Abstract
A metástase leva a mau prognóstico em pacientes com câncer colorretal, e há uma necessidade crescente de novos alvos terapêuticos. TMEM16A (ANO1, DOG1 ou TAOS2) foi recentemente identificado como um canal de cloreto activado por cálcio (CACC) e é referido como sendo sobre-expresso em várias doenças malignas; no entanto, a sua expressão e função no cancro colorectal (CRC) permanece obscuro. Neste estudo, verificou-se expressão de ARNm e proteína TMEM16A em células de elevado potencial metastático-SW620, HCT116 e LS174T, mas não em células SW480 e HCT8 primárias, utilizando RT-PCR, Western blotting e imunofluorescência. gravações de patch-clamp detectado correntes CACC regulados por Ca intracelular
2 + e tensão em células SW620. Knockdown de TMEM16A por hairpin RNAs curtos (shRNA) resultou na supressão do crescimento, migração e invasão de células SW620 como detectado por MTT, cicatrização de feridas e Transwell ensaios. Mecanisticamente, a depleção TMEM16A foi acompanhada pela desregulação de fosfo-MEK, fosfo-ERK1 /2 e a expressão da ciclina D1. Análise de citometria de fluxo mostrou que as células SW620 foram inibidos a partir da fase G1 para a fase S do ciclo celular no grupo TMEM16A shRNA em comparação com o grupo de controlo. Em conclusão, nossos resultados indicam que TMEM16A CACC está envolvido no crescimento, migração e invasão de células metastáticas CRC e fornecer evidências para TMEM16A como um alvo potencial da droga para o tratamento de carcinoma colorretal metastático
Citation:. Sui Y, Sun M , Wu F, Yang L, Di W, Zhang L, et ai. (2014) Inibição da TMEM16A Expressão suprime o crescimento ea invasão em células de câncer colorretal humano. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10.1371 /journal.pone.0115443
editor: Hong Wanjin, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Biopolis, Estados Unidos da América
Recebido: 17 de junho de 2014; Aceito: 23 de novembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Sui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81173109, 31471099 e 31301179), China Pós-Doutorado Science Foundation (No. 2014M551198) e Jilin saúde e Planejamento Familiar Projeto Comissão (No. 2014Q024). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CCR) é a terceira neoplasia maligna mais comum em todo o mundo [1], [2], e metástase é um fator crucial para o mau prognóstico dos pacientes com CCR [3]. Alterações de genes múltiplos, tais como a activação de oncogenes e inactivação de genes supressores de tumores, estão envolvidos na progressão do epitélio do cólon normal em adenoma e em adenocarcinoma maligno [4], [5] No entanto, existe pouca informação sobre as alterações moleculares que conferir à metástase do cancro colo-rectal [6], [7]. Portanto, é necessário identificar genes relacionados a metástases e suas vias moleculares, que podem fornecer novos alvos para o tratamento de câncer colorretal metastático.
A banda cromossômica 11q13 amplicon é uma das regiões mais frequentemente amplificados em malignidades humanas , como cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) e de mama, bexiga e câncer de esôfago [8]. A análise da expressão diferencial de genes localizados nesta região levaram à identificação de
TMEM16A
, que também é chamado
ANO1
(anoctamin-1),
DOG1
( descoberto em tumores do estroma gastrointestinal proteína 1),
ORAOV2
(câncer bucal overexpressed 2) e
TAOS2
(e sequência 2 overexpressed amplificado-tumor) [9], [10], [11] [12], [13]. TMEM16A é composto por 26 exões e contém oito segaments transmembranares com o N- e C-terminais enfrentou o citoplasma e um circuito reentrante localizada entre TM5 e TM6 possivelmente formando a região do poro [14].
TMEM16A tem sido recentemente demonstrou ser um canal de cloreto activado por cálcio [14], [15], [16] e é amplamente expressa em vários tecidos, incluindo o epitélio secretor, músculo liso, neurónios sensoriais e outros tecidos [17], [18]. TMEM16A desempenha muitas funções fisiológicas importantes no controlo do transporte epitelial de fluido, a contração do músculo liso vascular, a produção de saliva e motilidade tracto gastrointestinal [19], [20], [21], [22]. A desregulação da TMEM16A provoca doenças humanas, incluindo a fibrose cística, a hipertensão, doenças pulmonares e diarreia [23], [24], [25]; knockout de TMEM16A é embrionariamente letais por causa do traqueomalácia [26].
A expressão de TMEM16A é sobre-regulada em vários cancros, incluindo HNSCC e de esôfago, câncer de mama e de próstata. A sua sobre-expressão também se correlaciona com o desenvolvimento de metástases distantes e mau prognóstico de doentes com cancro com HNSCC [27], [28], [29]. Recentemente, foi encontrado TMEM16A para promover a tumorigénese HNSCC e invasão por meio de activação da proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) de sinalização. Além disso, TMEM16A tem sido relatada para contribuir para a progressão tumoral através da indução da activação de células epiteliais do receptor do factor de crescimento (EGFR) e proteína quinase dependente de calmodulina II (CaMK II) e subsequentemente activação AKT e sinalização MAPK no cancro da mama e carcinoma epidermóide [30] , [31]. Embora TMEM16A é ubiquamente expressa em tumores estromais gastrointestinais [32], o seu papel na CRC metástase é pouco investigada.
No presente estudo, demonstrou pela primeira vez a expressão de canais de cloreto activados pelo cálcio TMEM16A (CaCCs) em diferentes metastatics potenciais linhas celulares de cancro colo-rectal. Nós investigado papel da TMEM16A em células SW620 metástase e seu mecanismo molecular possível usando hairpin RNAs curtos in vitro.
Materiais e Métodos
cultura celular
O carcinoma colorectal humano linhas celulares HCT8, SW480, SW620, as células HCT116 e LS174T foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). SW480 e SW620 foram cultivadas em meio L15 (Sigma, EUA). HCT8 e HCT116 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma, EUA). As células LS174T foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (Sigma, EUA). Fisher rato da tiróide (FRT) e células estavelmente transfectadas com FRT TMEM16A humano foram obtidos a partir de [33] Alan Verkman (Universidade da Califórnia, San Francisco, CA, EUA) e foram cultivadas em meio F12 Coon modificado de. Todos os meios foram suplementados com soro fetal bovino a 10%, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 e 95% de ar.
extracção de ARN e RT-PCR
O ARN total foi extraído a partir de células utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as introduções do fabricante. A concentração, pureza e integridade do ARN foi medida usando um espectrofotómetro NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Quinhentos ng de ARN total foi transcrito de modo reverso para ADNc, utilizando a transcriptase inversa com o kit de reagente PrimeScriptTM RT (Takara). O produto de cDNA foi utilizado como molde para amplificação por PCR num volume total de 30 uL, e as condições de PCR foram como se segue: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s; 60 ° C durante 30 s; e 72 ° C durante 60 s. Para a amplificação do ADNc TMEM16A, foram utilizados os seguintes iniciadores: iniciador de sentido directo, 5 ‘-AACGGGA CCATGCACGGCTT-3’; iniciador anti-sentido, a 5 ‘-TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3’. Os produtos de PCR (424 bp) foram analisadas por electroforese em gel de agarose, e β-actina serviu como um controle endógeno para normalizar os dados de expressão.
Western Blotting
As células foram lavadas duas vezes com gelo solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e dissolveu-se em tampão de lise (NaCl 150 mM, Tris 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5, 1% de Triton X-100 e suplementado com PMSF 1 mM). Depois de quantificação de proteínas, amostras contendo 100 ug de proteínas foram desnaturadas e a electroforese utilizando 10% de SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de PVDF. Após bloqueio com 5% (w /v) de leite desnatado e de lavagem com Tris-solução salina tamponada-Tween (TBST), as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo policlonal primário anti-TMEM16A (Abcam, ab53212; 1:100 ) e de murganho anti-actina-β anticorpo (Cell Signaling; 1:500), respectivamente. Todos os outros anticorpos primários foram comprados a partir de Cell Signaling Technology. Após a lavagem, as manchas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Sigma; 1:5,000) durante 1 h à temperatura ambiente e visualizadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido) em filme de raios X (Millipore Corporation , Billerica, EUA).
imunofluorescência análise
coloração de imunofluorescência foi realizado para localizar a expressão de TMEM16A. células de cancro colorrectal foram cultivadas durante a noite sobre lamelas de vidro preferidos (Fisher, EUA) e fixadas durante 15 minutos em 4% (w /v) de paraformaldeído (PFA). As células foram então lavadas 3 vezes com PBS durante 5 min, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 /PBS durante 20 min e, em seguida, incubadas durante 1 h em solução de BSA /PBS a 3% de bloqueio. Para detectar TMEM16A, as células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h com o anticorpo monoclonal de ratinho DOG1 anti-humano (zhongshanjinqiao, China; 1:50), seguido por exposição a um anticorpo secundário IgG-Cy3 anti-murganho conjugado (Sigma; 1 :1,000) a 37 ° C durante 1 h. Para visualizar os núcleos, as células foram coradas com DAPI (Sigma, St Louis, MO, EUA; 40,6- diamidino-2-fenilindole), e as lamelas foram montadas em lâminas com solução antifade (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) . As imagens fluorescentes foram examinadas e fotografadas sob um microscópio confocal (Olympus, Tóquio, Japão).
gravações patch clamp
células de cancro colorrectal humano foram semeadas em lamelas de vidro, e gravações de patch clamp foram realizadas usando um amplificador EPC10 (HEKA, Lambrecht /Pfalz, Alemanha) em combinação com Patchmaster (HEKA) à temperatura ambiente. As pipetas foram preparadas a partir de vidro de borosilicato capilar utilizando um extractor de micropipeta (PC-10, Narishige, Japão) e em seguida fogo-polido com um microforge (MF-900, Narishige, Japão). A resistência das pipetas na solução do banho foi de 2-5 MQ. As células foram perfundidos com uma solução de banho contendo: NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 mM de
2, CaCl 1 mM de
2, glucose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 20 mM (pH 7,4 com NaOH) . Para a configuração de célula inteira, o Ca de zero
2+ intracelular solução continha o seguinte: cloreto de 146 mM de N-metil-D-glucamina (NMDG-Cl), 2 mM de MgCl
2, 5 mM de EGTA e 8 mM de HEPES (pH 7,4 com NMDG). A alta Ca
2 + solução de pipeta continha Ca 5 mM
2 + -EGTA vez de EGTA (free Ca
2 + aproximadamente 25 mM). Diferentes livres [Ca
2 +] soluções foram feitas misturando o-Ca de zero
2 + e de alta Ca
2 + soluções. A célula foi fixada a partir do potencial de retenção (0 mV) para voltagens entre -100 a +100 mV em incrementos de 20 mV. Para a configuração de dentro para fora, a solução da pipeta continha: 140 mM NMDG-Cl, MgCl2 mM
2, 5 mM de CaCl
2 e 10 mM de HEPES (pH 7,4 com NMDG); e a solução de perfusão continha: 150 mM NMDG-Cl, MgCl2 mM
2, EGTA 10 mM, Tris 8 mM e HEPES 10 mM (pH 7,4 com NMDG). Depois a resistência do selo alcançado 40 GÊ, a membrana foi excisada e o potencial de membrana foi realizada a -50 mV. Os dados foram filtrados a 100 Hz com um filtro Bessel de oito pólos (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, EUA), e digitalizadas utilizando um computador, a uma taxa de amostragem de 500 Hz. ácido niflúmico (NFA) foi adquirido a Sigma-Aldrich. Todas as experiências de patch dentro-out foram realizadas utilizando um sistema de troca de perfusão solução rápida (SF-77B, Warner Instruments). O tempo morto da mudança solução foi de 30 ms, e análise de dados foi realizada para gravações contendo células inteiras em um único canal, utilizando o software Igor como descrito anteriormente [34].
RNA de interferência
TMEM16A /ANO1 short hairpin RNA (shRNA) e controle negativo plasmídeo shRNA foram construídas por GeneChem Co., Ltd. (Xangai, China). O local para ARNsi segmentação do gene humano TMEM16A /ANO1 (GenBank NM_018043) foi como se segue: # 1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (nt 1077-1095); e # 2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). interferência de ARN foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
proliferação celular ensaio
taxas de proliferação celular foram medidos utilizando o ensaio de MTT. Resumidamente, as células 5000 foram semeadas em cada placa de 96 poços durante 24 h, transfectadas com TMEM16A shRNA ou shRNA mexidos e ainda incubadas durante 1, 2, 3 e 4 d, respectivamente. o MTT (10 ul; 500 ug /mL) foi adicionada a cada poço, e as células foram incubadas durante mais 4 h. Subsequentemente, 150 mL de DMSO foi adicionado para dissolver os cristais de formazano. O número de células viáveis foi quantificado utilizando a absorvância medida a 570 nm com um leitor de microplacas (Thermo Scientific, EUA).
In vitro
cicatrização de feridas
mobilidade celular foi avaliada por um ensaio de ferida in vitro zero. As células foram semeadas numa placa de 6 poços até à confluência, raspadas com, uma ponta de 200 ul esterilizada e lavada duas vezes com PBS. Após incubação com meio L15 contendo soro fetal bovino a 1%, as células foram fotografadas a 0 h, 24 h, 48 h ou 72 h, sob um microscópio invertido (Olympus, Tóquio, Japão) com uma ampliação de 100 x. Estas experiências foram realizadas em triplicado. As distâncias entre as bordas da ferida foram medidos com uma régua graduada, e amplitude zero relativa foi determinada por uma proporção de largura média, em células de tratamento contra a amplitude média nas células de controle.
Ensaios
migração e invasão celular
In vitro atividades
migração de células cancerosas e invasão foram avaliados em transwells, como descrito anteriormente, com modificações [23]. células SW620 foram cultivadas em meio L15 com FBS a 10% até confluência em placas de 6 poços, transfectadas com o TMEM16A shRNA ou shRNA mexidos durante 24 h, e depois tripsinizadas, lavadas e contadas. Para a migração de células, um × 10
5 células em 200 uL de meio com FBS a 1% foram semeadas na câmara Transwell Insert superior contendo um filtro de policarbonato (6,5 mm de diâmetro, poros de 8 ^ m; Corning Costar, Corning, Nova Iorque , EUA). meio L15 (600 ul) com 10% de FBS (quimioatractiva) foi adicionada à câmara inferior, e as placas foram incubadas durante 72 h a 37 ° C em 5% de CO
2. Para a invasão de células, os transwells foram revestidas com Matrigel. As células que não migraram foram removidos a partir da parte superior dos filtros Transwell por raspagem. As células foram fixadas com penetraram paraformaldeído, coradas com azul de Coomassie e contadas sob um microscópio invertido (ampliação 100 x). O número de células representado actividade de migração.
A análise do ciclo celular
Após a transfecção das células com TMEM16A ou shRNAs scrambled durante 3 d, as células foram desprendidas utilizando tripsina, ressuspendidas em meio de crescimento e contadas. Em seguida, 1 × 10
6 as células foram lavadas com PBS e fixadas durante a noite com 70% (vol /vol) de etanol a 4 ° C. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram coradas com uma solução contendo 50 ug /ml de PI e 100 ug /ml de RNase A durante 30 min no escuro à temperatura ambiente. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo (Beckman Coulter, Epics XL).
A análise estatística
A análise estatística foi realizada por meio de estatística SPSS (versão 17.0) com um de Student bicaudal
t
-teste.
P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são expressos como o ± médios
SD
.
Resultados
A expressão de TMEM16A em linhas celulares de CRC
Neste estudo, detectado pela primeira vez
TMEM16A
níveis de mRNA por RT-PCR em linhas celulares de cancro do cólon HCT8, SW480, SW620, HCT116 e células LS174T. Como mostrado na Fig. 1A, um fragmento de 424 pb do humano
TMEM16A
foi amplificado a partir SW620, HCT116 e células LS174T e células DRF-controle positivo estavelmente transfectadas com
TMEM16A
, mas não de HCT8, SW480 células humanas e controle negativo células null-DRF. A análise de imunotransferência utilizando anticorpos policlonais anti-TMEM16A identificada uma banda de proteína de aproximadamente 110 kDa em SW620, HCT116 e células LS174T (Fig. 1B). Em contraste, a banda de proteína TMEM16A estava ausente em SW480, HCT8 e células null-FRT de controlo negativo. Examinamos ainda mais a expressão e localização subcelular da proteína TMEM16A em células CRC utilizando coloração de imunofluorescência. imunofluorescência revelou que TMEM16A foi altamente expressa na membrana celular e no plasma de SW620, HCT116 e células LS174T (S1 Fig.), enquanto que foi dificilmente TMEM16A observada em HCT8 e células SW480 (Fig. 2). Um, modelo celular isogénica (linhas celulares SW480 e SW620) de transição metástase CRC humana foi seleccionada para estudo posterior.
A, RT-PCR, revela a expressão de ARNm em TMEM16A SW620, as células HCT116 e LS174T, mas não em HCT8 SW480 e células. B, a expressão da proteína em TMEM16A HCT8 e SW480, SW620, HCT116 e células LS174T foi detectada por transferência Western. células DRF nulos atua como controle negativo. células DRF transfectadas com humano TMEM16A servir como controlo positivo.
As células foram cultivadas em lamelas e coradas com anticorpos anti-TMEM16A. coluna da esquerda, anti-TMEM16A imunofluorescência (Cy3, vermelho). coluna do meio, a coloração DAPI para visualizar núcleos. coluna da direita, fundiu imagens são compósitos de TMEM16A-anti imunofluorescência e coloração DAPI (200 ×).
expressão funcional do canal TMEM16A em células CRC
Para validar a expressão funcional o canal TMEM16A nas linhas celulares de CRC, que realizado de célula inteira gravações de fixação de membranas de células SW480 e dentro-fora gravações de fixação de membranas de células SW620. FIG. 3A mostra uma família de correntes em resposta aos passos de tensão de estímulos em presença de 1 uM de CA de uma célula SW480. A curva de corrente-tensão (Fig. 3B) mostrou que o potencial de inversão (V
rev) desta corrente é de aproximadamente -50 mV, mas a V
rev do canal de cloro foi estimado como sendo de aproximadamente 0 mV usando a equação de Nernst de acordo com o Cl extracelular e intracelular
-. Este resultado demonstra que as correntes registadas a partir da célula SW480 não são de canais de cloreto.
A, as correntes de células completas representativos em células SW480 foram activadas por 1 uM Ca. As correntes foram registrados em um potencial de retenção de 0 mV seguido por pulsando tensões entre ± 100 mV em incrementos de 20 mV. B, a curva de corrente-tensão do painel A, indicando que as correntes não são de canais de cloreto. C, A rastreio atual representante inscrito a partir de um patch de dentro para fora de uma célula SW620. Uma corrente CACC foi provocada com 1 mM Ca
2 +, como marcado. linhas tracejadas representam corrente zero. A tensão de membrana foi realizada a -50 mV; e desvios ascendentes representam abertura do canal. D, A rastreio atual estável após uma corrente CACC do painel C degradado. E, A gravação actual mostrando activação contínua de CaCCs e aplicações de rampas de voltagem na ausência (A e C) ou na presença (b) de Ca. rampas de tensão: +50 a -100 mV para uma duração de 2000 ms. F, as curvas de corrente-tensão do painel E mostrando características de rectificação exteriores típicos de CaCCs. Note-se que a condutância mínima foi observada na ausência de Ca. G e H, CaCCs correntes foram reduzidos separadamente por 100 uM e 50 uM NFA T16Ainh-A01.
Dentro-cabo experiências de fixação de membranas de células SW620 que se manifesta que a corrente de membrana era dependente de cálcio e a tensão , que são características típicas de CaCCs endógenos (Fig. 3C-F). Além disso, as correntes detectadas foram fortemente inibidas pelo Cl
– ácido niflúmico bloqueador do canal (NFA) (Figura 3G.) E o inibidor TMEM16A espec�ico T16Ainh-A01 (Fig 3H.)
. TEME16A também adicionado inibidor específico T16Ainh-A01 para SW620 e células SW480 separadamente, e observaram alterações crescimento destas células depois de 24 h. Os resultados demonstraram que T16Ainh-A01 especificamente poderia diminuir a proliferação de células SW620 SW480, mas não as células (Fig. 4).
As células foram tratadas com diferentes concentrações de T16Ainh-A01 durante 24 horas e a viabilidade celular foi medida pela ensaio MTT. Os dados são expressos como média ± SD (n = 3).
Knockdown de TMEM16A inibiu a proliferação de células SW620
Para divulgar as funções de TMEM16A em células cancerígenas do cólon, nós transfectadas duas sequências TMEM16A shRNA (# 1 e # 2) em células SW620 para silenciar a expressão de TMEM16A. resultados de Western blot mostrou que TMEM16A shRNA # 1 causou redução de 63,4% na expressão da proteína TMEM16A e TMEM16A shRNA # 2 causou redução de 71,7%, quando comparado com o controle shRNA. TMEM16A knockdown levou a uma alteração significativa em correntes de cloreto activadas pelo cálcio de células inteiras e densidade immunofluorescene (Fig. 5).
A, a análise Western blot da expressão da proteína em células SW620 TMEM16A que foram transfectadas com um shRNA # e # 2. B, gráfico de barras que resume o nível relativo de expressão de proteína a partir do painel TMEM16A A. Expressão de proteína TEMEM16A foi normalizado com o nível de expressão β-actina (n = 3). C, imagens immunofluence representativos de células SW620 são mostrados após TMEM16A é knockdown por shRNA # 1 e shRNA nº 2, em comparação com o controle shRNA (200 ×). D, O gráfico de barras resume as correntes de pico registrados em 100 mV de tensão em SW620 células após TMEM16A foi derrubado, em comparação com o controle de shRNA. ** P 0,01. Todos os dados são apresentados como média ± DP. E, correntes de células inteiras foram registrados a partir de células SW620 transfectadas com controle shRNA, shRNA # 1 e # 2 em um potencial de realização de 0 mV seguido por pulsando tensões entre ± 100 mV em incrementos de 20 mV.
para investigar os efeitos da TMEM16A sobre a proliferação de células SW620, usamos duas sequências shRNA para interferir a expressão de TMEM16A. análise de MTT mostraram que TMEM16A knockdown suprimiu grandemente o crescimento de células de uma forma dependente do tempo em comparação com o controle shRNA expressando SW620 células
in vitro
(Fig. 6).
A, O crescimento do SW620 células foi inibida por TMEM16A shRNA # 1 e # 2 em comparação com o grupo de controlo (média ± SD; n = 3; * P 0,05). B, imunotransfer�cias representativos confirmando knockdown de TMEM16A. Ctrl, controle.
Supressão de migração e invasão de células SW620, silenciando endógena TMEM16A
Para observar melhor os efeitos de TMEM16A na motilidade celular, realizamos cicatrização de feridas ensaios depois silenciando TMEM16A endógena. imagens de cicatrização demonstrou que o fechamento da ferida de células TMEM16A shRNA # 1 e # 2 foi mais lento do que no controle de células tratadas com shRNA depois de coçar as células (Fig. 7). Este resultado mostrou que a desregulação de TMEM16A atrasou a cicatrização de feridas em comparação com o controlo.
A, migração de células SW620 foi avaliada por um ensaio de cicatrização da ferida na presença de TMEM16A shRNA # 1 e # 2 shRNA, em comparação com shRNA controle. Imagens representativas de fechamento da ferida foram tomadas em 0 h, 24 h, 48 he 72 h após o ferimento abaixo de 100 × ampliação. B, gráficos de barras de painel A são mostrados. Os valores são as médias ± DP; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, controle.
A seguir, examinou os papéis de TMEM16A na metástase em células SW620. Transwell migração e ensaios de invasão de células knockdown TMEM16A foram realizadas. No ensaio de migração Transwell, os números de células transfectadas com TMEM16A shRNA que penetrado da membrana em grande parte diminuiu em comparação com células SW620 transfectadas com o controlo negativo. Os resultados também mostraram que as células transfectadas com SW620 TMEM16A shRNA # 1 e # 2 exibiu diminuição significativa da capacidade migratória. Do mesmo modo, também se observou o correspondente papel de TMEM16A shRNA # 1 e # 2 para a capacidade invasiva num ensaio invasiva paralelo (Fig. 8).
A, Migração (sem Matrigel) e invasão (com Matrigel) de células SW620 são significativamente suprimida pelo knockdown de TMEM16A comparação com o grupo controle por meio transpo� ensaios de penetração. As células que não migraram foram raspadas com um cotonete. As células que penetraram os filtros Transwell foram coradas com azul de Coomassie. Imagens representativas são mostrados. B e C, gráficos de barras de painel A são mostrados. Os valores são as médias ± DP; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, controle.
O esgotamento dos TMEM16A inibiu a activação de MAPK sinalização
Para elucidar os mecanismos moleculares pelos quais TMEM16A afeta o crescimento CRC humana e metástase, exploramos a correlação de TMEM16A com ciclina D1 e via de sinalização MAPK. Como mostrado na Fig. 9, knockdown de TMEM16A diminuíram significativamente a expressão de ciclina D1 e fosforilação de MEK e ERK1 /2, ao passo que isso não afecta o total de MEK ou níveis de ERK1 /2 de expressão.
resultados de Western blot mostram inibição da TMEM16A levou a uma diminuição na fosfo-MEK, fosfo-ERK1 /2 e ciclina D1. Ctrl, controle.
O esgotamento dos TMEM16A causou retardamento do ciclo celular procissão
Nós medimos ainda mais a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo para investigar o possível mecanismo de TMEM16A na regulação celular CRC proliferação. Como mostra a fig. 10 mostraram, um aumento no número de células na fase G0 /G1 e diminuição do número de células em G2 /M foi observada fase após TMEM16A endógena foi derrubado. A percentagem de células em fase G1 em células TMEM16A-shRNA # 1 (50,3% ± 1,83) e TMEM16A-shRNA # 2 células (51,8 ± 1,13) foram significativamente maiores do que em células de controlo (33,95 ± 2,05) (P 0,01). Estes resultados verificaram que TMEM16A knockdown conduzido ao retardamento da progressão do ciclo celular em células SW620 por células prendendo pelo Go /fase G1, que causou a inibição do crescimento de células TMEM16A shRNA.
A, B e C, por citometria de fluxo a análise da distribuição do ciclo celular de células SW620 transfectadas com controlo de shRNA, TMEM16A shRNA # 1 e # 2, respectivamente, durante 72 h. D, gráficos de barras mostrando a percentagem relativa de células nas fases indicadas do ciclo celular após o knockdown de TMEM16A. Os dados são expressos como a média ± SD; n = 3; * P .. 0,05
Em conjunto, nossos resultados demonstram que a depleção de TMEM16A suprimida a ativação de MAPK via e progressão retardada do ciclo celular sinalização
Discussão
proteínas TMEM16A foram encontrados recentemente para formar Ca
2 + -activated Cl
– canais que foram transitoriamente activadas pelo cálcio intracelular [15], [16], [26], [35]. Estes canais desempenham um papel importante na epitelial Cl
– a secreção, a contracção do músculo liso e a transdução de sinal olfactivo [17], [36], [37], [38], [39]. Estudos anteriores mostraram que TMEM16A é frequentemente sobre-expressos em várias malignidades, incluindo SCCHN, câncer de esôfago e tumores estromais gastrointestinais (GIST) [28], [36], [40]. No entanto, a expressão de TMEM16A no CRC permanece obscura.
A nossa descoberta fornece a primeira evidência de que TMEM16A é amplificado e altamente expresso em SW620, as células HCT116 e LS174T, mas não em células SW480 e HCT8. Descobrimos que a proteína TMEM16A foi de aproximadamente 110 kD e localizado na membrana celular e no plasma de SW620, HCT116 e células LS174T, o que é consistente com relatos anteriores [39], [41]. A linha celular de cancro do cólon SW480 origina de adenocarcinoma primário do cólon de um paciente masculino de 50 anos de idade, e SW620 células são derivadas de um gânglio linfático mesentérico metastático do mesmo paciente. Assim, as células SW620 tem alto potencial de metástases em comparação com SW480 células [42]. LS174T e HCT116 têm um maior potencial de metástases de células HCT8 [43], [44], [45]. Estes resultados demonstram que a sobre-regulação de TMEM16A foi associado com o aumento do potencial de metástases nos cinco linhas celulares de CRC. Especulamos que a alteração da expressão do TMEM16A foi associada com a aquisição de propriedades mais agressivas em linhas celulares de CRC, que induz tumores se tornarem metastático. Relação entre a expressão TMEM16A e progressão do tumor CRC precisa ser mais investigada em mais linhas celulares de CRC e em outro estudo clínico.
Devido à sua característica isogênico, linhas de células SW480 e SW620 servir como um modelo valioso para o estudo da genética alternâncias no câncer de cólon metastático progressão [46]. Por isso, escolhemos este par de modelo celular para estudo posterior.
evidência eletrofisiológica validado que funciona TMEM16A como CaCCs em células SW620. Em primeiro lugar, a corrente é dependente da concentração de ião cálcio no citoplasma e de tensão (Fig. 3C-F). Além disso, tanto o cloreto de bloqueador do canal de NFA e específicos de TMEM16A inibidor T16A
inal-A01 [47] pode suprimir eficazmente as correntes gravados a partir de um patch de células SW620 (Fig. 3G, H). Curiosamente, observou-se que depois de uma mancha de células foi excisada, a corrente CACC diminuiu rapidamente à primeira e, em seguida, tornou-se relativamente estável (Fig. 3C e D). Este fenómeno demonstrado que outras proteínas, tais como a calmodulina ou cinase dependente de calmodulina, pode estar envolvido na regulação da TMEM16A CaCCs em células SW620.
Há evidências de que os canais de cloreto contribuem para a progressão do tumor e tumorigénese [48] , [49], [50], [51]. CaCCs TMEM16A têm sido relatados recentemente para promover o crescimento e metástase em CECP, câncer de próstata e câncer de mama [27], [30], [31]. Consistente com estes resultados, descobrimos que TMEM16A knockdown resultou na supressão da proliferação, migração e invasão de células SW620. Nossos dados fornecem evidências de que TMEM16A provavelmente contribui para tumorigênese e metástase no high-metastático potencial CRC. inibidores moleculares pequenos que podem diminuir a expressão de TMEM16A pode servir como novas drogas terapêuticas para o câncer colorretal metastático.
Até o momento, o mecanismo pelo qual TMEM16A afeta o cancro do cólon permaneceu relativamente inexplorado. Numerosos estudos mostraram que a via de ERK, não só controla a proliferação celular e sobrevivência, mas também influencia a migração de células de tumor, invasão e progressão [52], [53], [54]. Estudos recentes relataram que TMEM16A promove tumorigênese HNSCC e progressão do câncer, ativando via de sinalização MAPK [30]. Portanto, nós nos concentramos em estudar a relação entre TMEM16A e MEK-ERK1 /2 caminho no CRC. As alterações desta via foram investigados após expressão TMEM16A foi inibida utilizando Western blotting. Os nossos resultados demonstram que o knockdown de TMEM16A inibiu significativamente a activação de MEK e ERK1 /2. Na base deste resultado, foi investigada adicionalmente a expressão de ciclina D1, uma proteína reguladora do ciclo celular que está associado com pErk1 /2 expressão. Os resultados mostraram que a expressão de ciclina D1 é positivamente associado com pErk1 /2 e TMEM16A expressão. Além disso, a citometria de fluxo (FCM) ensaios mostraram que a progressão do ciclo celular de G1 para a fase S foi inibida, o que foi consistente com a desregulação da expressão da ciclina D1 foi depois TMEM16A empobrecido. Estes resultados fornecem uma explicação possível para a inibição observada da proliferação celular, migração e invasão da CRC ao TMEM16A foi suprimida e indicou que TMEM16A contribui para o crescimento e a metástase de CRC, possivelmente através da regulação da via MAPK.
Em conclusão , mostramos que a expressão de TMEM16A está relacionada com o potencial metastático de linhas celulares de CRC.