Abstract

Fundo

A metástase ocorre em uma série de passos discretos que envolvem invasão, angiogênese, linfovascular permeação espaço e estabelecimento de tumores secundários. derrame maligno pleural (MPE), um tipo de metástase de tumor, é geralmente um sinal de mau prognóstico para pacientes com adenocarcinoma pulmonar, embora seu mecanismo subjacente tem recebido menos atenção do que outros tipos de metástases. O objetivo do estudo foi confirmar se as células-tronco cancerosas (CSCs) em MPE contribuir para a “cascata metastática”, através do epitélio -. Mesenquimal (EMT), anoikis, e adaptação no microambiente

Métodos

tecidos e células correspondente blocos pulmonares da MPE amostras de 20 pacientes com adenocarcinoma primário foram analisados ​​por coloração imuno-histoquímica com CSC-representante marcadores (CD133, Nanog, e OCT-4) e marcadores de EMT-associados (e-caderina e vimentina). Correlações entre essas variáveis ​​e parâmetros clínico-patológicos foram analisados. As culturas primárias de oito casos de MPE foram investigadas para caracterizar as propriedades CSC, incluindo a expressão do marcador, a formação de esfera, e diferenciação.

Resultados

As manifestações de marcadores CSC-representativos dos 20 casos de célula MPE blocos foram bastante diverso e variável que varia entre 15% a 90%. expressão mais forte de marcadores CSC-representativos e alteração de marcadores de EMT-associados foram encontrados nas frentes invasivas e em MPEs em comparação com a expressão em tecidos tumorais pulmonares primários. A expressão de outubro-4 em EMA significativamente relacionadas com metástase distante e fase, bem como inversamente correlacionada com a sobrevivência do paciente. As culturas primárias confirmou as propriedades CSC no MPE. Cinco dos oito casos de MPE produziu aglomerados de células adequados, os quais também mostraram expressões variáveis ​​de marcadores CSC, além de esfera formação ea capacidade de diferenciação e metástase.

Conclusão

Este estudo piloto oferece uma melhor compreensão da cascata metastática. O estabelecimento de um modelo de MPE irá fornecer uma visão mais aprofundada do papel das CSCs na metástase e pode explicar as altas taxas de falhas terapêuticas para pacientes com MPE

Citation:. Chen SF, Lin YS, Jao SW, Chang YC, Liu CL, Lin YJ, et ai. (2013) Pulmonar Adenocarcinoma in maligno Derrame pleural Cancer enriquece Stem Cell Properties durante metastático Cascade. PLoS ONE 8 (5): e54659. doi: 10.1371 /journal.pone.0054659

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 12 de junho de 2012; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicado em: 01 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pelo Conselho Nacional de Ciência, República da China, Grant Nos. NSC100-2320-B-016-009 e pelo Hospital Geral Tri-Service, Grant No. TSGH-C101-076. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metástase, a disseminação das células malignas a partir de um tumor primário para órgãos distantes, é a principal causa de fracasso do tratamento e morte em pacientes com cancro [1]. Geralmente, compreende uma série de passos discretos e requer o transporte de células malignas através dos vasos sanguíneos e /ou linfáticos. Além de vasos sanguíneos e linfáticos, o fluido corporal é também um potencial meio de transporte para a metástase do cancro [2]. Envolvimento da membrana serosa do adenocarcinoma pulmonar primária causando derrame pleural maligno inicial (MPE) geralmente indica uma fase tardia de câncer. De acordo com as recentes orientações AJCC [3], MPE é metastático, pode causar desconforto considerável, e reflete um mau prognóstico para o paciente. Os derrames podem oferecer uma única em meio situ para estabelecer um “nicho premetastatic”, e estudar este meio pode nos ajudar a entender como as células cancerosas com propriedades semelhantes a células-tronco em efusões contribuir para a progressão de indivíduo para grupos de células enriquecidas com pulmão metástase avançada câncer [4].

ao reduzir a sua célula-célula ou célula-matriz interações, as células cancerosas entrar nas cavidades serosas, onde se destacaram do tumor pai e tornar-se “sem teto”. Isso desencadeia um fenômeno chamado “anoikis “[5]. As células malignas flutuantes em um estado de anoikis em derrames são pensados ​​para sucumbir a apoptose e a desaparecer. No entanto, na realidade, ocorre o inverso, porque estas células são exclusivamente capazes de proliferar progressivamente apesar do microambiente presumivelmente desfavorável. Isso levanta as questões: “Como podem estas células cancerosas sobrevivem e proliferam para superar a ameaça de anoikis?” E “O mecanismo permite que estas células para adquirir sinais de sobrevivência e, assim, sobreviver e proliferar em uma população tumor flutuando em derrames que não possuem o sólido normais andaimes monofásica? “

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs), principalmente em tumores sólidos, tem sido proposto recentemente. CSCs são também chamados de células iniciadoras de câncer por causa de sua capacidade de auto-renovação, diferenciação multilinhagens, e níveis mais altos de malignidade [6] – [9]. Estudos têm mostrado que os CSCs são resistentes à terapia e parecem ser responsáveis ​​para a recorrência de tumores e metástase [6], [10], [11]. Evidências crescentes mostram que o epitelial – mesenquimal (EMT) está envolvida na progressão do cancro e está estreitamente relacionado com o “stemness” de células cancerosas [12], [13]. EMA pode servir como um reservatório para células tumorais na cavidade pleural, onde eles podem progredir através do EMT, se tornar invasivo novamente, e definir outras metástases [14]. Há também um crescente corpo de evidências sugerindo uma relação entre a EMT, o surgimento de CSCs, e resistência aos medicamentos [15]. MPE parece ser um modelo ideal para o estudo original e a relação entre o EMT e propriedades CSC.

Vários estudos têm sugerido que a supressão de anoikis e o EMT são ligados [16], [17]. No entanto, tem havido poucos relatos sobre a existência de CSCs em derrames. A maioria dos estudos de câncer se espalhar têm-se centrado sobre os mecanismos de metástases via linfática ou as rotas hematog�icas subjacentes. Menos é entendido sobre as associações entre a existência e as propriedades dos CSCs, o EMT, supressão anoikis, eo microambiente do tumor no MPE. O objetivo do presente estudo foi confirmar o possível papel dos CSCs em derrames e para explorar o mecanismo envolvido na propagação de tumores e da relação entre expressão de marcadores EMT-associados e os resultados dos pacientes. Estabelecimento de um modelo de MPE podem fornecer uma melhor compreensão do papel dos CSCs em metástase e as altas taxas de falha terapêutica em pacientes com MPE.

Resultados

A confirmação e identificação de adenocarcinoma no pulmão e derrames pleurais

os tecidos de adenocarcinoma pulmonar primária e os correspondentes MPE blocos de células a partir de 20 pacientes foram selecionados como grupos de estudo. Esses grupos de estudo emparelhados foram submetidos à identificação histopatológico e citológico. A expressão imuno-histoquímica de CK-7 e TTF-1 /CEA foi examinada. CK-7 e TTF-1 pode ser detectada imuno-histoquimicamente em adenocarcinomas mais pulmonares [18]. CEA é de valor para confirmação da presença de um adenocarcinoma e é considerado um melhor alternativa para a diferenciação entre efusões malignas e não-malignas invasivas [19]. Expressão da CK-7 foi detectado em ambos os tumores pulmonares e ninhos de células primária no MPE blocos de células. coloração dupla para TTF-1 /CEA mostrou que TTF-1, cuja coloração nuclear apareceu como uma cor castanha, e CEA, cuja coloração citoplasmática apareceu como uma cor vermelha, coradas uniformemente em tumores primários de pulmão, enquanto que as células CEA-positivas coradas mais forte do que células de TTF-1-positivos em blocos de células MPE fez (Figura 1A).

(a) identificação imuno-histoquímica de células de adenocarcinoma mostraram resultados positivos de CK-7 (setas) tanto em tumor pulmonar primária (ampliação de × 200, ) e ninhos de células no bloco de células de MPE em ampliações inferiores e superiores (a, b) (Ampliação, 40 × e 400 ×); Duplo-coloração de TTF-1 /CEA revelou que TTF-1 (cor castanha, seta cabeças) e CEA (cor vermelha, setas) foram uniformemente positivas coradas no tumor pulmonar primária (c) (Ampliação, 200 ×), enquanto que o CEA (+) células (setas) são coradas mais fortes do que os de TTF-1 (+) células (cabeças de seta) em bloco de células de MPE em menores e maiores ampliações (d). (Ampliação, 40 × e 400 ×). (B) duas vezes coloração da caderina-E /vimentina mostrou que a diminuição da E-caderina (cor marrom, setas) e aumento da vimentina (cor vermelha, cabeças de seta) expressões foram encontradas nas frentes invasivas do tumor pulmonar primária e no bloco de células de MPE. (Ampliação, 200 ×) (C).

expressões de marcadores EMT-associados em tumores primários e derrames pleurais

Um estudo imuno-histoquímico utilizando os marcadores associados a EMT E-caderina e vimentina, mostrou uma variedade de padrões de expressão nos 20 pares de amostras de tecido de tumores primários e MPE blocos de células. Os níveis de expressão foram relacionados para o local em ambos os adenocarcinomas pulmonares primários e os blocos de células MPE. Uma expressão mais elevada de vimentina e uma menor expressão de E-caderina foram encontradas nos ninhos de células invasivas e EMA do que no centro dos tumores primários, indicando que as alterações dos marcadores EMT foram associadas com a invasão local e envolvimento maligno na cavidade pleural (Figura 1B).

Caracterização e distribuição de marcadores de CSC-representativos relacionados com o microambiente

a maioria dos MPE amostras apresentaram imunorreactividade variável para CD133, Nanog, e Oct-4, e combinações de coloração provocada diferentes intensidades e distribuições. Uma expressão relativamente fraca de OCT-4, Nanog, e CD133 sempre foi encontrado no centro dos tumores pulmonares primários. Os níveis de expressão mais fortes de Oct-4, Nanog, e CD133 foram detectados na frente invasiva, situada na interface entre os ninhos de células de tumor e tecido do estroma em adenocarcinomas pulmonar primária, e as margens exteriores dos ninhos de células tumorais na célula MPE blocos (Figura 2A). Independentemente da intensidade expressa em cada um dos casos, todos os 20 casos de MPE eram imunorreactivos mais ou menos para um ou dois ou todos os marcadores de TRÊS CSC-representativos. Em outras palavras, não havia nenhum caso de MPE negativos para todos os marcadores CSC-representativos três anos. Porque Oct-4 foi considerado como o marcador de CSC-representativo mais importante, a percentagem relacionada com Oct-4 expressão presentes em 20 casos de blocos de células MPE foram bastante diversificada variando de 10% a 90%. Devido à heterogeneidade intratumoral, três padrões diferentes de combinação positiva Oct-4 combinado com Nanog positivo ou negativo, as expressões e CD133 foram identificados no EMA (Figura 2B). Quatro grupos foram classificados incluindo três grandes OCT-4 grupos positivos e um grupo negativo OCT-4. Três dos 20 casos de EMA foram positivos para todos os três marcadores no grupo A (20/03, 15%). Cinco dos 20 casos de EMA foram positivos para Oct-4 e CD133, mas foram negativos para Nanog no grupo B (20/05, 25%). Dez dos 20 casos de EMA foram positivos para Oct-4, mas negativa para Nanog e CD133 no grupo C (10/20, 50%). Os dois restantes casos classificados no grupo 4 foram negativos para Oct-4 e Nanog, mas positiva para CD133 (2/20, 10%). Os dados originais e análise estatística de 20 casos de MPE foram apresentados na Tabela S1, Tabelas 1 e 2.

(A) resultados imunohistoquímicos mostraram imunoreatividade de três marcadores CSC-representativos (OCT-4, Nanog, e CD133 ) no centro do tumor primário (a, b C) (ampliação, x 200). imunorreatividade mais forte foi mostrado nas frentes invasivos (d, e f) (Ampliação, 200 ×) e muitos grupos de células de câncer (setas) em MPE no inferior e ampliações (g, h I). (Ampliação, 40 × e 400 ×). (B) a caracterização imunocitoquímica de aglomerados de células cancerosas em MPE mostrou três grandes grupos de combinação (positivo Oct-4, combinado com Nanog positivo ou negativo, e as expressões CD133) foram identificados: Grupo A, positiva para todos os três marcadores CSC-representativos (a, b c); Grupo B, positivo para OCT-4 e CD133, mas negativo para Nanog (d, e f); Grupo C, positiva para Oct-4, mas negativa para Nanog e CD133 (g, h i) a ampliações mais elevadas e mais baixas. (Ampliação, 40 × e 400 ×).

Correlação de imunoexpressão de marcadores CSC-representativos com os parâmetros clínico-patológicos

Análise comparativa entre CSC-representante marcadores usando o sistema de cálculo da pontuação imunorreatividade e os parâmetros clínico-patológicos demonstraram que houve uma significância estatística entre a expressão de OCT-4 e metástases à distância (

p

= 0,0121). Houve também uma significância estatística entre a expressão de OCT-4 e estágio (

p Art 0,0001). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre a expressão de outros parâmetros clínico-patológicos e Oct-4. Não houve significância estatística entre a expressão de Nanog e CD133 e todos os parâmetros clínico-patológicos. Seguindo o ajuste dos parâmetros clínico-patológico, OCT-4 foi também descobriu positivamente correlacionada com o aumento da razão de chances relacionada à metástase (Tabelas 3, 4 e 5). Usando a percentagem de Oct-4 como um preditor de metástases, esta medição foi bastante sensível com elevada especificidade (Figura 3). Outras análises de regressão linear mostrou que immunoexpressions de OCT-4 foram positivamente correlacionados com Ki67 (

r

= 0,470,

p

= 0,036), no entanto, não houve correlações de Nanog e CD133 com Ki67 ( A Figura 4). As expressões de OCT-4 também foram estatisticamente e inversamente correlacionado com a sobrevivência do paciente após um de 60 meses de follow-up usando a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier (Figura 5).

curva ROC (ROC) utilizando o percentagem de Oct-4 como um preditor de metástases demonstrou uma sensibilidade relativamente elevada (66,7%) e uma especificidade absoluta (100%). A área sob a curva ROC foi de 83,8%.

A análise comparativa por meio do teste de regressão linear de CSC-representante marcadores (NANOG, Oct-4, e CD133) com Ki67 mostrou que apenas OCT-4 foi encontrado positivamente correlacionada com Ki67. No entanto, não houve correlação alguma entre as expressões de Nanog e CD133 e Ki67.

A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier depois de um 60 meses de follow-up mostrou que o risco estimado do caso de juros ocorrendo em grupo positivo OCT-4 foi 256% maior do que em 04 de outubro grupo negativo (taxa de risco = 3,56, 95% CI = 1.06~11.95).

apresentação diferente com caracterização de grupos de células enriquecidas de MPE usando ambos os sistemas de cultura não aderentes e convencionais

Oito casos de MPE foram coletados prospectivamente para a cultura primária e seus dados clínico-patológicos foram apresentados na Tabela 6. a principal células de cultura de MPE com sistema de cultura não adesivo descrito em nosso relatório anterior [20] exibido agrupamentos tridimensionais (3-D) com uma morfologia de uva-like (Figura S1). A duração do tempo de duplicação da cultura de células, e morfologia observada variaram consideravelmente entre as amostras. No entanto, a cultura primária de sistema de cultura convencional, utilizando meio isento de soro suplementado com o aumento das doses de bFGF e EGF revelou uma alteração morfológica gradual. As células cancerígenas cultivadas inicialmente aderido à placa, em seguida, dissociados e isolada a partir da placa, e, finalmente, transformado em, agregados esferóides móveis pequenas (esferóides) exibindo uma 3-D e /ou de uva-como morfologia (Figura 6A).

(a), microfotografias de contraste de fase de uma cultura primária de MPE de pacientes com adenocarcinoma pulmonar primária, utilizando meio isento de soro suplementado com o aumento das doses de bFGF e EGF mostrou uma alteração morfológica gradual de células de adenocarcinoma de aderência à chapa transformando em clusters de móveis pequenos e, finalmente, tornar-se nas formas esferóides. (Da esquerda para a direita do painel, ampliação, 200 ×). indução (B) Diferenciação de dois casos representativos demonstraram uma alteração inversa, morfológica transformando o esferóide no MPE em uma arquitetura glandular original com canais luminais. (C) A RT-PCR análise de esferóides em três casos representativos (Processo No. 8, 3 e 7) do MPE mostrou a expressão da OCT-4 e Nanog e genes CD133 foi variavelmente regulada em há casos representativos em pacientes com MPE. (D) Correspondente dados quantitativos demonstraram as comparações entre a expressão da OCT-4 e Nanog e CD133. (E) Análise por imunofluorescência de marcadores CSC-representativas de esferóides demonstrado expressões positivas de OCT-4, Nanog, e CD133, como indicado pelas setas (ampliação, 200 ×).

Caracterização de esferóides para propriedades de CSC, incluindo a formação de esfera, e diferenciação em culturas de células primárias MPE

Amostras de cinco dos oito (62,5%) pacientes MPE usando o sistema de cultura não adesiva produziu formação esfera enriquecido, após cultura durante 7 dias (Tabela 7) . Nós posteriormente recultivadas estes esferóides em placas de cultura de adesivos convencionais para a indução de diferenciação. Os esferóides que consistem de CSCs putativas exibiu a capacidade de diferenciação invertendo o processo acima transformando os cachos de células em 3-D em estruturas bidimensionais com uma morfologia glandular (Figura 6B). Análise por imunofluorescência com identificação morfológica dos marcadores de CSC-representativos de esferóides demonstrou a presença de expressões de Oct-4, Nanog, e CD133 e posterior análise de RT-PCR mostrou que a regulação positiva variável de Oct-4, e Nanog e CD133 expressão do gene em três representativa casos. Foram observados três padrões diferentes de expressão para OCT-4, Nanog, e CD133 (Figuras 6C, D e E). Sete dos oito (87,5%) de agregados de células de cultura primária de EMA foram positivas para os marcadores de CSC-representativas, e só um (12,5%) foi negativo para todos os três marcadores CSC-representativos. expressões mais fortes de OCT-4 foram encontrados quantitativamente do que os de Nanog e CD133 em todos os três casos representativos. Estes dados concordam com os obtidos a partir dos blocos de células.

Discussão

A metástase ocorre geralmente numa série de passos discretos, que pode ser modelado numa cascata metastática [21]. No entanto, o mecanismo subjacente ao envolvimento do tumor na cascata metastática, resultando no derrame maligno em cavidades serosas, tem recebido pouca atenção e, por conseguinte, atraído o interesse de pesquisa. Neste estudo, nós reconfirmou as apresentações de imuno-histoquímica e imunocitoquímicos característicos de cada grupo emparelhado de amostras do mesmo paciente, mostrando as intensidades variáveis ​​e distribuições de CK-7 e TTF-1 expressão /CEA em tecidos adenocarcinoma pulmonar primária e ninhos de células de câncer em blocos de células do derrame. Algumas das amostras foram fortemente imunorreactivo para os marcadores que identificam e alguma imunorreactividade irregular apresentada. Isto pode indicar heterogeneidade intratumoral e pode explicar a resistência potencial terapêutico, bem como a capacidade de invasão e metástase de início para a cavidade pleural. Após os fenómenos precoces da EMT foram iniciadas, incluindo a perda de adesão e de fixação, o aumento da mobilidade e a transformação morfológica, as células do cancro do pulmão primário introduzido na cavidade pleural, levando a MPE [22]. Nosso estudo também demonstrou discrepâncias qualitativas nos níveis de marcadores EMT-associados entre os sítios primários e as lesões metastáticas de expressão. A imunorreatividade dos marcadores associados a EMT representativas, E-caderina e vimentina, variou entre os tecidos de tumor de pulmão primários e os ninhos de células de câncer nas efusões, indicando a presença do fenômeno EMT nos tumores de pulmão e EMA primário durante a progressão do tumor. Além disso, a expressão de vimentina tenderam a ser mais forte e a expressão de E-caderina mais fraca na frente invasiva, a interface entre os tecidos de tumor e de estroma, do que no centro do tumor adequada.

Durante a invasão, e logo após as células tumorais perdem contacto com a membrana basal, eles encontram uma outra barreira para a metástase, anoikis [5], [23]. As células tumorais isoladas, individualmente ou em pequenos grupos, são exclusivamente capazes de proliferar e crescer, apesar de sua localidade presumivelmente desfavorável [24]. As efusões oferecer um nicho premetastatic, que funciona como um reservatório dinâmico que pode fornecer o tecido canceroso através de interacções autócrinos e /ou paracrinos com factores de crescimento. Tais factores de crescimento incluem o factor de crescimento endotelial vascular, factor de crescimento de fibroblastos básico, e transformando β do factor de crescimento e outros estímulos, tais como quimiocinas e citocinas (interleucinas), produzidos principalmente por componentes celulares, incluindo células mesoteliais, algumas células estromais e células inflamatórias [ ,,,0],25] – [28]. À medida que os derrames se acumulam, o microambiente parece crucial para permitir que as células cancerosas para interagir suficientemente com o meio envolvente, por meio de perfusão, em vez de através da arquitectura anatómica do fluxo de sangue [29]. Quando as células cancerosas se envolver em tais microdomínios distintas, eles logo orquestrar as células do estroma ao redor e alterar seus fenótipos para facilitar a progressão do câncer. Portanto, o microambiente das efusões pode acelerar potencial agressivo do tumor, desencadeando dinamicamente as propriedades de CSCs

in situ

. Os fatores ou citocinas na efusão que estão envolvidos na sinalização ou interagir com as células do tumor e como eles cross-talk uns com os outros, a fim de provocar o potencial dos CSCs no MPE são dignos de uma investigação mais aprofundada.

Embora a “semente e do solo hipótese” tem sido desafiado, ele explica como derrames fornecer um microambiente único que pode ser considerado como o “solo” fértil, em estado líquido, esperando para ser “semeados” com células tumorais [30 ], [31]. Como visto em estudos nossa e outras, derrames são microambientes únicos que não só manter as células cancerosas vivas, mas também continuar a sua invasão e promover o seu crescimento. O rápido crescimento de células tumorais e metástases que ocorrem nas efusões pode ser atribuído à presença de uma pequena subpopulação de células cancerosas, a CSCs, que exibem muitas propriedades EMT [31], [32]. A evidência crescente sugere que há uma ligação entre CSCs e do EMT. Se assim for, deve ser determinados oncogenes envolvidos no stemness de células tumorais com capacidade invasiva e o seu potencial de auto-renovação [12], [13], [33]. A capacidade para sobreviver e proliferar requer um nicho adequado, tais como um derrame, o qual é crucial para as células tumorais disseminadas para se estabelecer e se espalhar como um metástase. Para nosso conhecimento, poucos estudos têm relatado a existência de CSCs em derrames. Ainda não existe um marcador específico e simples para as propriedades de CSCs em derrames. Nossos dados demonstram claramente que as taxas de imunorreatividade para os três marcadores CSC-representativos (CD133, NANOG, e OCT-4) variadas, com uma taxa relativamente alta de OCT-4 imunorreactividade. Estes três marcadores relacionados com a CSC foram escolhidos por causa de sua evidência representativa. Superfície CD133, também conhecido como prominin-1, é uma glicoproteína transmembranar de superfície celular que tem sido utilizada na identificação de putativos CSCs em vários tumores malignos, uma vez que eles mostraram um maior potencial tumorigénico em transplante de estudos in

in vitro

e

in vivo

[34] – [36], bem como uma associação com prognósticos pobres e metástases à distância [37], [38]. No entanto, a função exacta da CD133 ainda não foi estabelecida e requer clarificação. OCT-4 e Nanog são os dois fatores de transcrição essenciais para o desenvolvimento de células pluripotentes normal. Nanog é o principal responsável para a diferenciação durante o desenvolvimento embrionário [39], ao passo que OCT-4 pode ter influências de longo prazo em ambos proliferação de tecido e diferenciação [40]. Oct-4 é expressa principalmente em células estaminais embrionárias e as células germinais, e foi detectada em tipos específicos de tumores de células germinativas testiculares [40], [41]. OCT-4 também é expressa preferencialmente no CES indiferenciadas humanos, ilhotas pancreáticas, e cancros gástricos de tipo difuso [42]. Por isso, tem sido sugerido que Oct-4 contribui para a manutenção das propriedades de células estaminais. No entanto, vários relatórios recentes sugeriram que mais de 25% das células de cancro dentro de certos tumores têm as propriedades de CSCs [43]. Com base nos nossos dados, estimámos que as taxas de imunorreactividade para estes três marcadores CSC-representativos (CD133, Nanog, e Oct-4) variar de 15% a 90%, e variações e combinações de sua expressão também foram anotados. Estas taxas de exceder a ocorrência média de CSCs (25%) dentro de certos tumores, especialmente tumores sólidos. Os nossos resultados demonstram que a abundância de CSCs putativos satisfatórios podem ser isolados a partir de EMA com métodos eficazes. Portanto, EMA pode ser utilizado como um modelo de estudo melhor para a pesquisa de células-tronco do que amostras de tecido a partir de certos tipos de cancro. A expressão variável de marcadores de CSC-específico pode também ser modulada por diferentes microambientes, e a mais forte expressão imunologicamente detectáveis ​​destes marcadores três CSC-representativos foi encontrada nas frentes invasivos, tal como visto para os marcadores de EMT-associados. O nosso estudo usando análise de regressão linear demonstrou que apenas a expressão de Oct-4 positivamente correlacionada com a de Ki67 (

R

= 0,470,

P

= 0,036), um excelente marcador para determinar a fracção de crescimento de uma dada população de células e, muitas vezes em correlação com o valor de prognóstico para a sobrevivência e recorrência de tumor (Figura 5) [44], [45]. Além disso, a expressão de OCT-4 também significativamente relacionada com metástases à distância (

p

= 0,0121) e estágio (

p Art 0,0001). A análise de Kaplan-Meier demonstrou a expressão de OCT-4 foi inversamente associado com a sobrevivência em pacientes com MPE depois de um longo prazo de seguimento.

Em termos de estes marcadores de três CSC-representativos, CSCs que expressavam OCT- 4, em vez de CD133 ou Nanog parece desempenhar um papel crucial no seu comportamento de EMA. análises comparativas também revelou discrepâncias na imunorreatividade para estes três marcadores CSC-representativo entre tumores pulmonares primários e ninhos de células de câncer a partir dos blocos de células em derrames. Uma explicação razoável é que os CSCs em ambos os tumores pulmonares primários e derrames pode estar dormente ou parado para um período de tempo antes que se tornem avançada invasivo ou metastático. Na verdade, a expressão de propriedades da célula-tronco variou de acordo com o microambiente (o “nicho de células-tronco”) em que ocorreram [46], [47]. Até agora, a ligação entre CSCs e metástase foi baseado em uma correlação de conjectura, porque não parece uma coincidência que relativamente menos células formadoras de metástase correspondeu igualmente menos CSCs. Estas células têm o potencial para formar um tumor secundário full-blown, com uma arquitectura histológica e heterogeneidade semelhantes aos do tumor primário [48]. tumores pulmonares primários são predominantemente composta de CSCs estacionárias, que geralmente ficam em um estado de dormência ou inatividade. No entanto, quando o tumor se espalha para a cavidade pleural de forma adequada nicho produzir MPE, estes mais imunorreativo ou funcionamento “CSCs migratória” ou “CSCs metastático”, apresentando quer como pequenos aglomerados ou como grupos maiores isoladas de células nas frentes invasivos, não só sobreviver, mas também auto-proliferam em certa medida. Eles podem então invadir os tecidos e vasos adjacentes, e se preparar para migrar para os órgãos distais, onde eles irão desenvolver como outra metástase [32], [49], resultando em um estado canceroso mais avançado e incontrolável Figura S2).

para além da influência da heterogeneidade intratumoral do tumor adequada e os componentes compostos dos factores humorais e celulares do MPE, algumas outras dificuldades e limitações são encontrados quando se isolam células cancerosas do MPE. esferóides tumorais No entanto, nós isolados com êxito /clusters usando dois sistemas de cultivo convencional e não aderentes. Estas estruturas de esferas como 3D-extraídos dos pacientes foram obtidas com alguma dificuldade, mas foram bem preservadas em cultura primária, como foi reportado em outros estudos [50], [51]. Outras análises de imunofluorescência demonstraram que estes esferóides /aglomerados expressa as propriedades de CSCs, coradas positivamente para os três marcadores CSC-representativos (Figura 6E), semelhante aos resultados para os blocos de células. Amostras de cinco dos oito (62,5%) pacientes com MPE rendeu formação esfera enriquecido após o cultivo em sistema de cultivo não adesivo (Figuras S1 e 6A). No entanto, não há esferas poderia ser gerada a partir das amostras de três pacientes, provavelmente reflectindo as diferenças individuais e a interferência complexo dos microambientes de derrames, em adição ao paciente específicos factores, tais como o estado genético do EGFR, o que pode afectar a escolha de tratamentos quimioterápicos.

em conclusão, o estudo atual suporta a nossa perspectiva sobre a cascata metastática. A plataforma dos derrames pleurais podem proporcionar um nicho premetastatic para tumores pulmonares primários antes de seu envolvimento maligno. EMA são preenchidos com células de tumor que apresentam as propriedades de CSCs após as suas interacções com o microambiente. Para o nosso conhecimento, temos pela primeira vez, estabeleceu um modelo do MPE, a partir do qual pode fornecer uma visão sobre os papéis dos CSCs em metástase e em altas taxas de falhas terapêuticas. Isso também pode oferecer uma nova direção para o desenvolvimento pré-clínico de terapias racionais.

Materiais e Métodos

Amostras clínicas coleção

As amostras de tecido de 56 pacientes com adenocarcinoma de pulmão MPE foram recolhidos e recuperados a partir dos arquivos do Departamento de Patologia da Tri-Service general Hospital, Taipei, Taiwan de 2004 a 2009. os 17 casos ou foram perdidos para follow-up ou tinham dados suficientes clínico-patológica para análise e, portanto, foram excluídos. Entre 39 blocos de parafina com MPE, houve 20 casos em pares contendo líquido suficiente preparado para esfregaços satisfatórios e blocos de células que foram escolhidos para ser o material de estudo principal. Casos de espécimes provenientes de biópsias pleurais não foram incluídos quando a citologia pleural foi não-diagnóstico para um MPE suspeita.