Abstract

receptores olfativos (RUP) são expressos no epitélio olfativo, onde eles detectar odores, mas também em outros tecidos com funções adicionais. Alguns RUP são mesmo sobre-expressos em células tumorais. Neste estudo, identificaram-RUP expressos em células tumorais enterocromafins por RT-PCR, revelando que as células individuais podem co-expressar vários RUP. Alguns dos receptores identificados já foram relatados em outros tumores, mas são órfão (sem ligando conhecido), como é o caso da maioria das centenas de RUP humanos. Assim, os genes que codificam para RUP humanos com ligandos conhecidos foram transfectados para estas células, que expressam RUP heterólogas funcionais. O

in vitro

estimulação destas células pelos agonistas correspondente ou olfativos promoveu a invasão de células de géis de colágeno. Usando células de cancro de próstata LNCaP, a estimulação do PSGR (Prostate Specific proteína G-receptor acoplado), uma sobre-expresso endogenamente OU, por β-ionona, seu agonista odorante, resultou na mesma alteração fenotípica. Também mostrou que o envolvimento de uma cinase PI3 γ via de sinalização dependente nesta promoção da capacidade de invasão de células tumorais desencadeada por estimulação OU. Finalmente, após a inoculação subcutânea de células LNCaP em ratinhos imunodeficientes NSG, a

in vivo

estimulação destas células pelo agonista PSGR β-ionona aumentou significativamente surgimento de metástase e se espalhando

Citation:. Sanz G , Leray I, Dewaele A, J Sobilo, Lerondel S, Bouet S, et al. (2014) Promoção da Invasividade Cancer Cell e Metástase Emergence Causada por Olfativo Receptor Estimulação. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10.1371 /journal.pone.0085110

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril 2013; Aceito: 01 de dezembro de 2013; Publicação: 08 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sanz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo INRA e CNRS (Centro Nacional de pesquisa Científica (França). Esta pesquisa foi realizada no âmbito do eBAM LEA (o Laboratório Europeu Associado (LEA), intitulado “Aplicações Pulsed elétrico Campos em Biologia e Medicina”). a financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

receptores olfactivos (RUP) são receptores acoplados à proteína G expressas principalmente em neurónios olfactivos sensoriais (ORS) do epitélio olfactivo, onde eles detectar e discriminar miríades de odorantes de acordo com um código combinatória na qual um ou pode ser activada por vários odorantes e um odorante pode estimular várias RUP [1], [2]. Além disso, RUP são expressos em tecidos não-olfativos [3] – [5] onde podem desempenhar papéis adicionais. Eles nomeadamente governar a quimiotaxia de esperma, regular a migração e adesão de células musculares, e controlar a secreção de serotonina por células enterocromafins (CE) [6] – [10]. Vários estudos também relataram que algumas RUP pode ser marcador de tumor, um deles modificando

in vitro

a proliferação de células cancerosas da próstata LNCaP [11], [12], [13], [14].

em particular, as células CE pode adquirir um fenótipo tumoral e RUP diferencialmente expressos, dependendo da evolução do carcinoma neuroendócrino [15]. As células do bon, uma linha celular humana CE derivada de uma metástase de um carcinoma pancreático [16], [17], foram descritas para endogenamente expresso RUP [8], que podem ser marcadores tumorais, quando sobre-expressa [15]. Como as células BON foram derivadas de uma metástase, exploramos se a activação de RUP por odorantes agonistas poderiam ter um papel na progressão do tumor. Para este fim, decidiu-se identificar as RUP expressos em células BON. No entanto, os agonistas ou antagonistas odores específicos de BON células RUP são desconhecidos, como para a maioria das centenas de RUP humanos identificados. Nós, portanto, tentou desenvolver um modelo por transfecção destas células com RUP deorphanized. A expressão heteróloga alcançado nos permitiu avaliar a

in vitro

invasão dessas células após estimulação com o ligando odorante do receptor transfectado. Além disso, identificou-quinase PI3 γPI3Kγ como um componente da via de sinalização induzida por estimulação e promoção OU invasividade celular. Um modelo mais fisiológico também foi usada

In vitro

, as células de cancro da próstata LNCaP que expressam em excesso o PSGR (Prostate Specific L receptor acoplado a proteína), e um endógeno deorphanized ou são considerados como um marcador tumoral, e wich foi descrito para inibir a proliferação destas células in

in vitro

[12]. Este modelo foi então utilizado

in vivo

para analisar o papel da estimulação RUP na progressão do tumor, que está no surgimento de metástase e se espalhando.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

os animais foram tratados em conformidade com as orientações do governo francês em relação aos procedimentos operatórios e cuidados com os animais. Protocolo foi aprovado pela civilidade ética para experimentos com animais, denominados “Comité d’Ethique en Experimentação Animal de l’IRCIV” CEEA-26 (número de protocolo 2012-043).

A transcrição reversa (RT)-PCR, clonagem e sequenciação

os ARNs totais foram extraídos utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) e tratado com ADNase I. RT foi realizada com o «SuperScript First-Strand®, Synthesis System para RT-PCR» kit (Invitrogen).

Para uma única célula de RT-PCR, células isoladas foram recolhidas por aspiração para uma pipeta de vidro e de RT foi realizada utilizando os «única célula as células Superscript ™ III de ADNc directa sistema de síntese» kit (Invitrogen), após ruptura das células, a desnaturação das proteínas e tratamento DNAse.

Nested PCR foi realizada a partir de 1 produtos mL de RT e utilizando iniciadores degenerados segmentação ou regiões conservadas, ou primers especificamente segmentação ou identificadas com os iniciadores degenerados. sequências de iniciadores degenerados foram gentilmente cedidas por Stephan Bieri (Givaudan, Suiça). A ausência de ADN genómico foi controlada usando a GAPDH humana ou iniciadores de p-actina de ADNase I ARN-tratado sem transcriptase inversa.

produtos de PCR amplificados com os iniciadores degenerados foram clonados no vector pGEM-T (Promega) e sequenciadas por Beckman Coulter Genomics. Os produtos de PCR amplificados com os iniciadores específicos foram directamente sequenciados (Beckman Coulter Genomics).

Chemicals

odorantes, DMSO e óleo mineral (M3516) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Fluka ou Acros Organics no mais elevado grau de pureza disponível. AS605240 foi comprado de Euromedex (Selleck, S1410) e gallein de TOCRIS Bioscience. Parafina (CellWax) foi obtido a partir de CML, e hemalun, eosina, e Safran de RAL.

vectores de expressão de mamíferos

OR1G1 OR17-40 ou sequências de codificação foram introduzidos na expressão de mamífero pCMV-Tag3B vector (Stratagene) de uma maneira que resulta na fusão de um epitopo cMyc no receptor de N-terminal. Os vetores resultantes foram nomeados pCMV-TagOR1G1 e pCMV-TagOR17-40.

Cultura de células e transfecção

células BON (subclone # 7) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Courtney M. Townsend (Departamento de cirurgia UTMB, Galveston, TX 77551, EUA) [16], [17]. Elas foram cultivadas em DMEM /F-12 (HAM), sem vermelho de fenol (Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Perbio) e antibióticos (100 U de penicilina /ml e 100 ug de estreptomicina /ml, Invitrogen) , a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. As células foram transf ectadas transitoriamente com pCMV-TagOR1G1 ou pCMV-TagOR17-40 usando jetPEI ™ (Polyplus-transfecção) de acordo com as instruções do fabricante. OU expressão na superfície celular foi analisada por microscopia de imunofluorescência usando o anti-cMyc-Cy3 anticorpo monoclonal (C6594, Sigma-Aldrich) em células não-permeabilizadas.

células LNCaP foram adquiridas a partir da ATCC (clone FGC, n . CRL-1740 ™) na passagem 19, e cultivados em meio RPMI 1640 (ATCC, N ° 30-2001) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (ATCC, N ° 30-2021), a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2.

imagem de cálcio

e BON células LNCaP foram semeadas numa placa de cultura de 96 poços (placa negra de microtitulação, Greiner Bio-One), respectivamente, a uma densidade de 10

5 e 0,5 x 10

5 células por poço. 24 horas mais tarde, as células foram carregadas com 2,5 ^ M de fluo-4 éster de acetoximetilo (Molecular Probes), como previamente descrito [18]. Imagem de cálcio foi realizada utilizando um microscópio de epifluorescência invertida (CK40 Olympus), equipado com uma câmera digital (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca

2 + reponses foram observados em 460-490 nm de excitação e ≥ 515 comprimentos de onda de emissão nm. aquisição e análise de dados foi realizada utilizando o software SimplePCI (Hamamatsu, Compix). Fragrância de óleo mineral e foram preparadas extemporaneamente por uma primeira diluição em DMSO e, em seguida, diluições seriadas em solução de sal de Hanks (EUROBIO) suplementado com Hepes 20 mM, pH 7,2. Os estímulos foram testadas a concentrações que não induzem respostas de cálcio nas células transfectadas por simulação. 1? M de isoproterenol (Sigma-Aldrich) foi aplicado como um controlo positivo. O sinal de Ca

2+ foi medida como a alteração relativa da intensidade de fluorescência Af /F = (F-F

0) /F

0, em que F

0 é o nível de fluorescência antes da estimulação. Os resultados foram expressos como a média da Af /F de pelo menos vinte células.

In vitro

avaliação de geles de tipo I a invasão de células

de colagénio foram preparados tal como descrito por de Wever [19]. As células foram cultivadas durante 48 horas antes da semeadura-los como uma suspensão de células individuais depositadas no topo dos géis de colagénio do tipo I. Para estimular RUP, odorantes e óleo mineral foram primeiro diluídos em DMSO e, em seguida, para a solução de colagénio I ou do meio de cultura. Os efeitos de inibidores específicos da PI3K? (AS605240) e subunidades βγ de proteínas G (gallein) também foram avaliados adicionando-os para o gel de colagénio e meio de cultura. Para os controlos, DMSO foi adicionado à mesma concentração final utilizada para diluir estes produtos químicos. A quantidade de DMSO adicionada não excedeu 0,2% e não alterou o número de células invasivas em comparação com os ensaios sem DMSO (dados não mostrados). 24 horas após a sementeira, as células invasoras que apresentam extensões invasivos no gel de colagénio e células não-invasoras foram contados em 10-15 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente. Os resultados foram expressos como a percentagem de células invasoras (índice de invasão). Morerover, citoesqueleto de actina F foi observada usando rodamina faloidina conjugada (Invitrogen). Para este fim, as células foram fixadas durante 20 min com 3% de paraformaldeído em PBS, à temperatura ambiente, em seguida permeabilizadas durante 15 min com 0,5% de Triton X-100 em PBS e bloqueadas durante 30 min com 2% de BSA, 1% de glicina em PBS. As células foram incubadas com rodamina-faloidina (1:300) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente e lavada extensivamente com PBS antes da observação com um microscópio de epifluorescência invertida.

Ratos

Nod Scid Gama ( NSG camundongos machos) foram criados nas instalações de alojamento dos animais do Instituto Gustave Roussy, com livre acesso a comida e água. gaiolas de plástico estavam ligados a racks ventilados controladas. As gaiolas com animais expostos ao β-ionona odorante foram conectados a uma unidade de ventilação separados.

In vivo

Análise da invasão celular e metástase

células LNCaP na passagem 25 foram inoculadas em ratos machos castrados NSG 8 semanas de idade (castração foi realizado duas semanas antes da inoculação das células). 10

6 células foram suspensos em 75 ul de meio RPMI 1640 mais 75 mL de Matrigel (BD Biosciences) e injectado com uma agulha (26 g) no espaço subcutâneo, em 2 locais em cada flanco dos ratinhos. O β-ionona odorante foi primeiro diluído em DMSO a uma concentração de 100 mM e, em seguida, na mistura de RPMI + Matrigel, na concentração final de 100 uM. DMSO foi também adicionado com a mesma dose para a mistura RPMI + Matrigel sem odorante. Um primeiro grupo de cinco ratinhos foi inoculado com células LNCaP (na presença de DMSO) e não recebeu tratamento adicional. Cinco outros ratinhos foram inoculados com células LNCaP (na presença de DMSO) e escovado com óleo mineral três vezes por dia durante 6 semanas e, em seguida, três vezes por semana até ao sacrifício. Um terceiro grupo de cinco ratinhos foi inoculado com células LNCaP na presença de β-ionona em DMSO. Estes ratinhos foram escovados com 1 mM de β-ionona directamente diluído em óleo mineral três vezes por dia durante 6 semanas e, em seguida, três vezes por semana até ao sacrifício. Antes do sacrifício, alguns animais foram primeiramente examinada por tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) usando

99m-MDP, um agente de cintilografia óssea clássico para imagiologia funcional do osso. Esta análise não foi realizada em todos os animais porque parecia menos informativa do que os raios X em nosso estudo. Assim, todos os ratos foram exploradas

in vivo

por tomografia microcomputed (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) para detectar metástases ósseas. 360 projeções de raios X foram coletadas em 1 ° incrementos (100 kVp, 50 mA, 20 exposição ms) por cerca de 5 min tempo de varredura total. As imagens foram reconstruídas em volumes 3D (resolução 50 mm) em um cluster de reconstrução usando um algoritmo conebeam tenda FDK modificado (software de reconstrução GE). dados 3D foram processadas utilizando MicroView (GE Healthcare). A análise dos dados foi realizada pela primeira vez em fatias individuais (axial, coronal, sagital), em seguida, em volumes reconstruídos e imagens MIP (maximum intensity projection). Os animais foram sacrificados quando o tamanho do tumor excedeu 1.500 mm

3. Após a autópsia, tumores e tecidos conhecida por abrigar metástases de tumores de próstata, como gânglios linfáticos, pulmões e espinhas, foram amostrados. Fígados e glândulas Tyson também foram amostrados, alguns fígados aparecendo anómala e alguns Tyson glândulas surpreendentemente grande. Os tecidos foram fixados durante 24 horas em formaldeído, em seguida, armazenados em 70% de etanol a 4 ° C. Para espinhas, descalcificação foi realizada por uma incubação adicional de 10% de EDTA, pH 7,4, a 4 ° C durante uma semana. Todas as amostras foram desidratadas em etanol e incluídos em parafina. As secções em série de 5 uM de espessura foram preparadas e desparafinados em tolueno e re-hidratadas em etanol e em seguida com água. Algumas seções foram coradas com hemalun (RAL), eosina e Safran (coloração HES). A imuno-histoquímica foi realizada em outras secções, utilizando anti-PSGR (LS-A6332, Cliniscience), anti-PSA (ab9537, Abcam), ou soro de coelho como controlo negativo, o Vectastain Elite ABC-peroxidase Kits de IgG de coelho (Cliniscience), e um DAB revelação (SK-4100, Vector).

resultados

RUP endogenamente expressos pelas células BON

uma vez que as células BON exibir uma morfologia heterogénea, nós isolados subclones homogêneos. OR expressão foi investigada por PCR em cDNAs a partir de nove clones usando iniciadores degenerados segmentação ou regiões conservadas e PCR produtos de sequenciação. Detectamos RUP transcritos em seis dos clones (Tabela S1). Entre eles, cinco exibido expressão de mais do que um ou gene ou pseudogene, e o painel de RUP identificados variaram de clone para clone. Para confirmar estes resultados, foi realizada PCR com iniciadores visando especificamente as RUP previamente identificados. Na verdade, todos os nove clones expressos transcritos ORs (Tabela 1) e alguns deles (OR7D2, OR1F1) foram encontradas na maior parte dos clones. Deve-se ressaltar que OR7A17, OR7D2 e OR2A1 transcrições também são encontrados em vários tumores (ESTs listados no banco de dados horda).

Para avaliar ainda que, ao contrário do ORS, as células BON co-expressam várias RUP, analisamos OR expressão ao nível de uma única célula. Conseguimos amplificar os ADNc correspondentes a GAPDH ou β-actina para a maioria das células testadas, mas ou ADNc pode ser amplificada apenas para algumas células, provavelmente devido ao nível muito baixo de ARNm ou ao nível de uma única célula. Nossos dados mostram que algumas células BON individuais que co-expressam mais do que um ou transcrição (Figura S1a).

expressão funcional heteróloga das RUP nas células BON

Uma vez que as células BON RUP endogenamente expressa, nós inferir que eles poderiam também heterólogo expressar RUP funcionais após transfecção do OR1G1 e OR17-40 genes. células BON apareceu para expressar estes receptores heterólogos e expô-los na membrana plasmática (Figura S1b). Também encontrado em células BON a transcrição de REEP1, uma proteína que facilita ou expressão em ORS [20] (Figura s1c). Em seguida, demonstraram que os receptores expressos heterologamente são funcionais, induzindo uma resposta de cálcio quando elas são estimuladas com o respectivo ligando (1-nonanol para OR1G1 helional e para OR17-40 [18], [21]) (Figura 1). A resposta de cálcio induzida por estimulação do receptor OR17-40 é menos pronunciada do que a induzida por estimulação do receptor OR1G1, mas continua a ser significativo. As diferenças entre os níveis ou a resposta pode ser devida a diferentes níveis de expressão dos receptores, a uma eficiência de acoplamento diferente com as proteínas G endógenas de células heterólogas, ou a uma eficácia diferente dos ligantes utilizados. As células transfectadas por simulação não respondeu a nonanol nem helional, mostrando que os odores testados não são agonistas das RUP endogenamente expressos em células BON.

células BON foram transitoriamente transfectadas para expressar OR1G1 ou OR17-40 receptores. 72 h mais tarde, as células foram carregadas com fluo-4 e estimuladas com os respectivos ligandos olfactivos de RUP transfectadas (1-nonanol e helional). respostas de cálcio, devido à interacção entre o OR e seu agonista odorante específica são expressos como a variação média da fluorescência Af /F (%). (círculos abertos), células OR1G1 1-nonanol; (Losangos a cheio), células OR17-40 helional; as barras indicam o desvio padrão (n = 3). As células transfectadas por simulação não respondeu a 1-nonanol nem helional.

OR-induzida aumento da capacidade de invasão das células

Usando células BON heterólogo expressam OR1G1 ou OR17-40 receptores, avaliamos a invasão de colágeno tipo I géis [19] por estas células, estimuladas ou não com os agonistas de odores destes RUP. Na ausência de estimulação odorante, a capacidade de invasão de células BON não foi modificado pela expressão heteróloga de RUP (o índice de invasão permanece em torno de 3%, Figura 2a). estimulação nonanol aumentou significativamente o índice de invasão de células que expressam OR1G1-OR1G1 (células) por um factor de 2,7, enquanto que a estimulação helional aumentou o índice de invasão de células OR17-40 por um factor de 2,5 (Figura 2a). Observou-se que 10

-6 e 10

-7 M de nonanol induziu o mesmo nível de invasão, enquanto que 10

-6 M apareceu mais eficiente em ativar OR1G1 em experimentos com imagens de cálcio. Isto pode ser devido à incapacidade de células para alcançar níveis de BON invasão maiores (cerca de 10% de células invasivas). Nonanol e helional não teve impacto significativo sobre as células de controlo transfectadas por simulação. Nonanol não teve efeito significativo sobre OR17-40 células que expressam, nem helional em células OR1G1 expressar. Além disso, a vanilina, um antagonista do receptor OR1G1 [22], foi capaz de neutralizar especificamente a invasividade induzida por nonanol em OR1G1 células. O índice de invasão de células de controlo estimuladas por si só nonanol ou por uma mistura de vanilina e nonanol foi inalterada (Figura 2a). extensões celulares invasoras em géis de colagénio de tipo I, caracterizando as células invasivas, foram também observados após imunomarcação da cystoskeleton F-actina (Figura 2b). Todos juntos, estes resultados demonstram que,

in vitro,

RUP estimulação por odores podem especificamente promover a capacidade de invasão das OR-expressando células cancerosas.

(a) células BON foram transitoriamente transfectadas para expressar OR1G1 ou OR17-40 receptores ou mock-transfectadas. As células foram semeadas em gel de colágeno tipo I e estimulado pelos respectivos ligantes olfativos de OR1G1 e OR17-40 receptores (nonanol: agonistas OR1G1, vanilina: antagonistas OR1G1, helional: OR17-40 agonistas). células invasivas foram contadas 24 horas mais tarde. Os resultados são apresentados como o Índice de invasão. (B) Modificação do citoesqueleto de actina F de células BON em colágeno tipo I matrizes. F-actina foi revelado pela rodamina faloidina conjugada. extensões invasoras em géis de colagénio que caracterizam células invasivas são indicados por setas. (C) As células LNCaP foram semeadas em géis de colagénio do tipo I e estimulado por ligandos PSGR (β-ionona: agonista, α-ionona: antagonista). células invasivas foram contadas 24 horas mais tarde. Os resultados são apresentados como o Índice de invasão em relação às células de controlo sem estimulação odorante. desvio padrão do controle foi 13,42%. As estatísticas foram realizadas utilizando um teste de Student bilateral e barras indicam o desvio padrão (n = 3).

Nós confirmou este resultado usando as células cancerosas da próstata LNCaP que expressam endogenamente um OR, o PSGR. Este receptor tem agonista conhecido e odorantes antagonistas [12], respectivamente, a β-ionona e α-ionona. Utilizou-se uma concentração de 100 uM de β-ionona para estimular as células LNCaP, uma vez que esta dose já foi relatado para estimular a PSGR [12] e é induzida a mais elevada capacidade de invasão de células de LNCaP em nossas mãos (dados não mostrados). Conforme mostrado na Figura 2c, a estimulação de PSGR com 100 uM β-ionona maior capacidade invasiva de células LNCaP por um factor de 2,75 e este efeito foi totalmente abolida pelo antagonista α-ionona. Sozinho, este antagonista não teve efeito sobre LNCaP nível de células invasão. Embora não haja um controle negativo com células LNCaP que não expressam PSGR, o efeito farmacológico drástica da α-ionone argumenta em favor de um efeito específico de β-ionona através da estimulação PSGR. Exclusão de um efeito químico não específica de β-ionona em células LNCaP induzindo invasividade é também suportada pelo facto de α-ionona, que é muito semelhante à p-ionona e foi aplicada em duas vezes a dose β-ionona, não induzir invasividade de células LNCaP. Além disso, testou-se o efeito de 100 uM β-ionona na invasividade de células PC3, outras células de cancro da próstata que não expressam o PSGR [12], e não foi observado um aumento da capacidade de invasão nestas células. Os resultados experimentais detalhados a seguir também apoiam a ideia de que LNCaP invasão pode ser melhorada através da estimulação PSGR.

Envolvimento de PI3K? na invasão celular induzida pelo RUP

ativação PI3K? através de GPCRs podem estar envolvidos na transformação de funções tais como a invasão [23], e uma interferência entre a sinalização de odor e PI3K? foi descrito em neurônios sensoriais olfativos [24], [25]. Nós exploramos se assim PI3K? Poderia ser parte da via de sinalização, que é desencadeada pela activação odorante de RUP e promove a capacidade de invasão de células. Em primeiro lugar, mostrou a expressão de PI3K? BON em células LNCaP e lisados ​​impuros por immunoblotting com um anticorpo segmentação PI3K? (Dados não mostrados). Em seguida, avaliou a capacidade de invasão de células expressando BON hetorologously OR1G1 ou de LNCaP células após estimulação com agonistas de OR1G1 ou PSGR, na presença de um inibidor específico da PI3K? (AS605240). 10

-6M de AS605240 têm sido relatados para inibir completamente a PI3K? [26]. No que diz respeito células BON, utilizando 10

-6M e 10

-7M de AS605240, encontramos uma igualmente grande (cerca de 80%), mas não a redução total da capacidade de invasão celular promovido pela OR1G1 com a estimulação nonanol (Figura 3), indicando que o efeito máximo é observada a 10

-7M de AS605240. Assim, PI3K? Parece desempenhar um papel importante na mediação da invasividade celular BON promovida pela estimulação ou pela sua odorante específica, mesmo que outras vias de sinalização pode também estar envolvida. Envolvimento da PI3K? Foi confirmada para as células LNCaP (figura 3). No entanto, contrariamente às células BON, PI3K? AS605240 inibidor induziu uma redução da capacidade de invasão LNCaP mesmo na ausência de estimulação PSGR. Portanto PI3K? Parece estar também envolvido na invasividade basal de células LNCaP. Além disso, uma vez que PI3K? Pode ser activada por G

βγ subunidade das proteínas G através da activação de GPCR [27], foram utilizados gallein, um G

βγ subunidades inibidor que interfere com a interacção de L

βγ subunidades com PI3K? [28], e mostrou que contrariado o reforço da capacidade de invasão de células de LNCaP induzida por estimulação PSGR (Figura 3). Este resultado também suporta o envolvimento de PI3K? Na capacidade de invasão das células tumorais induzidas por estimulação OR.

células BON heterólogo expressam o receptor OR1G1 foram semeados em géis de colágeno tipo I e foram estimuladas pela nonanol (agonista OR1G1) na presença de um inibidor de PI3K? específica (AS605240). As células LNCaP foram semeadas em géis de colagénio do tipo I e foram estimuladas por β-ionona (agonista PSGR) na presença de um inibidor específico da PI3K? (AS605240) ou um inibidor de subunidades βγ de proteínas G (gallein). células invasivas foram contadas 24 horas mais tarde. Os resultados são apresentados como o Índice de invasão em relação à das células de controlo (sem odorante nem AS605240 nem gallein). O desvio padrão do controlo foi de 4,74% para as células de controlo BON e 13,86% para as células de controlo de LNCaP. As estatísticas foram realizadas utilizando um teste de Student bilateral e barras indicam o desvio padrão (n = 3).

ou melhoria induzida por ativação de invasão da célula cancerosa

in vivo

Desde

in vitro

reforço da capacidade de invasão celular por ativação RUP sugere um possível papel de (pelo menos alguns) RUP no surgimento de metástases

in vivo

, nós inoculadas as células tumorais da próstata LNCaP subcutaneamente em imunodeficientes NSG (NOD scid gama) camundongos. Os animais foram ou não tratados esquerda, ou diariamente escovado sobre a pele com agonistas PSGR β-ionona diluído em óleo mineral (um excipiente oleoso necessária para aplicar os odorantes lipofílicos sobre a pele ratinhos) ou com óleo mineral como um controlo sozinho. O tamanho do tumor foi medido e foram detectados por metástases

In vivo

imagiologia por imuno-histoquímica e post mortem utilizando anticorpos dirigidos contra PSGR ou PSA (Prostate Specific Antigen) (exemplos da coluna e as metástases pulmonares são apresentados na Figura 4). PSGR expressão foi detectada em tumores primários e em todas as metástases (ver outros exemplos na Figura S2), confirmando que este receptor estava presente e, possivelmente activado durante os experimentos. Sem tratamento, as metástases surgiram principalmente nos gânglios inguinais e occasionnally em coluna e fígado (Figura 4a). Metástases localizadas nos gânglios inguinais estavam bem desenvolvidos, enquanto aqueles localizados na coluna vertebral e fígado foram micrometástases. O número de metástases aumentada após o tratamento com óleo mineral e sua localização foi mais diversificada na presença de β-ionona. Na verdade, as metástases apareceu nos pulmões e glândulas Tyson somente para camundongos tratados com β-ionona (com 3 de 5 animais por glândulas de Tyson e 2 de 5 animais para os pulmões). Além disso, as metástases localizadas nas glândulas Tyson foram altamente desenvolvida, com tamanhos que se aproximam 1.000 mm

3. Nos pulmões, apenas a micrometástases foram detectados, como na coluna vertebral e fígado. Uma vez que os ratinhos não foram sacrificados ao mesmo tempo, mas dependendo do tamanho do tumor, que mostram nas Figuras 5b e 5c a evolução com o tempo do número de metástases de acordo com o número de ratinhos sacrificados e o número médio de metástases por ratinho no momento de sacrificar para cada grupo experimental. Observou-se que os ratos tratados com óleo mineral ou β-ionona teve de ser sacrificado mais cedo, devido ao crescimento do tumor mais rápido, e que eles exibiram um aumento significativo no número de metástases em comparação com ratinhos não tratados. Em paralelo também observado que os tumores desenvolvidos a 85% dos locais inoculados em ratinhos não tratados, enquanto eles eram menos numerosas (50%) em ratinhos tratados óleo mineral ou β-ionona.

metástases são indicados por setas. Na coluna vertebral, as metástases foram observadas através da tomografia microcomputed (projeção de intensidade máxima) e confirmado post-mortem por coloração HES e imuno utilizando anti-PSA (antígeno específico da próstata) e anticorpos anti-PSGR (apenas uma metástase é apresentado). Nos pulmões, as metástases foram caracterizados por HES coloração e imuno utilizando anticorpos anti-PSA e anti-PSGR

(a) O número de metástases observadas em vários tecidos após ratos sacrificam (branco:. Tratada controle ratinhos, cinzentas: ratos tratados com óleo mineral, preto: ratinhos tratados com 1 mM β-ionona em óleo mineral). (B) número cumulativo de metástases, independentemente da sua localização, como uma função do tempo decorrido entre as células LNCaP inoculação e ratinhos sacrificar (branco: ratos de controlo não tratados, cinzento: ratos tratados com óleo mineral, preto: ratos tratados com β 1 mM -ionone em óleo mineral). Os ratos foram sacrificados quando o tamanho do tumor excedeu 1.500 mm

3. O número de ratinhos sacrificados está indicada entre parêntesis para cada ponto de tempo e cada grupo de ratinhos. (C) As curvas de comunicação das proporções do número de metástases sobre o número de ratinhos sacrificados em função do tempo (tracejada preta: ratos de controlo não tratados, cinzento: ratos tratados com óleo mineral, preto: ratinhos tratados com 1 mM de β-ionona em óleo mineral).

os resultados com o óleo mineral foram intrigantes. Desde RUP podem ser ativados por moléculas diferentes [2], [12], [18], investigamos se o óleo mineral pode estimular o PSGR em

in vitro

ensaios de invasão de células e experimentos com imagens de cálcio. O óleo mineral aumentou tanto a invasividade e a resposta cálcico de células LNCaP, e o PSGR antagonistas α-ionona revogada estes efeitos (Figura 6 a, b). Estes resultados demonstram que um componente óleo mineral estimuladas células LNCaP através do PSGR, promovendo a sua capacidade de invasão. Além disso, as células LNCaP invasividade induzida por óleo mineral foi inibida por PI3K? Ou G

inibidores βγ subunidades (respectivamente AS605240 e gallein), demonstrando que a PI3K? Está envolvido neste processo, uma vez que está envolvida na invasividade celular induzida por β-ionona. No entanto, mesmo se o óleo mineral reforçada metástase emergência, metástase ocorrência foi ainda mais pronunciada na presença de β-ionona, resultando em que as células se espalhar para os pulmões e glândulas Tyson que ocorreram apenas na presença de β-ionona. Todos estes dados convergem para demonstrar que a estimulação de um OR, o PSGR, pode contribuir para a disseminação de células tumorais da próstata e na geração de metástases.

(a) as células LNCaP foram semeados em géis de colágeno tipo I e foram estimuladas por óleo mineral ou óleo mineral misturado com 10

-4M β-ionona, 2,10

-4M α-ionona, 10

-7M AS605240 ou 10

-5m gallein. O óleo mineral foi primeiro diluído 1/4 em DMSO (óleo mineral não foi totalmente solubilizado nesta dose, mas este permitiu-nos a esperar uma grande solubilização dos componentes de óleo mineral) e a solução foi então diluída a 1/1000 no meio de cultura ou gel de colagénio I. células invasivas foram contadas 24 horas mais tarde. Os resultados são apresentados como o Índice de invasão em relação à das células de controlo (apenas com o DMSO). As barras indicam o desvio padrão. desvio padrão do controle foi 3,67%.