e fixado espécimes incorporado (FFPE) tem várias vantagens, tais como a certeza do diagnóstico histológico e permitir estudos retrospectivos de um grande número de amostras, tecidos frescos são considerados os mais confiáveis ​​para análise genética molecular; eles fornecem uma análise abrangente da biópsia, embora o material não tem um diagnóstico histológico.

O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de um teste alvo de dois tipos diferentes de material derivado do mesmo tumor. No primeiro passo, foram comparados os resultados do teste realizado em UroVysion isolada de fresco interphasic Núcleos (FIN) e em tecidos FFPE de 22 TTCs (Figura 1). Além disso, um segundo objectivo foi o de avaliar a concordância entre os perfis de matriz-CGH e os perfis cromossómicas específicas, a fim de avaliar se um método UroVysion é adequadamente sensível para a identificação de aneuploidias seleccionados e CNA não aleatória em TTCs. A segunda etapa de comparação foi aplicada em um conjunto adicional de 10 TCCs, entre os dados obtidos a partir de qualquer array CGH na FIN e da análise UroVysion em tecidos FFPE (Figura 1).

A estratégia em duas etapas de análise aplicada neste estudo

resultados

primeiro passo da análise:. comparação entre os dados UroVysion de FIN e FFPE

TCC podem ser distinguidos no grau alto ou baixo (HG ou LG) e no músculo invasivo ou não (IN ou NI). No primeiro passo de análise 22 TTCs (9, 1 LGNI LGIN, 3 HGNI, 9 HGIN) foram analisados ​​pelo teste UroVysion aplicadas em duplicado a partir do mesmo na biópsia FFPE e amostras FIN (Figura 1).

a análise baseada no modelo multinomial, os dados FIN eram geralmente comparáveis ​​aos extraído de FFPE contrapartida no grupo LGNI, em termos de percentagem de perda, dissomia e ganho (Tabela 1; para uma lista detalhada ver Tabela S2). Por outro lado, no grupo HGNI os dois tipos de análise gerado resultados concordantes somente do CEP, 3 (Chromosome enumeração Probe 3). Na verdade, em CEP 7 e CEP17, FIN tendem a detectar uma menor percentagem de ambos perda (1,7 vs 10 por CEP 7; 6 vs 11,3 por CEP17) e dissomia (42,7 vs 62,3 por CEP7; 48, 3 vs 60,7 para CEP17); consequentemente, uma maior percentagem de ganho foi relatado (55,7 vs 27,7 por CEP7; 45,7 vs 28 para CEP 17). Finalmente, para Locus identificador específico (LSI) 9p21 FIN tendem a detectar uma percentagem mais elevada de ambos dissomia (58,3 vs 20,0) e ganho (10,3 vs 8,7), mas uma menor percentagem de perda (31,3 vs 71,3). Por outro lado, no grupo HGIN os dois tipos de análise gerado resultados discordantes somente do CEP, 3: FIN tendem a detectar um maior percentual de perda (14,9 vs 2,2) e uma menor percentagem de ganho (48,1 vs 62,5) do que FFPE.

Estes resultados foram confirmados na análise mais refinada por um modelo de Poisson (Figura 2). No grupo LGNI, o número médio de sinais para CEP3, CEP7, CEP17 e para a região 9p21 foi de 2,3, 1,8, 2,0, 0,5 (em amostras de fin) e 2,4, 2,1, 2,2, 0,9 (em FFPE) sem diferença significativa entre os dois tipos de teste (Figura 2, a). Por outro lado, no grupo HGNI o número médio de sinais para CEP3, CEP7, CEP17 e para a região 9p21 foi de 2,5, 2,9, 2,7, 1,8 (em amostras de fin) e 2,3, 2,3, 2,3, 1,2 (em FFPE) com diferenças estatisticamente significativas entre os dois testes, exceto para CEP3 (Figura 2, b). Por outro lado, no grupo HGIN, o número médio de sinais para CEP3, CEP7, CEP17 e para a região 9p21 foi de 2,5, 2,7, 2,3, 1,2 (em FIN) e 3,0, 2,7, 2,7, 1,2 (em amostras de FFPE), com significativa diferença para CEP3 (Figura 2, C).

contagem estimado de sinais observados em cada sonda (com intervalo de confiança de 95%) obtidos em cada tipo de tumor, representando clustering. O P-valores apresentados referem-se a comparação entre os métodos de FFPE e FIN. Painel A = LGNI (9 doentes); painel B = HGNI (3 pts); painel C = HGIN (9 pts).

cópia Genomic número alterações (CNAs) em núcleos isolados de fresco (FIN) por matriz-CGH

Na segunda etapa da nossa análise, realizada pela primeira vez array CGH em um conjunto adicional de 10 TCCs (6 HGIN, 1 HGNI, 3 LGNI), a fim de detectar CNAs entre tumor e de ADN de referência. Os ANC mais frequentes são resumidos na Tabela 2 (forma detalhada na Tabela S3). Classificamos as amostras em duas categorias: os tumores infiltrantes (IN-TCCs: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) e tumores não infiltrantes (NI-TCCs: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) (Figura 3). Em geral, como esperado, IN-TCCs tem muito mais do que CNAs NI-TCCs. ganho de 20q foi compartilhado por 4/6 IN-CTP tumores, enquanto que 2/4 NI-TCCs; 3p25.2 e 17q21 ganhos por tumores 4/6 IN-TCC e 1/4 NI-TCCs; 5p e ganho de 20p por 3/6 IN-TCC e 2/4 NI-TCCs; 6p22.3 e 11q13 foi compartilhada apenas pelos IN-TCC (3/6 e 2/6 respectivamente); finalmente 3T e 8q estavam em 1/6 IN-TCCs e 1/4 NI-TCCs. Para as perdas: 9p e 9p21 estavam em 4/6 e 3/6 IN-TCCs enquanto em 2/4 e 3/4 NI-TCCs; 9q32-q34 estavam em 3/6 IN-TCCs e 2/4 de NI-TCCs; perda 2T estavam em 3/6 IN-TCCs e 1/4 NI-TCCs; 8p perda somente em 2/6 IN-TCCs

CNAs de 10 amostras de TCCs: 6. Infiltrando tumores (IN-TCCs: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10), à esquerda, e 4 não – tumores infiltrantes (NI-TCCs: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) no lado direito. Cada ponto /bar corresponde a uma amostra. As perdas são evidenciado em verde, enquanto os ganhos em vermelho.

Para identificar possíveis casos de enriquecimento de grupos funcionais nos genes dentro das regiões com ganho e perda de tumores HGIN e LGNI, uma análise ontologia gene anotação foi realizada utilizando o software GOstat. Para HGIN emergiu um estatisticamente significativa sub-representação (p 0,05) de genes envolvidos na diferenciação celular, no ciclo celular e na regulação positiva da apoptose e morte celular programada; além de uma estatisticamente significativa sobre-representação de genes envolvidos na proliferação celular e na regulação da apoptose. Por outro lado, a análise evidenciou para LGNI tumores estatisticamente significativa sub-representação de genes envolvidos na indução de apoptose e morte celular programada (Tabela S4)

segunda fase da análise:. Comparação entre array CGH perfis on dados FIN e UroVysion sobre FFPE

a seguir, realizada a análise FISH por meio do teste Urovysion no conjunto adicional de 10 TCCs analisados ​​pela matriz-CGH; quando possível, duas áreas tumorais da mesma secção foram avaliadas a fim de aumentar o número de células analisadas e ter dados tão representativa quanto possível, tendo em conta a heterogeneidade bem conhecida neste tipo de cancro. Para cada sonda de uma análise estatística foi realizada para verificar que as contagens de sinal em células 100 foram diferentes considerando as duas áreas separadamente ou misturando-os em conjunto. Resultados concordantes entre as duas áreas tumorais foram relatados em dois casos (HGIN 070CR09 e 081CR09) (figura 4, A); resultados contrastantes inversamente, estatisticamente significativa (P 0,05) foram relatados em dois casos (HGIN 009CR10 e 026CR10) (Figura 4, B); nos seis casos restantes diferenças estatisticamente significativas entre as duas áreas tumorais foram evidenciados por um (010CR10), dois (028CR09 e 080CR09) ou três sondas (004CR10) (ver também Quadro S5). Estes dados salientou a elevada heterogeneidade geral intra-tumoral destas amostras

A comparação entre os resultados em duas áreas selecionadas tumorais da mesma seção do FFPE: (A):. Os dois tumores mais concordantes (070CR09 e 081CR09); (B):. Os dois tumores mais discordantes (009CR10 e 026CR10)

Então, fizemos uma tentativa de comparar os dados sobre UroVysion FFPE apenas relatados com os perfis de matriz-CGH dos 10 TCCs, descrito acima. Para este efeito, para cada amostra que extrapolaram os resultados para análise de matriz-CGH correspondente aos cromossomos direcionados quatro UroVysion e comparou-os com os dados peixe (Tabela 3). concordância total foi encontrada somente para 28CR09 (HGNI) e 09CR10 (HGIN) (zonas cinzentas na Tabela 3). No entanto, para outros tumores, uma boa correlação foi observada entre as duas técnicas; ou seja, para os tumores 010CR10 e 070CR09 (ambos HGIN) a concordância foi evidenciado para 3/4 cromossomas segmentados. Ver Figura 5 para dois exemplos de mais concordantes (D) e os dados menos concordantes (E). A maior concordância foi visto para o cromossoma 3 (10/07), enquanto os outros cromossomas segmentados mostrou uma correlação razoável (10/06). Por exemplo, em 082CR09 (LGNI) e em 04CR10 (HGIN), 9p21 perdas foram evidenciados apenas por análise de FISH; por outro lado, a amplificação de locus de 3p25 para 028CR09 (HGNI) e para 070CR09 (HGIN) surgiu apenas a partir de dados de matriz-CGH. A fim de validar os dados de matriz-CGH e para distinguir uma polissomia do cromossoma 3 de um verdadeiro amplificação, a análise de FISH foi realizada com ambos ensaio de teste Urovysion e a sonda de separação de duas cores de PPARy (3p25), em duas secções FFPE consecutivos de 028CR09 ( A Figura 5, C). A análise estatística das contagens de sinal em 100 núcleos avaliou a verdadeira amplificação em 3p25 relação a um polissomia do cromossomo 3 (

test t

: p 0,01).

teste Urovysion aplicada a: (A ): FIN amostra 032CR07 (HG NI); (B): amostra FFPE 080CR09 (LG NI). (C) FISH com

PPAR

sonda γ em 028CR09 (HGNI). Urovysion contra-matriz CGH dados: Exemplo de dados concordantes (D), (amostra 080CR09); e dados não concordantes (E), (amostra 004CR10).

Discussão

Apesar da extensa investigação sobre as alterações genéticas do câncer de bexiga e modelos detalhados que ligam tais mudanças a iniciação e progressão tumoral [20] – [22], existem poucos marcadores confiáveis ​​para distinguir tumores com características agressivas no momento do diagnóstico precoce e ainda estamos procurando o método de eleição para detectá-los. Neste sentido, um recente estudo prospectivo até mesmo sugeriu que cistoscopia sozinho permanece a estratégia mais rentável para a detecção de recorrência do câncer de bexiga não invadir o músculo [28]. No entanto, em contraste com o que anteriormente relatado por outros [29], vários autores afirmaram a mesma conclusão [30], e o papel de Urovysion em amostras de urina suspeita permaneceu questionável, especialmente tendo em vista o seu elevado custo.

o desenvolvimento da matriz-CGH levou à possibilidade de analisar todo o genoma em um único experimento, sugerindo sua possível aplicação em programas de rastreio /vigilância de pacientes com câncer. No caso do cancro da bexiga, matriz-CGH daria a possibilidade de analisar o ADN a partir de uma biopsia do tumor, enquanto que por Urovysion amostras de urina são geralmente analisadas.

As principais desvantagens desta técnica são que, mesmo Se ele é específico e sensível, é invasivo e ainda caro. Além disso, até à data não existem dados suficientes para apoiar o uso de array-CGH neste tipo de programas, mas poderia ser interessante para aplicar esta técnica para as categorias de pacientes com alto risco de câncer.

O Urovysion multitarget ensaio foi desenvolvido para a detecção de CTP em amostras de urina [7]. O conjunto de sondas FISH óptima foi determinada testando diferentes sondas para a detecção de TCC na urina de pacientes com cancro da bexiga e seleccionando aqueles que eram ou a mais sensível individualmente ou que complementou outras sondas para aumentar a sensibilidade global do teste. As sondas CEP e LSI 9p21 eram complementares porque as sondas CEP detectar hiperdiploidia, comum em carcinoma

in situ

e TCC invasiva, enquanto a sonda LSI 9p21 detecta eliminações da banda 9p21, comum em TCC não-invasivo [7 ]. Tem sido sugerido anteriormente que um resultado FISH falso-negativo representa principalmente TCC baixo grau que não derramou células tumorais na urina ou não exibem as alterações cromossômicas que são detectados pelo ensaio [11]. Outro limite, e uma outra possível explicação para os resultados falso-negativos peixes, pode ser atribuída ao baixo número de células neoplásicas presentes na amostra [30].

Na primeira etapa deste estudo que comparou o desempenho de neste ensaio multitarget para a detecção de células tumorais de bexiga, tanto em FIN, sem diagnóstico histológico e mesmo com um número baixo de células neoplásicas, e no tecido FFPE. Nossa análise evidenciou uma boa correspondência dos dados PEIXES Urovysion entre FIN e FFPE para tumores LGNI e HGIN; Em particular, no primeiro grupo, FIN tendiam a detectar um pequeno número de relação sinal para FFPE, enquanto que no último grupo um tendência oposta foi apreciada. Para HGNI TTCs, surgiram diferenças significativas durante três sondas específicas, mas poderia ser devido ao baixo número de amostras deste grupo. O desempenho deste teste-alvo é, portanto, suficientemente aceitável também em amostras FIN; além disso, os mesmos CNAs foram fielmente refletida pela análise sobre FFPE. Mantém-se para investigar se se trata de um método eficiente para detectar os CNA mais representativas e eficazes de TTCs. Para o efeito, na segunda etapa deste estudo, array-CGH foi realizada em 10 TCCs adicionais para dissecar o espectro de alterações no cancro da bexiga e identificar aberrações recorrentes que podem conter genes relacionados com o cancro.

detectado numerosas mudanças genéticas por array CGH: a perda envolvidos cromossomo 9p-braço mais frequente, enquanto o ganho de cromossomo envolvido 20Q-braço mais frequente, como já relatado por outros [5], [6], [14], [18], [19]. Surpreendentemente, não encontramos uma elevada percentagem de tumores com o ganho de 6p22.3 e 8q relatado em outros estudos [14], [18], [19]. LOH e sub-representação do cromossomo 9 é a alteração genética mais frequentemente descritos na TCC ( 50%). A perda comum de uma cópia inteira do cromossomo 9 indica a presença de genes supressores de tumores tanto em 9p e 9Q e genes candidatos foram identificados em várias regiões, incluindo 9p21 (

CDKN2A

), 9q12-13 (

PTCH

), 9q32-33 (

DBC1

) e 9q34 (

TSC1

). Neste estudo, observou-se perda completa ou parcial de 9p e /ou 9q em 7/10 tumores, tanto no HG e LG. Além disso, em alguns HG observou-se um ganho para este lócus, mesmo que isto poderia ser devido ao cromossoma 9 poliploidia (como o sinal de instabilidade cromossómica). O ganho mais frequente é 20Q (6 tumores), de acordo com dados previamente relatados em muitos outros cancros, incluindo bexiga, cólon, ovário e mama [31]. Associação de 5p e 20Q ganhos, encontrada em 3 tumores HG, relatados por Bruch [32], poderia ser associada com a progressão. Finalmente, o ganho de 17q21 é identificada apenas em tumores HG, sugerindo um possível papel na progressão do tumor.

O ponto mais interessante deste estudo é a comparação dos dados de matriz-CGH e dados PEIXES Urovysion. Com efeito, foi evidenciada não só uma alta pressão intra e inter-heterogeneidade do tumor em material de FFPE, como surgiu a partir da análise de duas áreas tumorais diferentes do mesmo tumor; também encontramos algumas discrepâncias nas duas técnicas que poderiam ser parcialmente atribuída a um possível efeito de mascaramento das células normais ou para um efeito compensatório derivado da grande heterogeneidade do tumor. Esta heterogeneidade foi já descrita pelo nosso grupo no cancro da bexiga de células estaminais do tipo que são geneticamente diferentes [33]. Podemos sugerir que esta diversidade gera subpopulações viáveis ​​e relação clonal que se tornam heterogênea no mesmo tumor.

Os dados globais array CGH sublinhou uma vez mais, a presença de alterações frequentes (ou seja, 20p e 5p ganhos) que não pode ser detectado pelo ensaio de Urovysion. Uma outra vantagem de usar uma abordagem técnica integrado surgiu para 028CR09 amostra: a amplificação de 3p evidenciado por matriz-CGH foi estudada por FISH com Urovysion ensaio e uma sonda LSI 3p. Através da integração de vários métodos, fomos capazes de discriminar a verdadeira amplificação de um polissomia cromossomo 3. Este lugar inclui a gama de peroxissoma proliferador-ativado receptor (

PPARG

), um fator de transcrição ligando activado implicado na regulação da proliferação e diferenciação de urothelium [34], [35].

Concluindo, um esforço considerável ainda é necessário para definir os genes subjacentes as anomalias cromossómicas para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos, a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas. Nossos resultados confirmam a importância de métodos de rastreio genômicas globais, que é baseada em array CGH, para determinar de forma abrangente os perfis genômicos de grande série de tumores TCCs. No entanto, esta técnica tem ainda algumas limitações, tais como não sendo capaz de detectar baixas mosaicismo nível, ou não se detectar qualquer alteração no número de cópias de uma espécie de efeito de compensação, devido à presença de elevada heterogeneidade celular. Assim, é ainda aconselhável a utilização de técnicas complementares como matriz-CGH e peixe, como a primeira é capaz de detectar alterações no nível do genoma não excluindo qualquer cromossoma, mas o último é capaz de manter os dados individuais ao nível de células únicas , mesmo se ele se concentra em algumas regiões genômicas.

Materiais e Métodos

Uma forma detalhada pode ser encontrada em Materiais e Métodos S1.

Este estudo foi aprovado e fundada por Direção Geral Sanità Regione Lombardia e apresentado pelo Director-Geral e compromisso ético do ICP Hospital Bassini. consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes do estudo antes da coleta do tecido.

Pacientes e amostras

Um total de 32 amostras de tumores (28 homens e 4 mulheres) foram obtidas por ressecção transuretral em uma série consecutiva dos pacientes recém-diagnosticados com TCCs em um único centro (Tabela S1). O consentimento informado foi obtido antes da coleta de tecido. Preparo e classificação foram feitas de acordo com a Organização Mundial da Saúde Consenso Classificação [1]. Eles foram distinguidos no grau alto ou baixo (HG ou LG) e no músculo invasivo ou não (IN ou NI).

Fluorescência hibridização in situ

Para FIN, biópsias foram cortadas e cultivadas em meio RPMI-1640 (Euroclone Spa) suplementado com 20% de FCS durante 24 horas. As peças foram submetidas a tratamento hipotónico e fixadas com 3: 1 de metanol: ácido acético. células individuais isoladas de biópsias com ácido acético a 60%, foram vistos em lâminas e deixe secar. Para FFPE, tecidos foram fixados de acordo com os procedimentos padrão.

O pré-tratamento e análise de FISH foram realizados em ambos os núcleos isolados de amostras FIN e FFEP kit cancro da bexiga UroVysion (Vysis, Wiesbaden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante .

Após a hibridização das sondas não ligadas foram removidas por uma série de lavagens e os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).

pelo menos 100 células para cada preparação foram marcados e os sinais foram divididos de acordo com a perda (número de sinais /célula 2), dissomia (número de sinais /célula = 2) e ganho (número de sinais /celular 2).

Para lócus 3p25 análise FISH em FFPE foi realizada utilizando sonda quebra Poseidon ™ Repita gratuito ™ PPAR (3p25) (Kreatech Diagnostics, Amsterdam, Holanda). A significância estatística das diferenças entre cromossomo 3 polisomy e 3p25 amplificação foi avaliada pelo teste t de Student nas contagens separadas de 100 núcleos. Diferenças foram consideradas estatisticamente significativa com p . 0,01

Todas as imagens digitais foram capturadas usando um microscópio Leitz (Leica DM 5000B) equipado com um (CCD) de carga acoplado dispositivo e analisados ​​por meio de software Chromowin (Tesi imaging, Milão, Itália).

array CGH

Para a análise de matriz-CGH, ​​DNA genômico foi extraído a partir de biópsias frescas após a digestão enzimática com colagenase H (Roche, Mannheim, Alemanha) e proteinase K (Roche, Mannheim, Alemanha) e purificada utilizando fenol /clorofórmio (Carlo Erba, Milão, Itália). A preparação da amostra, a hibridação corrediça, e a análise foram realizadas utilizando SurePrint G3 humano CGH Microarray 8x60K (Agilent, Santa Clara, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de DNA comerciais sexo correspondentes (Promega) foram usadas como referência ADN durante matriz-CGH. As matrizes foram digitalizadas com resolução de 2 mm com o scanner Agilent microarray e analisados ​​utilizando v10.7 Feature Extraction e softwares v5.0 Agilent Genomic Workbench. O (ADM2) Aberração algoritmo de detecção Método 2 solicitado pelo software Workbench genómico foi utilizado para calcular e auxiliar a identificação de aberrações para uma dada amostra (Limiar = 5; proporção = 0,3 log2). Para calcular a percentagem estimada de mosaicismo foi utilizada a fórmula determinado por Cheung SW et al. [36].

Gene ontologia análise

Para analisar quais as classes de ontologias foram super e sub-representados entre os genes delineadas dentro das regiões ganho e perda detectados pela matriz-CGH, ​​o software GOstat ( disponível em https://gostat.wehi.edu.au/) foi utilizado [37] com base em Amigo (a base de dados Gene Ontology) versão 1.8.

a análise estatística

os casos foram descritos por calcular as proporções de perda, dissomia e ganho sobre o total de pelo menos 100 células, especificamente para o tipo de análise (FFPE e FIN), e sonda de teste UroVysion.

Um modelo multinomial representando a presença de agrupamento foi utilizado para estimar para cada tipo de tumor e do tipo de análise, a proporção global de perda, e dissomia ganho com intervalos de confiança de 95%. Este modelo também foi utilizado para comparar as proporções globais de perda, e dissomia ganho detectada pelos dois tipos de análise.

Um modelo de Poisson com base em transformação logarítmica das contagens na presença de agrupamento foi utilizada para estimar o número dos sinais detectados por cada tipo de análise com intervalos de confiança de 95%. Este modelo permitiu também para comparar o número de sinais entre os dois tipos de análise (FFPE e FIN).

informação de apoio

Tabela S1.

características clínico-patológicas de 32 amostras de tumores do estudo. Histologia /Grade e fase do estudo são indicados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024237.s001

(DOC)

Tabela S2.

UroVysion resultados do teste em núcleos interphasic recentemente isolados (FIN) e em parafina núcleos formol fixa (FFPE).

doi: 10.1371 /journal.pone.0024237.s002

(DOC)

Tabela S3. Número

Copiar alterações (CNA) compartilhados (sinal) entre 10 amostras de CTP analisados ​​pela matriz-CGH. NI-TCCs são indicados em itálico; EM-TTCs são indicados a negrito. Para Histologia /Grade ver Tabela S1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024237.s003

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Tabela S4.

Gene Ontology. I. estatisticamente significativa (p 0,05) sub-representação das ontologia gênica (GO) Categorias em HG em tumores. II. Estatisticamente significativa (p 0,05) sobre-representação de ontologia gênica (GO) Categorias em HG em tumores. III. Estatisticamente significativa (p 0,05) sub-representação das ontologia gênica (GO) Categorias em tumores LG NI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024237.s004

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Tabela S5. dados

Urovysion. I. Comparação entre os dados Urovysion em duas áreas tumorais diferentes da mesma secção II. Comparação entre os dados Urovysion em duas áreas tumorais diferentes da mesma secção

doi: 10.1371 /journal.pone.0024237.s005

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Materiais e Métodos S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0024237.s006

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