Abstract

ovário e pâncreas são dois dos cancros mais agressivos e letais, cujos rostos gestão apenas limitado opções terapêuticas. Normalmente, esses tumores espalhados insidiosamente acompanhada primeiro com sintomas atípicos, e, geralmente, mudar para um fenótipo de resistência a droga com o arsenal farmacêutico atual. Assim, o desenvolvimento de novos fármacos que actuam através de um mecanismo de acção diferente representa uma prioridade clara. Aqui, estamos relatando pela primeira vez que o derivado aminoesteróide RM-133, desenvolvido em nosso laboratório, exibe atividade promissora em dois modelos de cânceres agressivos, nomeadamente ovarianos (PANC-1) cancros (OVCAR-3) e pancreáticas. A IC

50 valor de RM-133 foi de 0,8 uM e 0,3 uM para OVCAR-3 e PANC-1 linhas celulares em cultura, respectivamente. Com base em estudos farmacocinéticos sobre RM-133 usando 11 veículos diferentes, foram selecionados dois veículos principais: aquosa de metilcelulose 0,4%: etanol (92: 8) e óleo de girassol: etanol (92: 8) para

In vivo

estudos . Usando injecção subcutânea de RM-133, com o veículo à base de metilcelulose, o crescimento de tumores PANC-1 para ratinhos nus xenoenxertados foi inibida em 63%. É bastante interessante, RM-133 Injectaram-se subcutaneamente com o OVCAR-3-crescimento de xenoenxerto com base metilcelulose ou veículos à base de girassol redução de 122% e 100%, respectivamente. Após o final do tratamento, RM-133 usando o veículo à base de metilcelulose, OVCAR-3, inibição do crescimento tumoral foi mantida durante ≥ 1 semana. RM-133 também foi bem tolerado em todo o animal, nenhum sinal aparente de toxicidade tendo sido detectada nos estudos de xenoenxerto

citação:. Kenmogne LC, Ayan D, J Roy, Maltais R, Poirier D (2015) os aminoesteróide derivativos RM-133 Shows

In Vitro

e

In Vivo

antitumoral Atividade no ovário humano e pâncreas. PLoS ONE 10 (12): e0144890. doi: 10.1371 /journal.pone.0144890

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 25 Setembro, 2015; Aceito: 24 de novembro de 2015; Publicação: 14 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kenmogne et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Canadian Institutes of Health Research (CIHR, POP-I), Busto Quebec Cancer Foundation (QBCF), Société de valorização de la recherche em Québec City (SOVAR), Faculdade de Medicina da Université Laval, e Centre de Recherche en Endocrinologia moléculaire et Oncologique et Génomique Humaine (CREMOGH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:. Autores JR, RM, e DP deste manuscrito tem os seguintes interesses concorrentes: 2 – (piperazinilo N-substituído) derivados de esteróides: Patente 13 /130.621 (EUA); Pedidos de patente 2.744.369 (Canadá) e 09.828.506,7 (Europa). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Como um importante problema de saúde pública em todo o mundo, o câncer é responsável por uma em cada quatro mortes nos EUA e no Canadá [1,2]. cancros do ovário e pâncreas são dois cânceres agressivos que compartilham as características de propagação insidiosamente durante a exibição de sintomas atípicos, e prontamente mudando para um fenótipo de resistência aos medicamentos. O câncer de ovário é uma doença heterogênea que aflige anuais de 225.000 mulheres em todo o mundo [3-5]. É o mais letal entre as neoplasias malignas ginecológicas, devido à sua natureza assintomática na sua etiologia cedo, e a falta de ferramentas de diagnóstico eficientes [2,5]. Como resultado, 75% das mulheres já se apresentam com estágios avançados de câncer de ovário (estádios III-IV da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia de classificação), quando diagnosticada pela primeira vez [3,6-9]. Para estas mulheres, a taxa de sobrevida de 5 anos varia de 25% a 35% [3,10] e o tratamento padrão ouro é debulking cirúrgico e quimioterapia com base em uma combinação de paclitaxel e regimes à base de platina [6,11-13 ]. Embora a resposta inicial a um tratamento do cancro do ovário é favorável, a maioria dos pacientes tornam-se resistentes a tratamentos actualmente utilizados e mais de 90% estão sujeitos a recaídas após 18 meses [14,15]. Por outro lado, o cancro do pâncreas, que é o quarto cancro mais letal, é um neoplasma agressivo apresentando um prognóstico muito pobre [1,2,16]. Sua taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 6% [1] devido ao diagnóstico tardio inicial, rápida progressão da doença, e resistência a regimes de quimioterapia no uso atual [17]. Como tumores pancreáticos são caracterizados por uma vasta invasão local e linfático precoce, bem como metástases hematog�icas [18], apenas poucos pacientes são candidatos à ressecção, e, por conseguinte, a quimioterapia baseada em gemcitabina sistémica é a forma mais corrente de tratamento [19]. Apesar das recentes melhorias no desenvolvimento de medicamentos, o comprimento ea qualidade de vida dos doentes com cancro pancreático não melhoraram [20]. Assim, existe uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens para a gestão destas doenças, que estão entre os cancros mais agressivos e letais e têm limitado opções terapêuticas, especialmente para pacientes com câncer pancreático irressecável, cujo estado geral se deteriora rapidamente [16,20, 21].

as considerações anteriores indicam que o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos que actuam através de diferentes mecanismos de acção é extremamente necessário para vencer o principal problema da resistência aos medicamentos encontrado com estes dois tipos de cancro, e, portanto, para melhorar o a sobrevivência global dos doentes. Composto RM-133 (Figura 1) é um dos aminoesteróides que tem sido desenvolvido no nosso laboratório [22]. Ele mostrou actividade anti-proliferativa em várias linhas de células de cancro (células HL60 humanas promielociticas de leucemia, células de carcinoma da mama humano T-47D, células de leucemia mielomonocítica WEHI-3 de ratinho, e células cancerígenas da próstata humano LNCaP) com CI

50 valores que variam de 0,1 a 2? M [23]. RM-133 também mostrou um baixo a moderado risco de interações medicamentosas com base na sua inibição fraca do fígado enzimas CYP3A4 e CYP2D6 [23]. Numa precede

In vivo

ensaio, RM-133 bloqueou em 57% o crescimento de xenoenxerto de tumor HL60 em ratinhos nus [22]. Em um estudo preliminar do mecanismo de ação desta família de aminoesteróides, um análogo da RM-133 bloqueou células HL60 em fase G0 /G1 e apoptose induzida [24].

A seguir, relata o promissora actividade anti-cancro de RM-133 em células de adenocarcinoma humano OVCAR-3, que é um modelo para a investigação de resistência a drogas em cancro do ovário [25], e em carcinoma de células pancreático humano (PANC-1). Nós também relatam estudos farmacocinéticos em RM-133 envolvendo vários veículos, bem como a sua actividade antitumoral em modelos de cancros do ovário e do pâncreas, a saber, a OVCAR-3 e PANC-1 tumores xenoenxertados em ratinhos nus.

Materiais e métodos

linhas de células e cultura de células

de ovário humano (OVCAR-3) e pâncreas (PANC-1) as células cancerosas foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e mantida em crescimento exponencial em 5% de CO

2 atmosfera humidificada a 37 ° C. OVCAR-3 células foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 20% de FBS, L-glutamina (2 mM), antibióticos (penicilina 100 IU /ml e estreptomicina 100 ug /ml), insulina (50 ng /mL) e estradiol (1 nM). Para OVCAR-3 ensaios de proliferação celular, o meio utilizado foi idêntico, excepto quanto à omissão de estradiol. células PANC-1 foram mantidas em DMEM-elevado teor de glucose (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) contendo L-glutamina (2 mM) e antibióticos (100 IU de penicilina /mL e 100 ug de estreptomicina /ml), e suplementado com 10% de FBS . Para PANC-1 Os ensaios de proliferação celular, o meio de manutenção, este último foi substituído com DMEM /F12 contendo os mesmos suplementos.

ensaios de viabilidade celular

O ensaio de proliferação celular foi realizado com um método colorimétrico usando três – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) (Cell Titer 96 Aqueous, Promega, Madison, WI). Microtitulação de placas de 96 cavidades (Becton-Dickinson Companhia, Lincoln Park, NJ) foram semeadas com 1 × 10

4 células /poço em suspensão em 100 uL de meio e pré-incubou-se durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO

2 atmosfera. Uma solução de estoque de RM-133 foi preparada em EtOH (1 × 10

-2 M) e diluiu-se em meio experimental, que foi adicionada a cada poço, no tempo zero. Após uma incubação de 72 h, MTS (20 uL da solução fornecida pelo fabricante) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 4 h. MTS é convertido em formazano corado solúvel em água por desidrogenases presentes em células metabolicamente activas, e, por conseguinte, o ensaio MTS permite a determinação imediata de absorvência do formazano solúvel directamente no meio de células e, portanto, a medição de células viáveis. O

A

490 do meio foi determinada usando um leitor de microplacas de 96 poços INFINITE 200 Pro Series (TECAN, Männedorf, Suíça). A IC

50 valor de RM-133 foi determinada para cada uma das duas linhas de células, utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software 7, Inc., San Diego, CA).

Animais

Todos

in vivo

experimentos foram aprovados pelo nosso animal Care Institucional e Comitê de Uso (Comités de protecção dos animais de l’Université Laval) e realizada de acordo com as diretrizes do Canadian Council on animal Care. Para xenotransplantes, homozigoto ♀

nu /nu

ratos pelados (24-42 dias de idade) foram adquiridos de Charles River Inc. (Saint-Constant, QC, Canadá) e alojados (4-5) em micro- vinil gaiolas ventiladas isoladas, equipados com tampas de ar, que foram mantidos em capuzes fluxo de ar laminar e mantidos sob condições limitantes patógeno. Durante o período de aclimatação e ao estudo, os animais foram alojados sob um ambiente controlado a 22 ± 3 ° C, com 50 ± 20% de humidade relativa e luz fixada em 12 h /dia (luz acesa às 07:15). alimentos roedor (roedor dieta # T.2018.15, Harlan Teklad, Madison, WI) e água foram fornecidos

ad libitum

. Para

nu /nu

ratos nus, comida e água foram esterilizadas antes de ser dispensado aos animais. ratinhos /c Balb padrão foram utilizadas para estudos farmacocinéticos. Os animais foram anestesiados com isoflurano e sacrificados por deslocamento cervical.

Efeito da RM-133 sobre OVCAR-3 xenotransplantes e concentração plasmática da droga em ratinhos nus

Primeira parte.

Vinte -dois ♀ sc

nu /nu

ratos pelados (22-24 g) foram inoculados com 5 x 10

6 OVCAR-3 células (em 0,1 mL de meio de crescimento contendo 30% de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)) em ambos os flancos de cada ratinho através de uma longa agulha de calibre 22 de 2,5 cm. Após 11 dias, os ratinhos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em dois grupos de 11 ratos cada um de acordo com o tamanho do tumor, isto é, um grupo de controlo (

N

= 12 tumores) e um grupo tratado (

N

= 15 tumores). RM-133 foi administrado s.c. diário com 60 mg /kg em 0,1 ml de propilenoglicol: EtOH (92: 8). Os animais do grupo controle recebeu 0,1 ml de veículo sozinho. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana utilizando um calibrador. Dois diâmetros perpendiculares (

L

e

W

) foram medidos, e a área de tumor (em mm

2) foi calculada utilizando a fórmula (

L

/2 ) x (

W

/2) x ¸. Os animais foram pesados ​​em vários intervalos durante o ensaio.

segunda parte.

No final da experiência de xenoenxerto, e, a fim de obter dados farmacológicos preliminares, os ratinhos nos grupos tratados foram separados em quatro subgrupos de 2-3 ratinhos cada, injectados SC com RM-133 (60 mg /kg) e sacrificados após 3, 7, 12, ou 24 h. Em paralelo, os ratos no grupo de controlo também foram separados em 4 subgrupos, tratado com MP-133 (60 mg /kg) como em ratos tratados, e sacrificaram-se nos mesmos intervalos. O sangue foi recolhido de ratinhos por punção cardíaca, e a concentração plasmática de RM-133 determinado por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS), tal como anteriormente relatado [23]. Os tumores dos ratinhos no grupo tratado foram recolhidos na necropsia, reunidas, homogeneizadas de acordo com um procedimento conhecido [26] e a quantidade de MP-133 foi determinada por LC-MS /MS.

Concentração

Plasma de RM -133 em ratinhos com diferentes doses de injecção

Oito ratos ♀ Balb /c pesando aproximadamente 20 g foram separados em 4 grupos. Os ratinhos em cada grupo receberam uma única s.c. injecção de RM-133 (30, 60, 120, ou 480 mg /kg). O veículo utilizado foi o propileno glicol: EtOH (92: 8) e o volume de injecção foi de 0,1 ml para todas as concentrações, excepto a 480 mg /kg, em 0,2 ml foi usada. O sangue foi colhido por punção cardíaca, após 12 h, e a concentração plasmática de RM-133 determinado por LC-MS /MS como acima.

Análise de diferentes veículos para administração RM-133

Onze veículos diferentes foram investigadas por sc injecção [27-35]. Estes veículos foram formulados como se segue: veículo # 1 [propilenoglicol: EtOH (92: 8)]; veículo # 2 [aquoso a 0,4% metilcelulose: EtOH (92: 8)]; veículo # 3 [óleo de rícino: EtOH: álcool benzílico: benzoato de benzilo (65: 10: 10: 15)]; veículo # 4 [óleo de girassol: EtOH (92: 8)]; veículo # 5 [óleo de girassol: tetrahidrofurano (92: 8)]; veículo # 6 [aquoso a 25% β-ciclodextrina: EtOH (92: 8)]; veículo # 7 [óleo de sésamo: EtOH: benzoato de benzilo: álcool benzílico: Tween 80 (89,8: 7,8: 1: 1: 0,5)]; veículo # 8 [óleo de soja: EtOH (92: 8)]; veículo # 9 [meio RPMI: EtOH (92: 8)]; 10 # veículo [solução salina: sulfóxido de dimetilo (DMSO): Tween 80 (89,5: 10: 0,5)]; e veículo # 11 [salina: álcool benzílico: carboximetilcelulose: Tween 80 (98,2: 0,9: 0,5: 0,4)]. Os oito veículos que produzem o melhor solubilidade RM-133 (# 1-8) foram injectados s.c. (0,1 ml) sem o composto de teste (RM-133) para estudos de tolerância e de avaliação comportamental, os ratinhos por observação a 0,25, 1, 3, 7, 23, 26, 28, 30, e 96 h pós-injecção. Finalmente, RM-133 foi injectado por via s.c. uma vez a 120 mg /kg /0.1 ml dos melhores veículos tolerados sete (# 1,2,4-7) em ♀ ratinhos Balb /c (4 por grupo) e os ratinhos foram monitorizados ao lado com recolha de sangue por punção cardíaca após três e 12 h. A concentração plasmática de RM-133 foi então determinada por LC-MS /MS como acima.

efeito de repetidas s.c. injecções de RM-133 usando 3 Veículos para

camundongos Ten ♀ Balb /c pesando aproximadamente 23 g foram divididos em 3 grupos. Grupo 1 (3 ratinhos) foi tratada s.c. com RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, duas vezes por dia (AM e PM), a cada dois dias) em metilcelulose aquosa a 0,4%: EtOH (92: 8). Grupo 2 (murganhos 3) foi tratada s.c. com RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml, duas vezes por dia (AM e PM), a cada dois dias) em óleo de girassol: EtOH (92: 8). Grupo 3 (4 ratinhos) recebeu apenas uma injecção de RM-133 (120 mg /kg /0.1 ml) em solução aquosa de 25% β-ciclodextrina: EtOH (92: 8) e foram sacrificados 24 horas mais tarde. Os ratos nos grupos 1 e 2 receberam um total de 8 injecções durante 4 dias e foram sacrificados no dia 8. comportamento ratos foi monitorada durante toda a duração do experimento e observação macroscópica de órgãos foi realizada após necropsia.

efeito da RM-133 sobre OVCAR-3 xenoenxertos utilizando os dois veículos seleccionados

Fourty ♀

nu /nu

ratos pelados (22-24 g) foram inoculados com 5 × 10

6 OVCAR-3 células por flanco, em meio de cultura contendo matrigel a 30% (0,1 mL). Após 23 dias, os ratinhos portadores de tumor foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 8-9 ratinhos cada. Grupo 1 (12 tumores) foi tratada s.c. com RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, uma vez que (AM) a cada dois dias) em óleo de girassol: EtOH (92: 8), e o grupo 2 (13 tumores) foi tratada s.c. com RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, duas vezes por dia (AM e PM), a cada dois dias) em metilcelulose aquosa a 0,4%: EtOH (92: 8). Dois grupos de rato de controlo, cada uma representando 12 tumores, recebeu apenas os veículos. Como mencionado acima, a área do tumor foi medido duas vezes por semana e peso corporal monitorado.

Efeito da RM-133 sobre PANC-1 xenotransplantes

Vinte feminino

nu /nu

nu os ratinhos (22-24 g) foram inoculados com 5 × 10

6 células PANC-1 por flanco, em meio de cultura contendo matrigel a 30% (0,1 mL). Dez dias após a inoculação, os ratinhos portadores de tumor foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos de 10 ratinhos cada. Os ratos do primeiro grupo (

n

= 16 tumores) foram tratados s.c. com RM-133 (240 mg /kg, duas vezes por dia (AM e PM), a cada dois dias) em 0,2 ml de metilcelulose aquosa a 0,4%: EtOH (92: 8). Os ratos do segundo grupo (controlo) (

n

= 18 tumores) recebeu apenas o veículo. Tal como acontece com xenotransplantes anteriores, a área do tumor foi medida e peso corporal do rato monitorado.

Síntese e preparação de RM-133

O aminoesteróide RM-133 (2β- [1- (quinolina-2 carbonil) -pirrolidina-2-carbonil]

N-

-piperazina-5α androstano-3α, 17β-diol) foi sintetizado, caracterizado, e purificada como previamente descrito [22]. A pureza de RM-133 verificou-se ser de 99,5% tal como determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (Aparelho: Shimadzu (Kyoto, Japão); Coluna: Altima, HP, C18-AQ, 4,6 x 250 mm, 5 fim; solventes: A gradiente a partir de metanol /água (70:30) a 100% de metanol, detecção no UV a 190 nm). Para

In vivo

tratamentos, RM-133 foi suspenso no veículo, um dia antes da sua injecção em ratinhos e armazenado a 4 ° C sob agitação constante até ser utilizada.

Estatísticas

O teste de Duncan-Kramer foi usado para analisar dados e significância estatística aceitos em

P Art 0,05 [36].

Resultados e Discussão

RM-133 é citotóxico em direção OVCAR-3 humana e células PANC-1

Para avaliar o efeito da RM-133 sobre a proliferação de células OVCAR-3 e PANC-1 de cancro, estes foram incubados com concentrações crescentes de RM-133 durante 72 h, e o IC

50 do fármaco, em seguida, medidos. RM-133 tinha claramente uma actividade antiproliferativa sobre as linhas de células testadas, com IC

50 valores de 0,8 e 0,3 uM para OVCAR-3 e PANC-1, respectivamente (Figura 2). O IC

50 valores no intervalo 0,1-1 mM aqui obtidos foram similares aos descritos na medida em um painel de linhas celulares de cancro humano com esta família de aminoesteróides [23].

O IC

50 Os valores foram calculados como 0,8 uM (OVCAR-3) e 0,3 uM (PANC-1). Os dados representam a média ± S.D. As barras de erro são menores do que os símbolos.

A linha celular OVCAR-3 foi derivado de um paciente refractário à quimioterapia citotóxica, e é, por conseguinte, um modelo interessante para investigar a resistência aos medicamentos [25]. O facto de RM-133 exibiram uma actividade antiproliferativa potente em um modelo (OVCAR-3), conhecido pela sua quimiorresistência, bem como em células PANC-1, levou-nos a investigar a

In vivo

actividade de RM- 133 em dois modelos de xenotransplante tumoral utilizando estas duas linhas celulares de cancro.

RM-133 inibe o crescimento de OVCAR-3 xenotransplantes tumorais

ratos nus fêmeas foram inoculadas em ambos os flancos com células OVCAR-3. Os ratinhos portadores de tumores foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: um grupo foi tratado com RM-133 (60 mg /kg) e o outro (controlo) recebeu apenas a substância veicular (propileno glicol: EtOH (92: 8)). Os tumores no grupo de controlo cresceram claramente mais rapidamente do que aqueles tratados com o aminoesteróide (Fig 3A). A partir do dia 15 da terapia medicamentosa e até ao final do período experimental, os tumores tratados com RM-133 tornou-se significativamente menor do que no grupo de controlo, com uma diferença de 60% entre os dois grupos medidos no final do tratamento. Desde o potencial tóxico de um determinado composto depende do seu tempo de concentração e exposição [37], e como a mortalidade, sintomas clínicos e alterações de peso corporal estão entre os principais indicadores da sua toxicidade [38], é de salientar que ao longo de um 21- período de tratamento com o dia RM-133, não houve efeito aparente no peso corporal (Fig 3B), nem toxicidade aparente do fármaco (por exemplo, comportamento anormal, morte).

OVCAR-3 células (5 × 10

6 células misturadas com 30% de matrigel) foram inoculados sc em ambos os flancos de ratinhos. Os ratinhos portadores de um tumor foram injectados por via s.c. uma vez por dia com RM-133 (0 ou 60 mg /kg de peso corporal) em 0,1 ml de propilenoglicol: EtOH (92: 8), durante 21 dias. O tamanho do tumor (A) e o peso corporal de ratinhos (B) foram registados. Os dados representam a média ± SEM. **: Grupo RM-133 tratado é significativamente diferente do controlo (P 0,01)

No final da experiência de xenoenxerto de OVCAR-3, ambos os grupos de controlo e tratados com RM-133 separadamente. receberam uma única sc dose de RM-133 (60 mg /kg). O sangue foi recolhido ao fim de 3, 7, 12, e 24 h, e a concentração do fármaco no plasma medido por LC-MS /MS. O curso de tempo de RM-133 de concentração plasmática foi semelhante nos grupos A e B. A droga exibiu um perfil de libertação de droga clássico [39], com um fornecimento de bolus de RM-133, seguido por uma diminuição prolongada na sua concentração no plasma (Fig 4 ). A concentração plasmática máxima média (460 ng /mL) foi observado 3 horas após a injecção de bolus, e tinha diminuído para 81 ng /mL após 24 h. Estes resultados demonstram que RM-133 não se acumula no sangue durante a experiência de 21 dias-xenoenxerto. Os tumores dos ratinhos tratados com RM-133 também foram recolhidos na necropsia, a fim de medir a quantidade de RM-133. Isto mais tarde esteve presente no interior do tumor, a uma concentração de 1,2 ^ M (773 ng /g), que corresponde aproximadamente à concentração de RM-133, que inibe 50% de OVCAR-3 a proliferação celular (IC

50 = 0,8 uM) . Este resultado está de acordo com a redução de 60% do tamanho do tumor progressão observada na primeira experiência de xenoenxerto de OVCAR-3. Assim, RM-133 não é suficientemente concentrado no interior do tumor para inibir completamente o seu crescimento

RM-133 (60 mg /kg) em 0,1 mL de propileno-glicol:. EtOH (92: 8) foi injectado s.c. em

nu /ratinhos nus nu

. Grupo A: murganhos foram previamente tratados diariamente durante 21 dias com RM-133 a 60 mg /kg; grupo B:. ratinhos não previamente expostos ao fármaco

concentração RM-133 plasma exibe uma dependência logarítmica da quantidade injetada

Em experiências anteriores, RM-133 havia demonstrado uma máxima actividade anti-tumoral de 57% contra o HL60 xenoenxertos [32], o que é comparável ao valor de inibição de 60% medido neste relatório no sentido de OVCAR-3 xenoenxertos. No final da experiência de xenoenxerto de OVCAR-3, a concentração de RM-133 no plasma medida 12 h após uma única injecção de bolus de 60 mg /kg (em 0,1 mL) nos grupos A e B (Figura 4) foi de 178 e 91 ng /mL , respectivamente. Este resultado nos levou a examinar a relação dose-plasma de uma única s.c. injecção de RM-133, utilizando uma gama de diferentes doses do composto. Como se mostra na figura 5, a concentração plasmática (167 ng /ml) atingidos após a injecção de 30 mg /kg, representa apenas 17% da quantidade injectada, e esta percentagem diminuiu ainda mais, com doses mais altas do RM-133. Assim, a tendência de a relação do nível de dose sugere que o aumento da dose de RM-133 conduz a um patamar, provavelmente como resultado da baixa solubilidade do plasma ou da fraca biodisponibilidade de RM-133 no veículo utilizado (propileno glicol: EtOH ( 92: 8)). No entanto, a dose de 480 mg /kg em 0,2 mL de veículo não era tolerada pelos ratos (Figura 5), ​​que se manifestam com desconforto movimento. Seguindo estas observações, o veículo sozinho (0,2 ml de propilenoglicol: EtOH (92: 8)) foi administrada aos ratinhos. Como se esperava, as reacções foram as mesmas nos animais, indicando que o próprio veículo (propilenoglicol: EtOH (92: 8), em 0,2 mL) foi o culpado. O volume máximo tolerado era próxima determinado como 0,1 mL. Estas observações levaram-nos a investigar veículos alternativos que permitam, para se obter RM-133 níveis plasmáticos mais elevados, com efeitos adversos mínimos.

RM-133 foi medida por LC-MS /MS 12 h após uma única s.c. injecção em ratinhos Balb /c, utilizando propileno glicol: EtOH (92: 8) como veículo. O volume de injecção é de 0,1 ml, com excepção para a dose mais alta utilizada (480 mg /kg), em que foram utilizados 0,2 ml. O volume de 0,2 mL, com e sem RM-133, produzido algum desconforto movimento

otimização do veículo:. Rastreio de veículos alternativos para melhor RM-133 administração

solventes não aquosos tais como sulfóxido de dimetilo e polietilenoglicol, detergentes (por exemplo, Tween, óleos vegetais, etc.) e agentes solubilizantes (por exemplo, β-ciclodextrina, metil-celulose) oferecem opções estratégicas para melhorar a solubilidade do composto no processo de descoberta de drogas [30, 39]. Por esta razão, 11 diferentes veículos utilizados anteriormente com derivados de esteróides foram investigados. Em primeiro lugar, com base na solubilidade de RM-133, em cada veículo (Tabela A em Ficheiro S1), foram seleccionados oito veículos para um segundo ciclo de investigação. Nas últimas experiências, os ratinhos receberam uma única s.c. injeção de cada veículo livre de drogas para a tolerância e avaliação comportamental (Tabela B no Arquivo S1). Com base em nossas observações em diferentes momentos após a injecção (0,25-96 h), que eliminou o veículo # 3 (mamona à base de óleo). De facto, após a administração de veículo # 3 por si só, os ratinhos apresentado muitos sintomas de desconforto (comichão, saltar, e microftalmia), e durante os quatro dias seguintes, os ratinhos apresentaram feridas média de ~ 24 mm

2 no local de injecção. sc

Em um terceiro experimento, os sete veículos melhor tolerados contendo RM-133 foram injetados em ratos (120 mg /kg) e as amostras de sangue recolhidas após 3 e 12 horas para RM-133 medição das concentrações de plasma (Tabela 1). A concentração mais elevada no plasma RM-133 alcançado após 3 horas foi obtida com veículo # 6, seguida (segundo esta ordem) pelos veículos # 5, # 2, # 1, # 7, # 4 e # 8. Como esperado, RM-133 de concentração plasmática diminuiu após 12 h, mas veículo # 6 ainda produziram os níveis mais elevados após o último intervalo. Em contraste, veículo # 8 produziu a concentração mais baixa no plasma em ambos os intervalos de tempo. Com base nos resultados obtidos a partir de três experiências acima descritas (Quadros A e B em Ficheiro S1, Quadro 1), concluiu-se que (i) RM-133 era fracamente solúvel no veículo # 5 (pequenas protuberâncias), (ii) que os veículos # 1 e # 7 levou a lesões de pele e do veículo # 8 produziu as menores concentrações plasmáticas do conjunto analisado. Por outro lado, veículo # 6 conduziu às concentrações mais elevadas no plasma do conjunto, ao passo que os veículos # 2 e # 4 não mostram qualquer efeito adverso em ratos. Nós, portanto, selecionada veículos # 2, # 4 e # 6 para executar um teste de tolerância adicional.

Efeito de injecções subcutâneas repetidas de RM-133 em 3 veículos seleccionados (teste de tolerância)

RM-133 foi administrado a ratos a cada dois dias utilizando veículos # 2, # 4 e # 6. Os animais foram tratados durante uma semana com veículos # 2 e # 4, mas apenas uma vez com veículo # 6. comportamento de camundongos foi monitorada durante o experimento e observação macroscópica de órgãos foi realizada a necropsia (Tabela C no arquivo S1). Dez horas seguintes o s.c. injecção da primeira dose de RM-133 (120 mg /kg /0.1 ml) em solução aquosa de 25% β-ciclodextrina: EtOH (92: 8) (veículo # 6), a mobilidade do rato foi consideravelmente reduzido. Vinte e quatro horas mais tarde, seu estado geral tinha deteriorou ainda mais, como pode ser visto com reclusão, desidratação, microftalmia, eriçado, acelerada taxa, e distensão abdominal respirar. Com base nestas observações, nós abruptamente terminada experiência com o veículo nº 6, 24 h após a injecção. Na necropsia, todos os ratos em que grupo mostrou pulmões hemorrágicas, carregado estômagos juntamente com intestinos vazios, e 75% apresentaram rins ligeiramente aumentados. Quando correlacionado com as mortes de rato previamente observado quando da administração de veículo # 6 por si só, estas observações indicaram claramente que o veículo à base de ciclodextrina não foi tolerado por ratos, e do veículo # 6 foi, portanto, eliminado de nossos estudos de rastreio.

Curiosamente , e de acordo com as observações da experiência realizada com veículos só, nenhum efeito adverso foi observado quando os ratinhos foram tratados com RM-133 usando veículos # 2 e # 4. Uma vez que o veículo oleoso # 4 (óleo de girassol: EtOH (92: 8) bolhas geradas no local da injecção, que limitam o tratamento a uma única injecção de RM-133 (240 mg /kg /0,2 mL /todos os outros dias) para o xenoenxerto experimentos no entanto, o veículo aquoso # 2 (solução aquosa de metilcelulose 0,4%: EtOH (92: 8)). autorizados a efectuar múltiplas injecções (240 mg /kg /0.2 ml, bid /todos os outros dias), sem efeito adverso em ratos na necropsia. , órgãos não mostrou qualquer anormalidade detectável. Assim, ambos os veículos # 2 e # 4 foram incluídos para comparação para o

in vivo

estudos sobre RM-133 atividade antitumoral.

a actividade antitumoral de RM -133 OVCAR-3 em xenoenxertos usando dois veículos diferentes

com o veículo à base de girassol (Fig 6A), RM-133 começaram a inibir o crescimento tumoral após 20 dias, mas o efeito tornou-se significativa apenas no dia 28 . no final do tratamento (40 dias), RM-133 teve o crescimento tumoral completamente inibida (isto é, 100%) OVCAR-3. no entanto, a natureza oleosa do veículo # 4 gerados grandes bolhas, que também dificultado medições do tumor. Quando o tratamento RM-133 foi interrompido no dia 40, devido a efeitos induzidos por veículo, o crescimento do tumor é reiniciada e não houve diferença significativa subsistiu entre os dois grupos de sete dias após a cessação do tratamento (Figura 6A). Estes últimos resultados mostram que o aminoesteróide RM-133 foi responsável pela inibição de crescimento do tumor. Não foi observada nenhuma diferença significativa no peso corporal entre os não tratados (controlo) e tratada (RM-133) grupo (Fig 6B). Além disso, nenhum sintoma de toxicidade foi observado quer durante o estudo, ou no momento da necropsia.

OVCAR-3 células (5 × 10

6 células misturadas com 30% de matrigel) foram inoculadas s.c. em ambos os flancos de ratinhos. ratinhos portadores de tumor foram injectados s.c. com RM-133 (240 mg /kg de peso corporal) ou apenas veículo (0.2 ml de óleo de girassol: EtOH (92: 8)) a cada dois dias. O tamanho do tumor (A) e o peso corporal de ratinhos (B) foram registados. Os dados representam a média ± EPM **: grupo tratado com RM-133 é significativamente diferente do controlo (P 0,01). *:. Grupo tratado com RM-133 é significativamente diferente do controlo (P 0,05)

Com o veículo à base de metilcelulose, o crescimento do tumor tornou-se significativamente diferente entre os grupos tratados e controle o mais cedo no dia 15 (Figura 7A), e esta diferença persistiu até ao final do período experimental (dias 35). Na verdade, o tratamento RM-133 eficientemente revogada o rápido crescimento de OVCAR-3 tumores, cuja área superficial foi diminuída pela aminoesteróide. Após 28 dias, RM-133 teve o crescimento tumoral completamente inibida (em 100%), e diminuiu ainda mais o tamanho do tumor a 78% do seu valor inicial, no final do tratamento (35 dias). Após a interrupção do tratamento, RM-133 ainda manteve a sua bloqueio completo da progressão do tumor, pelo menos até 12 dias após o final do tratamento (Figura 7A). Curiosamente, nem comportamento anormal nem a morte foi gravado durante o período de tratamento de 35 dias com o RM-133. Além disso, veículo # 2 não peso corporal (Fig 7B) afetar ou levar a qualquer sintoma de toxicidade evidente durante todo o período experimental, bem como na necropsia.

OVCAR-3 células (5 × 10

6 As células misturadas com 30% de matrigel) foram inoculados sc em ambos os flancos de ratinhos. ratinhos portadores de tumor foram injectados s.c.