Sumário

próstata consiste de células secretoras e uma população de células imaturas. A função de células imaturas e sua relação mútua com células secretoras ainda são pouco conhecidos. células imaturas ou têm uma relação hierárquica de células secretoras (modelo de células-tronco) ou representar uma população inducible emergente com a estimulação adequada de células diferenciadas. Hepatocyte Growth Factor (HGF) do receptor c-Met é expresso especificamente em células da próstata imaturos. O nosso objectivo é o de determinar o papel de células imaturas no cancro da próstata por análise da via de HGF /c-met.

Gene-Perfil de expressão de células de cancro da próstata DU145 estimuladas com HGF revelou a indução de uma assinatura molecular associado a células, caracterizada por aumento da regulação do CD49b, CD49f, CD44 e SOX9-tronco, e para baixo-regulação de CD24 ( “assinatura tronco-like ‘). Confirmou-se a aquisição de um fenótipo de haste semelhante por PCR quantitativa, a análise de FACS e Western blotting. Além disso, o HGF levou à activação da via de Notch relacionada células estaminais por sobre-regulação dos seus ligandos Jagged-1 4. As pequenas moléculas SU11274 e PHA665752 segmentação e actividade semelhante a delta c-Met foram ambos capazes de bloquear os efeitos biológicos e moleculares de HGF. Knock-down de c-MET por infecção shRNA resultou em redução e atraso de ortotópico de tumor formação em ratinhos NMRI machos significativo. A análise imunohistoquímica em prostatectomies revelou enriquecimento significativo de células positivas c-MET na frente invasiva, e demonstrou co-expressão de c-MET com marcadores estaminais-como CD49b e CD49f.

Em conclusão, a ativação do c-MET em células de câncer de próstata induzida um fenótipo tronco-like, indicando uma relação dinâmica entre as células diferenciadas e-tronco como neste malignidade. Sua mediação do tumor-formação eficiente

in vivo

e expressão do receptor predominante na frente invasiva implica que c-MET regula infiltração tumoral nos tecidos circundantes supostamente pela aquisição de um fenótipo tronco-like.

Citation: van Leenders GJLH, Sookhlall R, Teubel WJ, de Ridder CMA, Reneman S, Sacchetti A, et al. (2011) A ativação de c-MET induz uma Stem-Like fenótipo de cancro da próstata humano. PLoS ONE 6 (11): e26753. doi: 10.1371 /journal.pone.0026753

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Janeiro, 2011; Aceito: 03 de outubro de 2011; Publicação: 14 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 van Leenders et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A Holanda Organização para a Investigação e Desenvolvimento em Saúde (ZonMW; conceder 907-00-138; subvenção pessoal com o Dr. van Leenders; https://www.zonmw.nl/); Fundação para a Investigação Científica de Urologia (SUWO); Fundação Adessium; Fundação Zabawas, Países Baixos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

dentro do epitélio da próstata, homeostase dos tecidos é mediado por células estaminais residentes no epitélio glandular basal [1]. Após divisão assimétrica células estaminais dá origem a células-amplificação de trânsito, que estão presentes em ambos basal e epitélio luminal, e que finalmente se diferenciarem em células secretoras luminais. Diversos marcadores membranosas são diferencialmente expressos em caule e células diferenciadas em roedores benigna e no epitélio da próstata humana, incluindo Sca-1

+, α

6-integrina /CD49f

+, α

2-integrina /CD49b

+, CD133

+, CD117

+, CD44

+ e CD24

– [2] – [9]. Combinação desses marcadores pode promover delimitar caule, transit-amplificação e células terminalmente diferenciadas no epitélio normal. Por exemplo, as células-tronco α putativamente express

2β

1-integrina

+ /CD133

+, células-amplificação de trânsito são a

2β

1-integrina

+ /CD133

– e terminais células diferenciadas são a

2β

1-integrina

– /CD133

-. [3], [7]

populações de células com biológica características semelhantes às de células estaminais benignos também foram identificadas em tumores malignos [10] – [13]. No câncer de próstata, α

2β

1-integrina

+ /CD133

+ células possuem potência de auto-renovação e diferenciação multi-direccional

in vitro

[8], [ ,,,0],14]. Além disso, CD44

+ /CD24

– células isoladas de linhas celulares de cancro da próstata demonstram alta de formação de tumor potencial

in vivo

[4]. Apesar da sua aparente variabilidade no potencial clonogénico e de iniciação do tumor, a relação mútua entre as células imaturas e diferenciadas ainda está mal compreendida. Em correspondência com a sua relação em tecidos normais, uma relação estrita entre hierárquica chamados cancro de células estaminais (CSC) e células diferenciadas tem sido postulado [12] – [14]. De acordo com este modelo, a CSC de são progenitores directos e irreversíveis de células diferenciadas. Recentemente, no entanto, foi demonstrado que as células diferenciadas podem adquirir características CSC na mama e cancro do cólon [15], [16]. Particularmente, características fenotípicas e biológicos contribuiu para as células-tronco pode ser obtida, quando as células mais diferenciadas, sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) quer por depressão forçada de E-caderina ou por factores segregados por o micro-ambiente, tais como factor de crescimento de hepatócitos (HGF ) [15], [16]. Desde a sua natureza exacta e relação com outros tipos de células ainda são controversos, nos referimos à população de células exibindo características de células-tronco como células-tronco-like.

HGF e do seu receptor tirosina-cinase c-MET são importantes mediadores da organogênese , a regeneração dos tecidos e cura de feridas [17]. Dentro do epitélio da próstata normal, c-met é expresso especificamente em células basais e luminais atróficas, onde medeia putativamente regeneração das glândulas secretoras danificadas [18], [19]. No cancro da próstata, c-Met está presente em níveis baixos, com uma minoria de células que exibem expressão elevada da proteína [18], [20], [21]. Anteriormente, os outros e que têm demonstrado que a c-Met e o marcador de células basais queratina 5 são co-expressos na mesma população de células no cancro da próstata [14], [18]. Desde a via HGF /c-MET tem uma função reguladora na migração e invasão

in vitro

, sugerimos que esta população de células é especialmente propenso a infiltração nos tecidos circundantes [18], [22].

Pouco se sabe sobre o papel do c-MET em relação às células de câncer de próstata e como-como-tronco

in vitro

estudos sobre células-tronco-como traduzir para o câncer real em pacientes. Neste estudo, foi demonstrado que a activação de c-Met leva à indução de um fenótipo de haste-como no cancro da próstata. Knock-down de c-MET ainda mais fortemente reduzida tumor-formação em ratinhos nus. Finalmente, foi demonstrado que c-met é preferencialmente expresso no perímetro de espécimes de prostatectomia humanos e é co-localizado com os seus alvos a jusante a

6-integrina

2-integrina e α. Estes dados indicam que as células estaminais-como mediar a expansão do tumor na frente invasiva do câncer de próstata.

declaração de Ética Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pelo animal nacional experimento Comissão (DEC; 102-08-01; EUR1396). Todas as amostras de pacientes foram anonimamente utilizado após consentimento informado apropriado e sob aprovação dos ética humana Institutional Review Board (METC; MEC02.0957).

Células e materiais

linha de células de cancro da próstata DU145 e células 293T de rim embrionário humano (HEK) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). DU145 foi mantida a 37 ° C /5% de CO

2 em RPMI 1640 contendo 5% de soro fetal de vitelo (FCS) e penicilina /estreptomicina (P /S) (Lonza, Verviers, Bélgica). Para experiências de estimulação, as células DU145 foram semeadas durante a noite em meio RPMI /FCS. Após 1 dia, o meio foi substituído por 5% de Dextrano a carvão (DCC) tratada RPMI (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Depois de adaptação durante a noite, o HGF (25 ng /ml; Sigma) foi adicionada ao meio de cultura e as células foram colhidas por incubação com EDTA 2 mM (Sigma) durante 20 min. Pequenas moléculas SU11274 (1,0 | iM, Sigma) e PHA665752 (0,1 uM; Calbiochem, Nottingham, Reino Unido). dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) foram usadas para a inibição de c-met

Microarray Analysis

células DU145 foram estimuladas durante 2, 8 e 24 horas com o HGF ou veículo, e o ARN foi isolado utilizando o reagente RNAzol B (Tel-test Inc., Friendswood, EUA). Após o isolamento de ARN com clorofórmio, isopropanol e etanol, o DNA foi digerido usando o kit livre de ADN (Ambion, Huntingdon, Reino Unido). qualidade e quantidade de ARN foi medida usando o RNA 6000 Nano kit em um Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, EUA). foram seleccionados 8,5; As amostras com números a integridade de ARN de valores 30 foram definidos para 30. Para cada ponto de tempo

2log foram calculadas razões entre células o HGF e tratados com veículo. dados de matriz são Miame compatível e foram submetidos a GEO (GSE16659). A ligação a outros bancos de dados foi realizada por meio SRS7; o programa Treeview foi utilizado para gerar HeatMap imagens [23], [24].

Quantitative PCR em tempo real

Quantitative PCR em tempo real foi realizada utilizando Taqman rxn PCR Núcleo Reagentes incluindo MQ, Taq Tampão, MgCl

2, dNTP, Amplitaq G (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foram utilizadas as seguintes sondas: Hs02379687_s1 (CD24); Hs00174139_m1 (CD44); Hs01041017_m1 (CD49f); Hs00165814_m1 (SOX9); Hs00158148_m1 (CD49b). A quantidade de gene alvo foi normalizada para GAPDH (Hs99999905_m1).

Para a análise dos inibidores de c-Met em CD49b, o ARN total foi isolado com o reagente RNAzol B (Tel-Test) de acordo com o protocolo do fabricante. reacção de RT foi realizada com oligo (dT) 12-18 iniciador (Invitrogen, La Jolla, CA). Após a adição de tampão de primeira cadeia, dithithreitol, dNTPs e RNAsin, reacções RT foram iniciadas por MMLV-RT (Invitrogen) e incubou-se durante 1 hora a 37 ° C. PCR quantitativa foi realizada usando-mastermix SYBR verde (Applied Biosystems). CD49b frente 5′-CAG GCA CAC CAA AGA ATT GA-3 ‘, reverso 5′-GAA GAA CCG GAG CTT CCA TA-3′, GAPDH frente 5’-ACT GTG GTC ATG AGT CCT TC-3 ‘, inverta 5’ -CAT GTT CGT CAT GGG TG-3 ‘, e PBGD directo 5′-CAT GTC TGG TAA CAA CGG TG-3′ e inverso 5’-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3 ‘. Os sinais foram analisados ​​pelo sistema ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Quantidade de genes alvo foi determinada usando curvas padrão de diluições em série. Para a determinação de Notch-receptores e ligantes, por RT-PCR foi realizada utilizando os conjuntos de iniciadores e cycli como representado na Tabela S1 a uma temperatura de recozimento de 60 ° C.

A citometria de fluxo e Western blotting

Para a análise de proteínas membranosas 0,5 × 10

6 DU145 células foram incubadas com anticorpo anti-CD49b (1:500; Chemicon, Hampshire, Reino Unido), anti-CD49f (1:10,000; Abcam, Cambridge, UK), anti- CD44-FITC (1:200; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA), anti-CD24-PE (1:10; BD) e anti-CD133-PE (AC133 clone; 1:100; Miltenyibiotec; Bergisch Gladbach, Alemanha ), em 50 ul de PBS /2% de FCS durante 30 minutos. no gelo. Após lavagem, as células foram incubadas com anticorpos secundários marcados com Alexa Fluor 488 (1:500) durante 15 min. Após suspensão em 300 ul de PBS /2% de FCS com Hoechst 33258 (2 ug /ml) para seleccionar para células vivas, a expressão de proteínas foi medida utilizando um FACSAria de fluxo FACSCalibur (BD) equipado com três lasers (407, 488 e 633 nm).

Para a análise de SOX9 e proteínas de c-met, e células de controlo estimuladas foram lisadas em tampão RIPA (10 mM Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% de Triton × 100, 1% desoxicolato, 0,1% de SDS, 5 mM EDTA) inibidores de protease contendo (completo; Roche, Basel, Suíça). As concentrações de proteínas foram medidas utilizando reagentes de proteínas Biorad (Biorad Laboratories, Munchen, Alemanha). 40 ug de proteína total foi carregado num gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para papel de nitrocelulose (Protan, Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha). Após bloqueio em NFDM a 5% /TBST (Protifar, Nutricia, Zoetermeer, Holanda), durante 1 hora, as manchas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com 0,2 ug /ml de anti-SOX9 (clone AF3075; R D, Minneapolis, EUA) ou 1:1,000 c-Met (clone C12; Santa Cruz). Após a lavagem, as manchas foram incubadas com 1:1,000 anti-cabra-HRP ou anti-coelho-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca), durante 1 hora, processada usando BM Chemiluminescence Blotting Substrate (Roche) e quantificada com o programa ImageJ.

ensaios

MTT e adesão celular

5,0 × 10

3 DU145 células foram estimuladas em placas de 96 poços com 25 ng /ml HGF durante 0, 3 e 6 dias. As culturas foram incubadas com Tiazolil brometo de tetrazólio azul (MTT 5 mg /ml; Applichem, Darmstadt, Alemanha) durante 4 horas, após o que o produto metabólico foi suspenso em 100 ul tamponado DMSO e medida a 570 nm com um Bio-Rad leitor 550 de microplacas (Biorad). Para a quantificação da adesão celular, 3,0 × 10

5 estimulada DU145 células foram semeadas em poços de 12 placas revestidas com colagénio I (Becton Dickinson Labware, Bedford, UK). Após aderência, durante 15 min., As placas foram lavadas, incubadas com 1 ml de meio de DCC contendo 5 mg /mL de MTT, e a densidade óptica foi determinada.

infecção Lentivirus

células HEK 293T foram semeadas em placas frascos revestidos com gelatina a 0,1% /PBS e cultivadas até 50-60% de confluência. partículas lentivirais foram produzidos após a transfecção de células 293T HEK com 20 ug de DNA vetor (pLKO.1 shRNA, ID167, clone NM_000245.x-502s1c1; Sigma), juntamente com 15 ug pPAX

2 e 6 mg PMD

2G usando CaPO

4 precipitação, após o que dH

2O, CaCl 2,5 M

2 e de solução salina tamponada com HEPES (pH 7,05) foi adicionado. A mistura de transfecção foi deixado a incubar durante 20-30 min. à temperatura ambiente antes de ter sido adicionado às células HEK 293T. Os sobrenadantes de cultura celular contendo lentivírus shRNA foram recolhidos 24 horas e 48 horas após a transfecção, e passada através de um filtro de 0,45 mícrons. Para determinar a eficiência de transfecção de células HEK 293T foram simultaneamente transfectadas com proteína verde fluorescente (GFP). Mexidos shRNA (Sigma) foi utilizado como controlo. DU145 foi, em seguida, infectadas com o vírus recolhido (01:01) durante a noite e os clones infectadas foram seleccionadas por clonagem de diluição.

injecção ortotópico

1,0 × 10

5 DU145 células foram injectadas no lóbulo dorsolateral de nu /nu Instituto de Pesquisa médica Naval (NMRI) ratos junto macho com 1,0 × 10

6 PRSC fibroblastos da próstata em 20 l de meio RPMI /DCC contendo HGF humano (25 ng /ml) [25]. As injecções foram realizadas com uma agulha de 30G microlance (Becton Dickinson, Alphen a /d Rijn, Holanda) em um Luer tip microlitro 700 seringa (Hamilton, Bonaduz, Switserland) após a incisão abdominal sob anestesia. volume de tumor (TV) foi monitorado a cada semana por ultra-sonografia transretal (EndoSonics Europe BV, Rijswijk, Holanda). Os ratinhos foram sacrificados a uma TV 1,000 milímetro

3 ou após 3-4 meses. A próstata foi histologicamente analisadas em conjunto com os gânglios linfáticos abdominais e os pulmões.

Imunohistoquímica

Imuno-histoquímica para c-MET foi realizada em 94, prostatectomies radicais embebidos em parafina fixadas em formalina (PR). Secções de 4 mm foram desparafinados e reidratadas utilizando xileno e etanol. peroxidase endógena foi extinta e recuperação de antigénio foi realizado durante 15 min. de irradiação microondas (700 W) em Tris-EDTA (pH = 9). As lâminas foram incubadas com anticorpo de coelho anti-humano de c-met (1:100; C12; Santa Cruz) durante a noite a 4 ° C e visualizada usando o sistema EnVision (Dako). Para a quantificação da c-Met, a presença de células fortemente positivas foi marcado no perímetro, arbitrariamente definida como o exterior 2 mM do tumor e em comparação com o centro.

Para estudos de co-localização, 6 N líquida

2 slides RP congelados foram acetona-fixadas e incubadas com anticorpo anti-c-met (1:100), e CD49b de murganho anti-humano (1:100; HAS-3; Abcam) ou de rato anti-humano CD49f (1 :100; Abcam) durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com biogenin suína anti-coelho (1:150; DAKO). Combinada com anti-rato ou um anticorpo anti-rato marcada com Alexa 488 (1:100) durante 30 min, seguido de avidina-Cy3 (1 :100) formação de um complexo durante 30 min. à temperatura ambiente.

Estatísticas

efeitos de crescimento do HGF e inibidores de c-MET foram avaliadas com o estudante de

t

-teste. Expressão imuno-histoquímica de c-MET em RP foi analisada com a Pearson χ

2 de teste. formação de tumor em ratos foram avaliados utilizando ambos os testes, todos usando SPSS versão 15.0 (SPSS Inc, IL, EUA). Um valor-p de dois lados inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Descoberta de HGF /c-MET genes

Anterior RT-PCR e Northern blot análise demonstrou regulamentada que c-met é expresso em linhas celulares de cancro de próstata independente de androgénios DU145 e PC3, mas não em células LNCaP dependente de androgénios [18], [20]. Estimulação de DU145 com HGF resultou na dispersão e migração de células em 2D-cultura (Figura 1A), enquanto brotos estreladas formar em matrizes 3D Matrigel (Figura 1B). Durante a dispersão, as células DU145 obtida uma forma de fuso, em contraste com a sua forma epitelióide normal, enquanto que o crescimento celular foi significativamente inibido em 21% ao fim de 3 dias (P 0,003) e 10% depois de 6 dias (p = 0,024) (Figura 1C). Embora PC3 possui proteína-MET c, a estimulação HGF não induziu alterações morfológicas (observações não publicadas) putativamente devido à sua falta de um complexo funcional α-catenina /caderina-E [26].

A

, HGF induziu transformação de grupos de células epitelióides no sentido células fusiformes individuais na cultura 2-dimensional.

B

, em 3-dimensional brotos Matrigel originado de nódulos celulares compactos após a estimulação HGF.

C

, a proliferação celular é inibida por 21% (p 0,003) após 3 dias e 10% (p = 0,024) após 6 dias de estimulação de HGF (controlo

barras pretas

-; HGF

barras cinza

+).

A

,

B

Original ampliação de 40 vezes.

Para explorar as vias moleculares relevantes para a função de c-MET no câncer de próstata, foi realizada a análise de expressão microarray células DU145 estimuladas com HGF. Os genes foram seleccionados com base em um de dois ou dobrar-se a sub-regulação por, pelo menos, uma sonda definido no ponto de tempo das 24 horas “e a expressão média com uma diferença de dobragem 1,41. No total, 371 genes cumpriu esses critérios, dos quais 238 foram para cima e 133 sub-regulada por HGF (Tabela S2); os genes top 20 para cima e para baixo-regulados estão representados na Figura 2A.

A

, Top 20 para cima e para baixo-regulamentado genes após a estimulação HGF por 24 horas, combinada com respectivo gene perfis -expression após a estimulação para 2 e 8 horas. .

B

, Efeito do HGF em genes associados com o fenótipo de células-tronco de próstata

Nós descobrimos que vários marcadores membranosas utilizados para a seleção de células-tronco foram reforçadas após 24 horas: α

2-integrina /CD49b, α

6-integrina /CD49f e CD44, enquanto CD24 foi regulada negativamente (Figura 2B). O factor de transcrição SOX9 também foi induzida por HGF. SOX9 é necessário para a diferenciação precoce do epitélio da próstata durante a embriogênese e é reactivado na carcinogênese da próstata implicando uma função relevante na próstata células imaturas [27]. Expressão de dois outros marcadores putativo de células-tronco da próstata CD133 e LGR5 estava abaixo dos limites de detecção [14], [28].

genes Validação de fenotípica estaminais-como a indução de células

Regulamento de célula-tronco associadas pelo HGF /c-MET pathway foi validado em três experimentos DU145 independentes, utilizando PCR quantitativa. Um efeito regulador do HGF foi demonstrada para todos os genes seleccionados (figura 3). Após 24 horas de estimulação de CD24 (0,4 vezes) foi regulada para baixo, enquanto CD49b (2,6 vezes), CD49f (2,0 vezes), CD44 (1,8 vezes) e SOX9 (2,9 vezes) foram todos melhorada. Subsequentemente, a análise de FACS confirmou a regulação positiva de proteínas membranosas CD49b, CD49f, CD44, CD24 e supressão da (Figura 4A). Os efeitos sobre a expressão da proteína foram mais proeminentes para CD49b com um aumento geral de 240%. expressão membranosa de CD49f e CD44 foi apenas ligeiramente melhorada após estimulação de HGF (22% e 26%, respectivamente.). Desde SOX9 está localizada no núcleo, foi realizada análise de Western blot para confirmar sua regulação por HGF. Como esperado, a expressão da proteína SOX9 foi fortemente induzido em células DU145 estimulados até 521% após 24 horas (Figura 4B).

Quantitative real-time PCR confirmou a indução de CD49b, CD49f, CD44 e SOX9 ARNm, juntamente com a infra-regulação de CD24.

A

, FACS demonstrou-regulação de CD49b (240%), CD49f (22%), CD44 (26%), em conjunto com a sub-regulação de CD24 (-69%), após a estimulação de HGF. linha cinza fina representa marcação com anticorpo secundário somente (controle negativo), fino DU145 linha preta sem HGF, e linha preta grossa DU145 com HGF.

B

, Western blot mostrou aumento da expressão de SOX9 após estimulação de HGF a partir de 2 a 24 horas.

C

, FACS demonstrou indução de duplo rotulado CD44

+ /CD24

– células DU145 (controlo de 8%

contra

HGF 26%)

.

Ambos CD44

+ /CD24

– e α

2β

1-integrina

+ /CD133

+ perfis seleccionar as células-tronco como no câncer de próstata [4] , [14]. Após a estimulação de HGF, o CD44

+ /CD24

– população foi enriquecida 3,25 vezes (de 8% a 26%) combinada com uma redução de 0,8 vezes (de 91% a 73%) de CD44 mais madura

+ /CD24

+ células (Figura 4C). A seleção para α

2β

1-integrina

+ /CD133

+ células é muitas vezes perseguido em primeiro lugar pela adesão a curto prazo para o colagénio I matriz, que seleciona para células de alta-integrina expressão [3] . Para verificar se a activação de c-met aumenta a fracção de prender rapidamente as células imaturas, que quantificado adesão ao colagénio I, após 15 min. Dentro deste período, 0,037% (média; DP 0,006%) de células de controlo ligados ao colagénio I. activação HGF de células DU145 significativamente (p 0,01) enriquecida para células aderir rapidamente (média 0,055%; SD 0,011%). Com a análise de FACS, CD133 expressão em DU145 foi abaixo dos limites de detecção e não foi afectada por estimulação de HGF (dados não mostrados).

HGF activa via de Notch

sinalização Notch desempenha um papel importante no desenvolvimento da próstata e tem sido implicada na função de CSC [29] – [31]. Análise do perfil de expressão genética demonstrada a sobre-expressão (3,0 x) do alvo a jusante Notch HES-1 após estimulação de HGF. Portanto, nós investigamos os efeitos do HGF sobre os receptores Notch e seus ligantes. Descobrimos que a ativação do c-MET levou a aumento da regulação de ligantes Notch Jagged-1 e Delta-like (DLL) 4 (Figura 5). O ligando Jagged-2, receptores Notch-2 e Notch-3 não foram afectadas, ao passo que o receptor Notch-1 foi regulada negativamente por estimulação de HGF (dados não mostrados), o que implica que a activação de Notch resultaram da sobre-expressão de ligandos Jagged-1 e dll-4.

estimulação HGF levou à sobre-expressão de Notch ligantes Jagged-1 e dll-4 RNA, eo alvo Notch down-stream HES-1.

Inibidores do desenvolvimento do bloco c-MET do fenótipo tronco-like.

Reconhecimento de células imaturas em malignidades humanas desenvolvimento de agentes farmacêuticos específicos visando esta população biologicamente importante iniciadas. As pequenas moléculas SU11274 e PHA665752, que tanto inibem a actividade enzimática de c-met bloqueou completamente espalhamento de células em cultura e formação de brotos estreladas em Matrigel (dados não mostrados), [33] [32]. redução do crescimento de HGF foi significativamente mediada revertido para o nível da linha de base (p 0,001) pela PHA665752, mas não por SU11274 (p = 0,186) (Figura 6A). SU11274 (p 0,001) e PHA665752 (p = 0,016) significativamente invertida tanto a indução de CD49b (Figura 6B), bem como a inibição do CD24 (ambos p 0,001) no prazo de 24 horas (Figura 6c). Porque HGF apenas níveis CD49f e CD44 moderadamente afetados, não avaliamos os efeitos farmacológicos sobre estes marcadores.

A

, a proliferação celular é inibida por SU11274 tanto controle (

barras pretas

-) e HGF células estimuladas (

barras cinzentas

+), de modo que não inverteu o HGF de redução de crescimento mediado (p = 0,186). PHA665752 não afectou a proliferação celular em células de controlo, e bloqueado de HGF a inibição do crescimento induzida por (p 0,001).

B

,

C

, Ambos SU11274 e PHA665752 bloqueada HGF indução mediada de CD49b (

B

) e inibição do CD24 (

C

). Os desvios padrão representam três experiências independentes.

A expressão de c-MET modula tumor-formação eficiente

in vivo

Para analisar o papel do c-MET no tumor -Formação

in vivo

, nós infectado DU145 células com lentivírus expressando alvo receptor c-MET shRNA e selecionou três c-Met clones negativos (Figura 7a). Os clones DU145 negativas c-Met tinham morfologia semelhante à da linha parental, quando cultivadas em cultura 2D ou 3D, mas não reagiu à de HGF por espalhamento ou a formação de brotos estreladas (dados não mostrados). ortotópico de injecção parental DU145 resultou em 90% (9/10) a formação de tumores; estes ratos foram sacrificados com uma televisão de 1357 mm

3 (média; gama 1016-1860 mm

3) após 42,6 dias (média, variando 38-52 dias). As células de controlo infectadas com DU145 shRNA mexidos levou à formação de tumores em 100% (5/5). Estes ratos foram todos sacrificados devido à grande televisão após 59 dias (média, variando 52-66 dias) (Figura 7b). redução significativa da formação do tumor ocorreu nos clones DU145 com silenciados c-MET. No total, 55% (11/20) dos clones (6/10 Sh167 # 14, # 5 Sh167 3/5 e 2/5 Sh167 # 6) deu origem a tumores, dos quais apenas um foi sacrificado devido à grande TV ( 1013 mm

3; 81 dias). Quinze ratos foram sacrificados aos 119 dias (média, variando 109-124 dias), dos quais 6 tinham tumores pequenos (média de TV 477 mm

3; gama 137-788 mm

3). Quatro ratos morreram prematura entre 52 a 102 dias, todos os pequenos tumores que mostram (TV significa 225 mm

3; gama 137-304 mm

3) (Figura 7C). Em nenhuma das metástases ratinhos foram observados. Tomados em conjunto, funcional c-Met mediado por formação de tumores eficiente em DU145 parental (p 0,02) e resultou em tumores significativamente maiores nas células de controlo DU145 (p 0,001).

Um

, Três Os clones DU145 (5, 6, 14) de baixo para a expressão da proteína de c-met negativo (Western blot) foram gerados pela infecção estável shRNA.

B

, injeção ortotópico de 1,0 × 10

5 DU145 com funcional c-MET levou a tumor-formação eficiente em 9/10 parentais (

preto

) e 5/5 DU145 controle células (

verde) infectado com RNA mexidos.

C

, tumor-formação Ortotópico foi significativamente reduzida em DU145 com baixa expressão de c-MET. Um total de 6/10 DU145Sh167 # 14 (

black

), 3/5 DU145Sh167 # 5 (

verde

) e 2/5 DU145Sh167 # 6 (

vermelho e) injecções do tumor resultou em-formação. Apenas um tumor atingiu uma televisão de 1000 mm

3 durante o período de estudo de 52-124 dias.

As células que expressam c-MET estão localizados na frente invasiva do câncer de próstata.

as células tumorais com alta expressão de c-MET são especificamente enriquecido na frente invasiva do carcinoma colorretal, onde eles medeiam EMT, migração e invasão matriz [34], [35]. Para determinar a expressão de c-MET na frente invasiva do câncer de próstata, comparou-se a presença de células que expressam alta c-MET no perímetro e do centro de espécimes RP bem fixos (N = 94). No geral alta c-MET expressando células (Figura 8A) foram encontrados em 37 casos (39,4%). O perímetro continha mais alta c-MET células que não o centro do tumor em 27 casos (73,0%) expressando. Em 6 casos (16,2%) destas células foram mais abundantes no centro, enquanto que em 4 de RP (10,8%), não houve diferença na expressão (Pearson χ

2; p 0,001). Expressão de c-Met em células basais benignos pré-existentes dentro de toda a corrediça serviu como um controlo interno para excluir artefactos de coloração induzida por fixação. No total, 25 casos revelou a expansão do tumor em tecido de gordura extra-prostática; em 10 zonas de tumor extra-prostático (40,0%) as células que expressam c-Met foram encontrados elevados (Figura 8B).

c-met é altamente expresso em células de cancro da próstata dispersos (

Um

) e, particularmente, em frentes invasoras dentro do tecido adiposo peri-prostático (

B

); As setas indicam células positivas. ampliação original de 100 ×.

Finalmente, os estudos co-expressão foram realizados em amostras de RP para validar c-MET co-expressão com marcadores de células-tronco como em pacientes. colorações de imunofluorescência para c-MET, CD49b e CD49f demonstrou expressão difusa de todos os marcadores em células basais das glândulas pré-existentes. A expressão foi baixo para ausente na grande maioria das células luminais normais e malignas. Receptor de c-MET foi expressa esporadicamente em níveis elevados em células malignas individuais. Estas células co-expressa e CD49b CD49f, indicando que as células positivas de c-met, de facto co-expressar um fenótipo de células estaminais-como no cancro da próstata humana (Figura 9).

imunofluorescência de dupla marcação de c-Met ( Cy3; vermelho) com CD49b ou CD49f (Alexa 488; verde). Co-expressão de c-MET tanto com CD49b e CD49f estava presente em células de câncer de próstata espalhados (

setas

). ampliação original de 100 ×.

Discussão

Pelo menos três populações celulares diferentes podem ser discriminados no câncer de próstata humano. Enquanto as células exócrinas e neuro-endócrino diferenciadas representam os tipos de células predominantes, a prova é crescente de que uma população menor de células imaturas é determinante para o comportamento biológico do câncer de próstata. Analógico para o epitélio da próstata glandular normal, Collins et al. distinto tronco imaturas (α

2β

1-integrina

+ /CD133

+) e células-amplificação de trânsito (α

2β

1-integrina

+ /CD133

-) em amostras de câncer de próstata humanas por capacidade clonogênica, proliferativa e de diferenciação

in vitro

[14]. Embora CD133 é proposto como um marcador geral de células progenitoras do tumor, sua especificidade para as células-tronco tumorais reais ainda está em debate [10] – [12], [14], [36], [37]. No cancro do cólon, por exemplo, foi proposto que o CD44

+ /CD24

– /CD133

– Perfil representa a população de células-tronco tumor, enquanto as células mais diferenciadas CD133

+ em vez de marcas [38