Abstract
taxano quimioterapia com base é o padrão de cuidados tratamento no câncer de próstata resistente à castração (CRPC). Há provas convincentes de que a terapia de taxano afeta receptor de andrógeno (AR), mas os exatos mecanismos têm de ser mais bem investigado. Os nossos estudos identificaram c-jun como um jogador chave fundamental, que interage com AR e, portanto, determina o resultado da terapia de taxano dada. agentes Docetaxel (Doc) e paclitaxel (Pac) apresentaram efeitos diferentes sobre LNCaP e LNb4 evidenciado pela alteração na proteína e níveis de mRNA de c-jun, AR e PSA. fosforilação induzida por docetaxel de c-Jun ocorreu antes de a fosforilação de JNK, o que sugere que a fosforilação de c-Jun é independente das vias de JNK em células de cancro da próstata. Um estudo de xenoenxerto mostrou que camundongos tratados com Pac e bicalutamida mostraram pior resultado apoiar a nossa hipótese de que a regulação positiva de c-jun pode atuar como um fator anti-apoptótica potente. Observamos em nossos estudos in vitro um regulamento inversa dos níveis de PSA e AR-mRNA em células LNb4 Doc tratada. Isso também foi observado para calicreína 2 (KLK 2), que seguiu o mesmo padrão. Dado o fato de que a resposta à terapia de taxano é medido pela diminuição PSA temos que considerar que esta pode não refletir a verdadeira atividade da AR em pacientes CRPC
Citation:. Tinzl M, Chen B, Chen SY, Semenas J , Abrahamsson PA, Interação entre c-jun Dizeyi N (2013) e receptor de andrógeno determina o resultado da terapia de taxano na castração resistente do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10.1371 /journal.pone.0079573
editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Reino Unido
Recebido: 12 Abril 2013; Aceito: 25 de setembro de 2013; Publicação: 08 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Tinzl et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este projecto é financiado pelo Sandbergs financiamento privado, Percy Falk Foundation e verba câncer de Malmö. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As opções de tratamento para pacientes com câncer de próstata resistente à castração (CRPC) ainda são limitadas. Embora novas drogas promissoras como arbiraterone inibidor CYP17A1 e MDV3100 entraram no mercado, taxano quimioterapia à base ainda é considerado em todo o mundo a pedra angular mais importante do tratamento quando a terapia da privação do andrógeno (ADT) falhou [1-4]. Além dos taxanos clássicos, docetaxel e paclitaxel, Cabazitaxel é usado como agente quimioterapêutico no tratamento de pacientes CRPC, este último principalmente para o tratamento de pacientes com doença resistente doe [5].
células de prisão taxanos a G2-M fase por hyperstabilization dos microtúbulos levando as células à morte celular [6]. Além deste efeito bem descritos em células tumorais, existem evidências convincentes de que a terapia de taxano também interfere com o receptor de androgénio (AR) em células de cancro da próstata [7-11]. Nosso grupo identificou c-jun como um importante jogador chave neste interação entre AR e taxanos que afeta o resultado do tratamento no estatuto de resistência castração de células cancerosas da próstata.
fator de transcrição c-jun é um proto oncogene que pertence à família de AP-1 que consiste dos jun, fos e ATF-2 subfamílias [12,13]. proteínas AP-1 homo- ou heterodimerizar antes de se ligar ao seu local alvo de ADN. As proteínas AP-1 são multifuncionais e envolvida na regulação sinais de resposta ao estresse, crescimento celular e apoptose [12]. No entanto, existem dados que sugerem fortemente que c-jun é um promotor de crescimento e proto-oncogene [14,15]. Shemshedini e colaboradores mostraram que, à semelhança do que o observado com outros coativadores AR, c-Jun pode mediar a interacção AR N-a-C, para aumentar a ligação de ADN [16,17]. Além disso, fosforilado c-Jun é frequentemente sobre-expressa em cancros humanos [18,19] e tem sido associada às propriedades invasoras da próstata e cancro da mama [18,20,21]. No entanto, o papel de activação de c-Jun e a possível interacção com AR no destino da célula após exposição a doe é parte de uma rede complexa e continua por ser elucidado. Este estudo foi realizado para investigar a consequência da interacção de c-jun e AR em tratamento de taxano de células de câncer de próstata resistente à castração. Para optimizar a eficácia da quimioterapia com taxanos precisamos identificar uma molécula ou via específica que pode conferir resposta ou resistência. No presente estudo buscou-se examinar o efeito de taxanos como monoterapia ou em combinação com bicalutamida na AR e seu co-factor c-jun
in vitro
e
in vivo
.
Materiais e Métodos
linhas celulares e Reagentes
O cancro da próstata humano LNCaP e linhas celulares de PC-3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). LNb4 células foram geradas no nosso laboratório a partir de células LNCaP expostas a bicalutamida (5 uM no soro reduzida para 5%). As células foram cultivadas em meio RPMI (LNCaP) e Hams F12 (PC-3) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). As células foram tratadas com docetaxel (Taxotere, Aventis Sanofi) e paclitaxel (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Islândia) na concentração indicada em cada figura. A di-hidrotestosterona (DHT) foi adquirido a partir de Steraloids Inc. (Newport, RI) e bicalutamida da AstraZeneca (Londres, Reino Unido). Todos os reagentes de Western blot foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) excepto inibidor de JNK XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha).
A transfecção e pequeno ARN interferente (siRNA)
transientes transfecções com c-jun, mutante c-jun (c-jun Ala63 /73) e plasmídeos AR (todos gentilmente cedido por Shao-Yong Chen, Harvard Medical School) em PC-3 células de câncer de próstata foram realizadas utilizando FuGENE 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemanha) como recomendado pelo fabricante. O mutante c-Jun (c-Jun Ala63 /73), aqui referido como JUNA, utilizado em experiências portador de uma mutação no local de serina 63/73 (Ala63 /73), que é o alvo principal de fosforilação por estímulos de stress. Para as experiências de ARNip, células LNCaP PC-3 e foram transfectadas durante 48 horas com 100 nM de ARNsi de c-Jun ou não segmentação de siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). A transfecção foi realizada utilizando X-tremeGENE siARN reagente de transfecção (Roche Diagnostics) de acordo com as instruções do fabricante.
Proliferação
A viabilidade celular foi definido por exclusão azul de tripano (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). PC-3, LNCaP e células LNb4 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 25.000 células por poço. Após 24 e 48 horas de tratamento com DOC ou DMSO (Sigma-Aldrich) às concentrações indicadas flutuante e as células aderentes foram recolhidas através de tripsinização. Porções iguais de suspensões de células e 0,4% de azul de tripano foram misturadas, e o número de células viáveis de tripano, azul-excluindo foram contadas usando um hemacitómetro. A percentagem de células viáveis foi expressa por 100 do total de células (média ± DP). As células PC-3 transfectadas foram adicionalmente avaliados por ensaio de MTS. Depois de 48 horas de transfecção as células foram expostas a doe ou permaneceram sem tratamento durante mais 48 horas. Após incubação a 37 ° C em 5% de CO
2 durante 4 horas, o número de células vivas foi medida utilizando um ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- – ensaio (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) (CellTiter 96 Aqueous One-solução de ensaio de proliferação celular, Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância foi medida a 490 nm utilizando um leitor de placas com múltiplas cavidades (modelo 680, Bio-Rad, Richmond, CA, EUA), com os poços contendo apenas meio que servem como controlos em branco.
citometria de fluxo para análise do ciclo celular e apoptose
a distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. Resumidamente, as células transfectadas foram tratadas com doe durante 48 horas e foram fixadas e coradas com iodeto de propídio durante 40 min. As células viáveis foram fechado, e o conteúdo de ADN de pelo menos 10 000 células marcadas foi quantificada com um classificador de células activadas por fluorescência. A apoptose foi determinada por anexina V conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e coloração de 7-AAD (BD Pharmingen de BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). As células foram tratadas com doe durante 48 e 72 horas e as células coradas foram submetidas a análise citométrica de fluxo num instrumento FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Os dados apresentados são obtidos a partir de duas experiências independentes em duplicado e foram analisados utilizando o software de FCS Express (DeNovo Software, Los Angeles, CA, EUA).
análise de Western Blot e imunoprecipitação
quanto à proteína total análise por Western blot foi extraído utilizando o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão (50 mmol /L de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 1 % de NP40, 0,1% de SDS, Na3VO4 1 mM, NaF 1 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM) suplementado com o cocktail inibidor de protease completo Mini (Roche, Mannheim, Alemanha). A concentração total de proteínas foi medida utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). As amostras de proteína (20-30 ug) foram carregados em 4-12% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose de ensaio Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e submetido a análise electroforética e transferência. As membranas foram sondadas durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos primários: anti-AR (441 e N-20), anti-c-Jun, anti-P-cJun (Ser 63/73), e anti-β-actina, todos adquiridos a partir de Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PSA (Dako, Glostrup, Dinamarca), p-JNK a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticorpos secundários (IRDye 680, IRdye 800) foram obtidos a partir de LI-COR Biotecnologia (Nebraska, EUA) e as proteínas detectadas por Odyssey® infravermelho Imaging System.
Para as células de imunoprecipitação foram tratados como indicado, e colhidas em tampão de lise. Os lisados celulares foram homogeneizados, teor de proteína medido e 500 ug de proteína de pré-aclarados foi incubada com anticorpo anti-AR a 4 ° C durante a noite, com agitação contínua. Quantidades iguais de IgG de rato foi usado como controlo negativo. Proteína G grânulos (Pierce, Rockford, IL, EUA) foram em seguida adicionados a cada amostra e incubou-se a 4 ° C durante 2 horas. As amostras foram em seguida centrifugadas a 2000 x g, 2 minutos e tampão de amostra de Laemmli (30 ul) sem β-mercaptoetanol e a mistura incubada a 65 ° C durante 15 minutos para eluir as proteínas ligadas. fracções de eluato foram centrifugadas a 2000 x g, foi adicionado 1 ul de β-mercaptoetanol e as amostras submetidas a transferência de Western como descrito acima. A expressão proteica foi avaliada em relação à expressão de p-actina por análise densitométrica.
quantitativa em tempo real A análise de PCR
O ARN total foi isolado a partir das células LNCaP e LNb4 utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, Reino Unido) seguindo o protocolo dos fabricantes e tratado com DNase isenta de RNase (ADNase I; Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Suécia) para remover potenciais contaminantes de ADN genómico. Cada cDNA foi sintetizado por transcrição reversa a partir de 1 ug de ARN total usando a primeira cadeia do sistema StrataScript síntese e iniciadores de hexâmeros aleatórios (Stratagene; diagnóstico ah, Estocolmo, Suécia). PCR em tempo real foi realizado com SYBR Green QPCR master mix (iScript da BioRad) em um sistema de detecção de MX 3000P (Stratagene) com uma etapa de iniciação, a 95 ° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 1 minuto e 72 ° C durante 1 minuto.
Foram utilizados os seguintes iniciadores para cada gene: PSA (F5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ‘e R5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3′), AR (F 5’-GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3 ‘e R5’ GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 ‘), GAPDH (5’ -CGA CCA CTT CAA TGT GCT AC-3 ‘e 5′-AGG GGT CTA CAT GGCAACTG-3′), c-Jun (F 5’-GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 e R5 ‘GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 ‘), NKX3.1 (F 5′-3’GTACCTGTCGGCCCCTGAACG e R5′-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3′), c-Myc (F 5′-GGCGGGCACTTTGCACTGGA-3’and R5′- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3′), KLK2 (F 5′-AGATGAAGACTCC AGCCAT-3′-5’-R e GATACCTTGAAGCACACCA -3 ‘), β-actina (F 5′-CGTGG- GGCGCCCCAG -3′ e R 5’-TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG – 3 ‘).
a quantidade de ARNm foi determinada usando o comparativo C
método T. As amostras foram analisadas em triplicado e os dados em comparação com a expressão do ARNm no controlo não-tratado que foi definido como um valor de referência.
Animais e inoculação do tumor
camundongos Nude NMRI macho de quatro a seis semanas de idade de Taconic Europa (Lille Skensved, Dinamarca) foram utilizados no experimento. O modelo de xenotransplante foi realizada de acordo com o protocolo aprovado especificamente pela comissão de Ética da Universidade de Lund (aprovação número M 239-10). Os ratos foram mantidos de acordo com as orientações dadas pelo Comitê de Ética do Malmö-Lund. Células LNCaP (2×10
6 células) foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos, resultando em dois tumores por rato. Depois de os tumores se desenvolveram a castração cirúrgica foi realizada. Os animais foram divididos em 6 grupos: os ratos foram tratados com veículo, Doc, Pac ou bicalutamida como um agente único e Doc ou Pac combinado com bicalutamida. As drogas foram administradas por via intraperitoneal (i.p.) (20 mg /kg) num volume de 100 ul, uma vez por semana durante 5 semanas com excepção da bicalutamida que foi administrada duas vezes por semana. No ponto de tempo designado semana 0, foi iniciado o tratamento e os ratinhos foram sacrificados uma semana após o último tratamento. Os tumores foram colhidas, fixadas em formalina e embebidos em parafina para análise imuno-histoquímica.
Imunohistoquímica
tumores de xenoenxerto dissecados foram fixados em paraformaldeído a 4% e posteriormente incluídos em parafina. Quatro mm de espessura foram desparafinizadas, reidratadas e tratou-se com microondas, durante 10 min em pH elevado solução de recuperação de alvo (Dako, Glostrup, Dinamarca), antes de serem processadas em máquina automática Techmate 500 coloração imuno-histoquímica (Dako), utilizando anticorpos contra a AR, c-jun, p -cjun e Ki-67 (Dako). DAB (3,3′-diaminobenzidina) foi utilizado como um substrato cromogénico e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Os espécimes foram vistos com um Olympus AX 70 microscópio com uma ampliação de x 10. Um escore semiquantitativo arbitrária foi aplicado para avaliar os sinais de coloração e marcou em três categorias; coloração negativa (0), coloração fraca, mas presente de algumas ou todas as células (1), a coloração moderada (2) ou coloração forte (3). Pelo menos duas secções por tumor foram determinadas e as contagens foram representativas de pelo menos 70% da área do tecido analisado.
fraccionamento sub-celular
fraccionamento celular foi realizado de acordo com o protocolo fornecido com o NE-PER nuclear e citoplasmática reagentes de extracção (Pierce, Rockford, IL). As células LNCaP foram expostos a Doc ou Pac para 6, 24 e 48 horas ou permaneceu sem tratamento. As fracções foram cozidos com tampão de amostra com SDS, sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose e sondaram-se como indicado, com anticorpos primários para AR, β-actina ou lamina A, tudo a partir de Santa Cruz, seguido de anticorpos secundários (IRDye 680, IRdye 800), que foram obtidos a partir de LI-COR Biotecnologia (Nebraska, EUA). As proteínas foram detectadas por Odyssey® Infrared Imaging System.
Análise Estatística
Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos três experimentos realizados e são expressos como a média ± SD. A significância estatística foi determinada com o teste t de Student não pareado. Os valores de p 0,05 foram considerados significativos.
Resultados
induzida por sobre-expressão de c-Jun resistência ao tratamento doe
A função de c-jun como um factor de transcrição relacionados com a proliferação foi reportado no cancro da próstata antes de [22 ]. Para investigar o impacto da c-Jun em células de cancro da próstata tratados Doc, os experimentos foram realizados em LNCaP, LNb4 e células PC-3. Observou-se que as células LNCaP tratadas com doe eram mais resistentes ao tratamento nos pontos de tempo indicados em comparação com as células PC-3 (30% vs 9%, p = 0,003) (Figura 1A). Apesar de não detectar uma diferença estatisticamente significativa entre LNCaP e LNb4 pudemos ver uma tendência de que o tratamento a longo prazo com bicalutamida aumenta a resistência (Figura 1A). Além disso, a análise de apoptose foi realizada utilizando Anexina V /7AAD confirmando menos apoptose em células expostas a LNb4 doe em comparação com células LNCaP parentais
(A) a viabilidade celular por exclusão com azul examinados tripano em LNCaP (LN), e PC LNb4 células -3. (B) Determinação da apoptose por citometria de fluxo. Após o tratamento das células com o documento, o grau de apoptose foi avaliada pelo ensaio de anexina V /7AAD. (C) ensaio de MTS em células PC-3 transfectadas, como indicado na figura e tratou-se 48 horas com 5 nM doe. (D) Gráficos de citometria de fluxo em células mencionadas em (C) demonstrando população celular ciclismo coradas com iodeto de propídio. As células foram tratadas com doe durante 48 h ou permaneceu sem tratamento e classificados em diferentes fases da mitose, por citometria de fluxo. (E) Análise de transferência Western para demonstrar a expressão da proteína em células transfectadas mencionados em (C). (F) Análise da interacção proteína-proteína foi determinada por imunoprecipitação, na presença ou ausência de DOC ou Pac em células LN e LNb4. As células foram imunoprecipitados com anticorpo anti-AR (441) e as membranas foram sondadas com anticorpo anti-c-junho Para o controlo, 20? G de lisado celular foi utilizado como entrada e o carregamento igual foi confimed com anticorpos de AR.
(Figura 1B). Para examinar se a c-Jun está envolvido na resposta à terapia doe, células PC-3 foram transfectadas com c-Jun, c-jun mutante (JUNA) e co-transfectadas com AR (AR /cJun, AR /JUNA, respectivamente) plasmídeos e ensaio MTS realizada. Células PC-3 transfectadas com JUNA mostrou um aumento estatisticamente significativo (p = 0,01, JUNA vs controlo) na proliferação celular (Figura 1C) enquanto que a transfecção com AR diminuiu a viabilidade celular comparável à doe células de controlo tratadas. Embora não houve diferença estatisticamente significativa entre as células de controlo Doc tratada e transfectadas células PC-3 c-Jun, houve uma tendência clara para o aumento da viabilidade no último. Curiosamente, a co-transfecção de AR nas células PC-3 que sobre-expressam de c-Jun ou JUNA não anular o efeito sobre a proliferação (Figura 1C), sugerindo um papel de c-jun como um factor anti-apoptótico potente. análise do ciclo celular foi então levada a cabo e exibida de captura celular em fase G2-M em células PC-3 tratadas Doc (Figura 1D). Observou-se que as células PC-3 transfectadas com AR ou JUNA mostrou uma tendência semelhante com uma diminuição acentuada da percentagem de células na fase G2-M (18,6% e 19,9%, respectivamente), enquanto que a fase S foi aumentado (43 , 4% e 43,5%, respectivamente), sugerindo que a fosforilação de c-Jun desempenha um papel crucial na resposta de células a Doc (Figura 1D).
próxima examinaram a expressão da proteína nas células transfectadas PC-3. análise de transferência de Western mostrou um aumento marcado na proteína AR nas células co-transfectadas com AR /cJun em comparação com células transfectadas com RA isoladamente ou AR /JUNA (Figura 1E). Estes resultados sugerem que a interacção entre a RA e c-jun é dependente do local de fosforilação disponível 63/73. Para melhor avaliar o efeito de agentes de taxano em c-Jun endógena e AR imunoprecipitação foi realizada em LNCaP e LNb4. Nós encontramos uma interação entre AR e c-jun em ambos os tipos de células, que foi reforçada por Doc e tratamento Pac (Figura 1F). Estes resultados confirmam que existe uma interacção física entre a proteína c-Jun e AR que regula o efeito da terapia de taxano em células PC.
Efeitos do c-jun siRNA sobre a resposta Doc
Para investigar se c-jun downregulation pode alterar a resposta das células PC para Doc nós transfectadas células PC-3 e LNCaP com siRNA ou nontargeted siRNA, que serviu como um controlo (Figura 2A). As células foram expostas a doe durante 24 ou 48 horas e submetida a ensaio MTS. c-Jun foi significativamente regulada negativamente, embora não completamente reduzida em ambas as linhas celulares (Figura 2A). células LNCaP silenciados com ARNsi mostrou uma clara diminuição na viabilidade celular, após 24 horas de exposição doe comparação com células LNCaP parentais (p = 0,002). Em células PC-3, não observamos uma mudança significativa na viabilidade das células no mesmo ponto do tempo. Após 48 horas o efeito de C-Jun silenciamento diminuiu e células recuperadas como mostrado na Figura 2B.
(A) análise de transferência de Western que mostra a eficiência de transfecção de ARNsi de c-Jun em células PC-3 e LNCaP. (B) A proliferação celular em células LNCaP (painel superior) e células transf ectadas com c-Jun siRNA ou não-alvo (de controlo) vector de PC-3 (painel inferior). As células foram tratadas com doe durante 24 e 48 horas. células LNCaP abrigar c-Jun siARN mostrou uma diminuição significativa na proliferação (p = 0,002) enquanto que as células PC-3 não foram afectados.
expressão de p-cJun induzida por taxano é independente na via da JNK em células PC
Tem sido relatado que doe quimioterapia induz o seu efeito através da activação de JNK selectivamente em células cancerosas [23] . Uma vez activada, a JNK fosforila e activa um certo número de factores de transcrição, tais como c-junho Para abordar esta questão, analisou se via de sinalização JNK tem um papel na morte celular induzida por câncer de próstata-Doc. As células PC-3 e LNCaP foram tratadas com 500 nM de inibidor de JNK para 2 ou 8 horas, ao passo que doe e Pac células tratadas realizados em pontos de tempo 2, 4, 8 e 24 horas. Como mostrado na Figura 3A a fosforilação de c-Jun foi induzida 2 horas após a exposição ao doe em células PC-3, enquanto a fosforilação de JNK apareceu 24 horas após a exposição, em células PC-3 única (Figura 3A). Em células LNCaP expostas a doe se observou alterações não marcados em fosforilação de JNK em qualquer ponto de tempo do tratamento com fármaco (Figura 3B). Isto sugere que a activação de JNK pode ser um efeito secundário de tratamento doe e fosforilação de c-Jun é um objectivo primário do doe. Especialmente em AR expressando células LNCaP, não pode ser excluída uma interacção directa com RA que causam a rápida indução de fosforilação de c-junho Além disso, foram obtidos resultados semelhantes em células acima mencionadas expostos a Pac (figura não mostrada). Vale ressaltar que um nível basal de p-cJun em células não tratadas foi expressa em ambas as linhas celulares.
A análise Western blot de células (B) LNCaP PC-3 e (A) expostas ao Doc ( 5 nM) durante até 24 horas ou permaneceram sem tratamento (0). As células PC-3 e LNCaP foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 50.000 células por cavidade e tratadas com doe e Pac ou em combinação com 500 nM de inibidor de JNK (SB) como indicado.
agentes taxano alterar os níveis de proteína de AR e PSA
Outros experimentos foram exclusivamente realizado em LNCaP e LNb4 apenas células. Com base na nossa resultado acima examinámos ainda como terapia de taxano afecta a expressão de genes regulados AR, tais como PSA no nível da proteína. Observou-se um aumento concomitante dos níveis de AR e de proteínas PSA em células LNCaP Doc tratados (p = 0,01, Doc 24 vs controle) (Figura 4A). No entanto, em células LNCaP tratadas Pac uma diminuição gradual da proteína AR foi observada concomitantemente com o nível de PSA depois de 48 horas (Figura 4A). Curiosamente, o aumento do nível de proteína AR em células LNb4 foi mais pronunciada por tratamento Doc, ao passo que o nível de proteína PSA foi claramente diminuída após 48 horas (p = 0,02, Doc 24 vs Doc 48). A exposição de células a LNb4 Pac levou a uma diminuição acentuada na expressão da proteína AR e PSA (Figura 4B). Expressão de p-cJun diferiam em LNCaP e LNb4 (Figura 4C, D). Em células LNCaP tratamento doe aumento da expressão de p-cJun gradualmente (p = 0,04, doe 6 vs doe 48), ao passo que nas células tratadas Pac um aumento em 24 horas foi visto, o que foi seguido por uma diminuição marcada às 48 horas (Figura 4C) . No entanto, as células em LNb4 Pac tratamento resultou numa indução dependente do tempo da p-cJun, enquanto que o tratamento doe não o fez (Figura 4D). Não ocorreram alterações acentuadas nos níveis de c-jun foram observados em ambas as linhas celulares e em todas as condições estudadas.
análise de transferência de Western da expressão de AR e de PSA em células de (A) LNCaP e (B) LNb4. As células expostas a 5 nM de Doc, 5 nM de Pac ou 10 nM de DHT por até 48 horas ou permaneceu sem tratamento. Os mesmos lisados foram utilizados para analisar a expressão de p-cJun e de c-jun em (C) e células LNCaP LNb4 (D). Os níveis de expressão de proteína foram avaliados por análise densitométrica (painéis inferiores).
Efeito do tratamento taxano na expressão de c-jun e mRNA AR
Para investigar as alterações de RNA devido ao tratamento taxano, qRT-PCR foi realizada em células LNCaP e LNb4. As células foram tratadas tal como indicado na Figura 5. Embora tenhamos observado uma indução inicial da AR e de ARNm de PSA em células LNCaP Doc tratada, isto não ocorreu no tratamento Pac. Interessantemente, as células LNb4 mostrou um aumento contínuo de expressão de ARNm de AR de uma maneira dependente do tempo, quando tratados com Doc, ao passo que o ARNm de PSA foi negativamente correlacionado com a expressão de ARNm de AR (Figura 5A). Houve diferença estatisticamente significativa no nível AR e PSA mRNA às 24 e 48 horas de exposição ao Doc (p = 0,05 ep = 0,003, respectivamente). No entanto, em células tratadas Pac LNb4 observou-se uma indução inicial da AR e PSA ARNm que diminuiu para um nível significativo após 48 horas. Em contraste, c-Jun expressão de ARNm aumentou significativamente em células tratadas Pac LNb4 (p = 0,03), que não puderam ser mostrados em células tratadas Doc (Figura 5B). Como expressão de mRNA KLK2 esperado mostrou um padrão semelhante, como mRNA PSA em todas as células tratadas. Outras análises de c-myc e NKX3.1 foi realizada como se mostra na Figura 5B. Os resultados não mostram qualquer tendência significativa na expressão de c-Myc ARNm independentemente de taxano utilizado e tempo de tratamento. Contudo observou-se um aumento da expressão de mRNA de células em todas as NKX3.1 Doc tratada, enquanto que este foi menos pronunciada nas células tratadas Pac (Figura 5B).
A expressão de (A) AR e PSA e (B) c -jun, KLK2, NKX3.1 e c-Myc de mRNA níveis de resposta às Doc ou Pac foi avaliada por quantitativa PCR em tempo real (qPCR). O nível de expressão de ARNm de média relativa de genes regulados AR foi medida por quantitativo em tempo real de RT-PCR em triplicado.
Para resumir nossos resultados mostram uma clara correlação entre AR, c-jun e PSA em células do taxano tratada. O resultado do tratamento é dependente do estado do receptor de AR e a expressão de ARNm de c-jun e o taxano utilizado.
Animal modelo
Para avaliar a resposta terapêutica da linha de células de câncer de próstata LNCaP in vivo estabelecemos um modelo animal como indicado na Figura 5. Os ratos foram tratados com Doc ou Pac como agente único ou em combinação com bicalutamida. Uma redução significativa statisitically no tamanho do tumor de ratos tratados apenas com doe foi mostrado (p = 0,04, doe vs CTR) (Figura 6A). Em ratinhos tratados com Pac uma estabilização, mas nenhuma diminuição no volume do tumor foi observada (Figura 6A). Não houve diferença significativa observada entre ratos e ratinhos tratados Doc receber tratamento combinado com bicalutamida (Figura 6C). Curiosamente, os tumores nos ratinhos tratados com Pac e tumores bicalutamida começou a regredir após uma estabilização inicial (Figura 6C). Houve uma redução do tamanho do tumor estatisticamente significativa no Doc /bic em comparação com camundongos Pac /BIC tratados (p = 0,003).
(A) Curva de crescimento de camundongos tratados com Doc ou Pac sozinho, Doc vs CTR (p = 0,04). (B) coloração imuno-histoquímica correspondente de tecido tumoral. curva (C) Crescimento de camundongos com o tratamento combinado, Doc /bicalutamida (Bic) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) coloração imuno-histoquímica correspondente de tecido tumoral. Note-se que p-cJun foi diferencialmente expressos em ratos tratados com Doc e Pac. expressão de Ki67 foi maior em comparação com os ratinhos Pac Doc tratada.
próxima examinaram a expressão de c-Jun, p-cJun, proteínas AR e Ki67 nos tecidos tumorais recolhidas para avaliar o efeito do tratamento com fármaco. Houve uma mudança significativa nos níveis de AR nucleares em animais tratados com doe sozinho ou DOC /BIC (Figura 6B e 6D, respectivamente). Em ambos os grupos de tratamento de aproximadamente 60% da população de células exibido uma translocação citoplasmática de AR, em comparação com ratinhos do grupo de controlo (Figura 6B). Em contraste, os murganhos tratados com terapia de combinação Pac ou a translocação citoplasmática de AR foi menos pronunciado. No entanto, a expressão de p-cJun em tecidos de animais de controlo exibia uma coloração intensa, ao passo que foi observado que nuclear p-cJun foi mais distinta em ratinhos tratados Pac em comparação com animais Doc tratada onde também uma expressão citoplasmática foi observado (Figura 6B). Não houve alteração significativa no padrão de expressão de c-Jun foi observada em animais de controlo e tratados. expressão de Ki67 foi mais pronunciada em ratinhos tratados com Pac que reflecte a fraca resposta dos tumores para este taxano in vivo.
Para confirmar a translocação citoplasmática de AR por terapia de taxano in vitro, experiências de transferência de Western foram realizadas em células LNCaP ( Figura S1). De acordo com os dados in vivo que demonstraram que, independentemente de o taxano utilizado AR foi translocada para o citoplasma. A translocação foi mais pronunciado em células Doc tratado (painel superior) em comparação com Pac células tratadas (painel inferior), especialmente após 48 horas de tratamento.
Discussão
Neste estudo, elucidou o papel de AR e sua coativador c-Jun na resposta de células PC à terapia de taxano. Mostrámos que a sobre-expressão de c-Jun em células PC-3 confere uma resistência mais elevada estatisticamente significativa para o tratamento doe comparação com as células co-transfectadas com AR /c-jun ou AR sozinho. As células LNCaP foram mais resistentes à doe na presença ou ausência de bicalutamida em comparação com as células PC-3. A transfecção com o mutante JUNA viabilidade aumentada, sugerindo que c-Jun e o local de fosforilação 63/73 é um regulador chave da resposta celular para os taxanos em PC. Nós mostramos pela primeira vez que Doc e Pac tratamento afeta de forma diferente proteína e níveis de mRNA de AR e PSA em células LNCaP e LNb4 parentais. Estas diferenças foram reflectido no crescimento tumoral no modelo de ratinho. Os resultados apresentados aqui fornecem evidência de que o efeito do tratamento de taxano é fortemente dependente do estado de c-jun e AR da linha celular utilizada e do fármaco utilizado para o tratamento.
Sabe-se que o factor de transcrição AP-1 é multifuncional e, por vezes, de forma controversa discutidos na literatura [24]. c-Jun foi demonstrada para transduzir uma resposta mitogénica e para promover o crescimento celular como um único gene ou em cooperação com um gene ras activado [25,26]. Por conseguinte, verificou-se que a sobre-expressão de c-Jun (mutante JUNA) confere resistência a células PC-3 para terapia doe. Curiosamente, JUNA foi encontrada para ser mais potente na prevenção da morte de células em comparação com AR, sugerindo que o local de fosforilação 63/73 é crucial para a interacção e a estabilização dos complexos de AR e c-jun. Este resultado está em linha com estudos previamente relatados indicando que c-jun pode atuar como um fator anti-apoptótica em vez de pró-apoptótica em contexto com a exposição a agentes quimioterapêuticos [14,27].