Abstract

Os anestésicos locais são freqüentemente usadas em aspirativa por agulha fina de lesões da tireóide e controle loco-regional de cancro da tiróide persistente ou recorrente. Evidências recentes sugerem que os anestésicos locais têm um amplo espectro de efeitos, incluindo a inibição da proliferação das células e indução de apoptose em tipos neuronais e outros de células. Neste estudo, foi demonstrado que o tratamento com lidocaína e bupivacaína resultou numa diminuição da viabilidade celular e formação de colónias, tanto de 8505c e K1 de uma forma dependente da dose. A lidocaína e bupivacaína induzida apoptose e necrose em concentrações elevadas, tal como determinado por citometria de fluxo. A lidocaína e bupivacaína causado perturbação do potencial de membrana mitocondrial e a libertação do citocromo c, acompanhado por activação da caspase 3 e 7, a clivagem de PARP, e a indução de uma maior proporção de Bax /Bcl-2. Baseado em microarray e análise de caminho, a apoptose é a mudança de transcrição proeminente comum a lidocaína e tratamento de bupivacaína. Além disso, lidocaína e bupivacaína atenuada 1/2 actividade regulada por sinal extracelular quinase (ERK1 /2) e induzida por activação da cinase p38 mitogen-activated protein (MAPK) e c-Jun N-terminal quinase. inibidores farmacológicos de MAPK /ERK-quinase e p38 MAPK suprimiu a activação de caspase 3 e clivagem de PARP. Tomados em conjunto, os nossos resultados para o primeiro tempo demonstrar os efeitos citotóxicos de anestésicos locais na célula cancerosa e implicam as vias de MAPK, como um mecanismo importante. Nossas descobertas têm relevância clínica potencial que o uso de anestésicos locais podem conferir benefícios não reconhecidos anteriormente no tratamento de pacientes com câncer de tireóide

Citation:. Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Hu MC, Cheng SP (2014) Anestésicos locais induzir a apoptose em células de cancro da tiróide humana através da proteína Mitógeno-quinase ativada Caminho. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10.1371 /journal.pone.0089563

editor: Yong Jiang, Southern Medical University, China

Recebido: 25 Setembro, 2013; Aceito: 22 de janeiro de 2014; Publicação: 21 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC 100-2314-B-195-001-MY3) e de Mackay Memorial Hospital (MMH-10206 e MMH-e-101-10). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de tireóide é o mais comum de todos os cânceres do sistema endócrino, ea incidência de cancro da tiróide está a aumentar em todo o mundo [1], [2]. A maioria dos cancros da tiróide são bem diferenciados com carcinoma papilífero e folicular sendo os tipos mais comuns. Embora o câncer de tireóide bem diferenciado tem um prognóstico geralmente favorável, as taxas globais de recorrência pode ser tão alta quanto 35% [3]. doença persistente ou recorrente ocorre em grande parte no pescoço. Além disso, o desenvolvimento de recorrência é associado com uma mortalidade mais elevada. as taxas de mortalidade por câncer de trinta anos foram relatados para ser cerca de 12% em pacientes com recidiva local e 43% naqueles com recorrência à distância [3].

As opções de tratamento para a doença persistente ou recorrente incluem cirurgia adicional e iodo radioativo terapia. esvaziamento cervical compartimental de recorrência loco-regional é recomendado pelas diretrizes da American Thyroid Association [4]. Outra alternativa de tratamento com resultados promissores é a injeção percutânea de etanol guiada por ultra-som e ablação por radiofrequência [5] – [7]. Durante o procedimento, a infiltração de lidocaína ao local da punção e tecidos moles em torno do tumor recorrente é um método simples e eficaz de controle da dor [8]. Não ocorreram efeitos adversos relatados, excepto que para a qualidade da imagem de ultra-som pode ser comprometida com uma grande quantidade de lidocaína [7].

Para além da acção bem estabelecida da analgesia e antiarrhythmia, estudos têm demonstrado que os anestésicos locais têm uma amplo espectro de efeitos, incluindo propriedades anti-inflamatórias e anti-microbianos [9]. Observações recentes de sua chamada chondrotoxicity de cautela no uso clínico de injecções intra-articular [10]. Além disso, há evidências crescentes de que os anestésicos locais pode exercer acções benéficas no tratamento do cancro através da inibição da proliferação celular, invasão, migração e [11] – [13]. Estes efeitos parecem não relacionado com a sua modulação de canais de sódio [14]. A este respeito, temos mostrado que a apoptose desempenha um papel importante na toxicidade local induzida por anestésico celular de células de cancro da mama [15]. Estudos anteriores sugerem que a apoptose neuronal induzida por anestésicos locais é mediada, pelo menos em parte, por activada por mitogénio proteína quinase (MAPK) [16], [17]. No entanto, pouco se sabe se mecanismos semelhantes aplicam-se a citotoxicidade induzida por anestesia local em células cancerosas.

Dado que os anestésicos locais são freqüentemente usadas em aspirativa por agulha fina de lesões da tireóide e controle loco-regional de cancro da tiróide persistente ou recorrente, seria interessante para descobrir se os anestésicos locais têm um efeito anti-proliferativa em células de câncer de tireóide. Nós relatamos aqui que comumente usados ​​anestésicos locais, lidocaína e bupivacaína, o crescimento celular inibido e induziu apoptose de células de câncer de tireóide humanos em concentrações clinicamente relevantes. Além disso, de acordo com estudos anteriores e nossa análise microarray e caminho, observamos que vias de sinalização MAPK estavam envolvidos.

Resultados

A inibição do crescimento celular e formação de colónias por anestésicos locais

a viabilidade celular das células cancerosas e 8505c tiróide K1 foi determinada por incubação com lidocaína e bupivacaína a concentrações diluídas em série para 24 e 48 horas. A lidocaína e bupivacaína inibiu o crescimento de ambas as células de cancro da tiróide de uma forma dependente da dose (Fig. 1A). Às 24 horas, a dose eficaz mediana (ED50) de lidocaína foi de 7,3 mM para as células 8505c e 6,8 mm para K1 células, respectivamente. Estes eram mais baixos do que a concentração utilizada de 1% (w /v) de lidocaína (42,67 mM). Da mesma forma, a DE50 em 24 horas de bupivacaína foi de 3,1 mM para as células 8505c e 1,3 mM para as células K1. Ambos eram muito mais baixos do que a concentração clínica de 0,5% (w /v) de bupivacaína (17,34 mM).

(A) As células K1 8505c e foram tratados com diluições em série de lidocaína e bupivacaína, individualmente ou em combinações, durante 24 e 48 h. As barras de erro representam o erro padrão da média. (B) Um isobolograma conservadora demonstra que a lidocaína e bupivacaína actua de forma antagonista para inibir o crescimento celular de células de cancro da tiróide. ED indica dose eficaz. O ED50 (vermelho X), ED75 (cruzes verdes) e ED90 (círculos azuis) são representados graficamente. (C) O tratamento com lidocaína e bupivacaína resultou na redução da formação de colónias da 8505c e linhas celulares K1. As barras de erro representam o erro padrão da média. *, P 0,01

contra

controle

Para examinar se o efeito citotóxico é restrito a do tipo amida anestésicos locais, as células cancerosas da tireóide também foram tratados com um tipo de éster local. anestésicos, procaína. O ED 50 foi de 39,6 mM e 30,9 mM, respectivamente, sugerindo que o efeito correlacionado com a potência, mas não da classe, de anestésicos locais. Além disso, para excluir a possibilidade de que mudanças no pH ou da pressão osmótica explicaria os efeitos citotóxicos, pH ea pressão osmótica do meio de cultura para experimentos foram determinados. Não houve variações significativas no pH ou da pressão osmótica (Fig. S1), indicando que os efeitos observados foram de natureza farmacológica.

sinergia fármaco foi determinada pelo índice de combinação (IC) e analisa isobolograma de acordo com o efeito mediano métodos (Fig. 1B). A CI foi de 1,17 ± 0,03 para as células 8505c e 1,14 ± 0,06 para as células K1. Estes resultados sugerem que a combinação de lidocaína e bupivacaína produziu ligeiro antagonismo.

Além disso, os efeitos dos anestésicos locais sobre o crescimento de células de tumor foram determinados pelo ensaio clonogénico. Os resultados são mostrados na figura. 1C. Uma redução dependente da dose significativa em colónias foi observada em células 8505c e K1. células de cancro da tiróide não formaram colónias após o tratamento com lidocaína 4 mm ou bupivacaína . 0,8 mM

A indução da apoptose por anestésicos locais

Para determinar a base da viabilidade celular reduzida, célula análise do ciclo foi realizada. Não houve interrupção do ciclo celular em células de cancro da tiróide tratadas com lidocaína e bupivacaína durante 6, 24, e 48 horas (dados não mostrados). No entanto, observou-se um aumento dependente da dose na fracção sub-G1 (hipodiploidia) após o tratamento com lidocaína e bupivacaína (Fig. 2A). Nós também utilizado anexina V /iodeto de propídio (PI) coloração dupla para mais uma confirmação da apoptose induzida por anestésicos locais em células de cancro da tiróide. Como mostrado na Fig. 2B, o tratamento com lidocaína e bupivacaína resultou em apoptose de um modo dependente da dose. Necrose também foi observada em altas concentrações de lidocaína e da bupivacaína. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a supressão do crescimento por anestésicos locais em células de cancro da tiróide envolve a indução de apoptose.

(A) As células K1 8505c e foram tratadas com as concentrações indicadas de lidocaína e bupivacaína durante 24 h. Em seguida, as células foram lavadas, fixadas e coradas com iodeto de propídio (PI) e foram analisados ​​quanto ao teor de ADN em diferentes fases do ciclo celular por citometria de fluxo. (B) células do cancro de tiróide foram tratados com lidocaína e bupivacaína durante 48 h, e as células foram subsequentemente coradas com fluoresceína conjugado anexina V e PI e analisados ​​por citometria de fluxo. As barras de erro representam o erro padrão da média. *, P 0,05

contra

controle

Avaliação da disfunção mitocondrial

Uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial é um dos primeiros eventos em apoptose.. a integridade da membrana mitocondrial foi avaliada utilizando o corante catiónico JC-1, uma sonda altamente específica para a detecção de mudanças na mitocondrial ΔΨ

m. JC-1 forma agregados vermelhos em mitocôndrias intactas, ao passo que a fluorescência verde é devido à formação de JC-1 em monómeros baixo potencial de membrana mitocondrial. Como mostrado na Fig. 3A, lidocaína e bupivacaína aumentou significativamente a formação de JC-1 em monómeros 8505c e K1 de uma forma dependente da dose. A percentagem de células com baixo ΔΨ

m foi ligeiramente mais baixa do que a percentagem de células apoptóticas tratadas com anestésicos locais, nas mesmas concentrações.

8505c e células K1 (A) foram tratados com as concentrações indicadas de lidocaína e bupivacaína durante 16 h. ΔΨ

m mudança foi monitorizada por meio do carregamento com JC-1 e foi analisada por citometria de fluxo. As barras de erro representam o erro padrão da média. *, P 0,05

contra

controle. (B) células do cancro de tiróide foram tratados com lidocaína (6 mm) e bupivacaína (2 mM) para os períodos de tempo indicados. Citocromo c libertação da mitocôndria para citosol foi determinada por Western blotting. As manchas foram despojado e sondado com um anticorpo contra actina de carga igual.

A seguir, procuraram determinar se citocromo c foi libertado da mitocôndria para o citosol. Tal como esperado, um maior nível de citocromo c foi medida no citosol em ambas as linhas celulares após tratamento com lidocaína e bupivacaína (Fig. 3B). Colectivamente, estes dados sugerem que o tratamento de células de cancro da tiróide com anestésicos locais conduz à activação da via de apoptose mitocondrial.

A activação de caspases por anestésicos locais

A libertação de citocromo c foi mostrado para activar as caspases a jusante que são em última análise necessários para induzir a apoptose. Por isso, procurou determinar se a activação de caspase estava envolvido na indução de apoptose por anestésicos locais. O tratamento com lidocaína e bupivacaína resultou na activação de caspase 3 e caspase 7, e a clivagem de PARP em 8505c e K1 dose-dependente (Fig. 4A). Além disso, o ensaio da caspase substrato colorimétrico mostraram que a actividade da caspase 3 aumentou de uma forma dependente do tempo nas células 8505c depois do tratamento com lidocaína e bupivacaína (Fig. 4B). Estes resultados indicam claramente que a activação de caspase desempenham um papel importante na apoptose de células de cancro da tiróide induzida por anestésicos locais

(A) As células K1 8505c e foram tratadas com as concentrações indicadas de lidocaína (L6, 6 mm;. L12, 12 mM) e bupivacaína (B2, 2 mM; B4, 4 mM) durante 16 h. As células foram colhidas e as amostras foram preparadas para análise de Western blot. C, controle. PARP, poli (ADP-ribose) polimerase. (B) Actividade de caspase 3 em lisados ​​de células de células tratadas com lidocaína 8505c (12 mM) e bupivacaína (4 mM) durante diferentes períodos de tempo foi determinada utilizando um ensaio colorimétrico de protease. As barras de erro representam o erro padrão da média.

As proteínas da família Bcl-2 participar no processo apoptótico por funcionando como promotores (

por exemplo

, Bax) ou inibidores (

por exemplo

, Bcl-2). Para activar o circuito apoptótico mitocondrial, Bax activado forma uma poro oligomérico e resulta na permeabilização da membrana exterior mitocondrial. Nós descobrimos que o tratamento com lidocaína e chumbo bupivacaína a uma redução dos níveis de Bcl-2 com um aumento concomitante nos níveis de Bax (Fig. 4A). Portanto, os anestésicos locais alterar os níveis de proteína dos membros principais da família Bcl-2 de uma forma que favorece um aumento na proporção de Bax /Bcl-2, o que pode contribuir para a susceptibilidade das células de cancro da tiróide para a apoptose.

análise de assinaturas de expressão de genes afetados por anestésicos locais

para identificar assinaturas de expressão de genes que estão associados com funções biológicas de análise anestésicos, microarray e enriquecimento via local, foi realizada para comparar os padrões de expressão em células tratadas com 8505c lidocaína e bupivacaína. Os dez principais vias identificadas pela análise de enriquecimento de via estão listados nas Tabelas 1 e 2. É digno de nota que a mudança de transcrição mais proeminente em células de câncer de tireóide tratadas com anestésicos locais é a apoptose. Outras vias comuns de lidocaína e bupivacaína tratamento incluem a remodelação do citoesqueleto e a diferenciação mielóide. Além disso, usamos

in silico

ferramentas da Ingenuity para identificar vias que envolvem alegadamente mecanismo molecular do câncer. A integração de dados de microarray a partir de células tratadas com lidocaína e bupivacaína, análise de caminho sugerido que extracelular quinase regulada por sinal (ERK) 1/2 e p38 MAPK são significativamente para cima ou para baixo-regulados em resposta ao tratamento com anestésicos locais (Fig. S2).

Modulação da proteína quinase ativada por mitógeno sinalização

a nossa análise microarray e enriquecimento via indica que as vias MAPK são provavelmente envolvidos nos mecanismos mediadores ação dos anestésicos locais sobre o cancro da tiróide células. Para examinar esta relação possível, as proteínas celulares totais foram extraídos a partir de células 8505c e K1 tratadas com lidocaína (12 mM) e bupivacaína (4 mM) durante vários períodos de tempo, e os lisados ​​foram coradas imunologicamente com anticorpos específicos contra fosforilada e total de ERK1 /2, p38 , e quinase c-Jun N-terminal (JNK), respectivamente. Como mostrado na Fig. 5, foi observada uma diminuição da fosforilação de ERK1 /2. A lidocaína e bupivacaína aumentou significativamente a fosforilação da p38 e JNK. A lidocaína e bupivacaína não tinha efeito notável sobre p38 total e o nível de proteína JNK.

8505c (A) e células K1 (B) foram tratadas com lidocaína (12 mM) e bupivacaína (4 mM) durante vários períodos de tempo , e as actividades de ERK, p38, JNK e foram examinados por análise de mancha de Western utilizando anticorpos específicos para a fosfo. Os níveis de proteína total de ERK, p38 e JNK também foram medidos.

Efeitos da inibição das proteínas quinases ativadas por mitógenos

Em seguida, gostaríamos de saber se as modulações de ERK1 /2, de MAPK p38, JNK e vias de sinalização responsáveis ​​por apoptose induzida por anestésicos locais. Para este fim, nós examinamos os efeitos de inibidores específicos sobre a ativação caspase e clivagem PARP. PD98059 é um inibidor de MAPK /ERK-cinase (MEK), inibindo assim a fosforilação e a activação de MAPK. SB203580 é um inibidor selectivo e reversível, e ATP-competitivo de p38 MAPK, enquanto que SP600125 é um inibidor de JNK anthrapyrazolone que compete com o ATP para inibir a fosforilação de c-junho Como mostrado nas Figs. 6A e 6B, PD98059 e SB203580, mas não SP600125, reduziu a activação de caspase 3 e clivagem de PARP. Estes resultados foram confirmados pelo ensaio de actividade da caspase 3 (Fig. 6C). Co-tratamento com PD98059 ou SB203580 suprimiu a atividade da caspase 3, enquanto SP600125 paradoxalmente aumento da atividade da caspase 3 após o tratamento com anestésicos locais. Estes dados são concordantes com os resultados de análise de enriquecimento de passagem (Fig. S2) que ERK1 /2 e p38 MAPK vias de sinalização estão envolvidos na apoptose induzida por anestésicos locais.

células

8505c (A) e (B) K1 foram cotreated com PD98059 30 uM (PD), 30 uM SB203580 (SB), ou 30