Abstract

Objectivos

A glutationa (GSH) desempenha um papel importante na protecção de células contra os danos oxidativos. proteína ABCC1 transporta GSH. Embora esta proteína é largamente estudada em cancro, devido ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas, o seu papel nas células tubulares do rim é desconhecido. O objetivo deste estudo foi descobrir se ABCC1 tem um papel na proteção das células do néfron distal contra o estresse causado pela alta osmolaridade medular.

principais métodos

células MA104 foram tratados com alta concentrações de cloreto de sódio, ureia, ou ambos, para elevar a osmolalidade do meio de cultura. A viabilidade celular foi acessado por MTT e ensaios de azul de tripano. expressão ABCC1 e extrusão de carboxi-fluoresceína (CF), um substrato ABCC1 fluorescente, foram medidos por citometria de fluxo.

principais descobertas

A incubação de células MA104 em um meio de alta concentração de sódio resultou em mudanças na granularidade celular e expressão alterada e da atividade de ABCC1. A ureia não alterou a expressão ou actividade ABCC1, mas inverteu os efeitos observados de NaCl. As concentrações de sódio de alta também teve um efeito negativo sobre a viabilidade celular e uréia células também protegidos contra este efeito.

Significância

Nossas descobertas demonstram que ABCC1 desempenha um papel significativo na proteção de células epiteliais de rim contra o stress causado pelo ambiente atual de alta de sódio em medula renal

Citation:. Fonseca LM, Alvarez AB, Rodrigues RC, Santos DHF, Lopes AG, Capella MAM (2013) ABCC1 está relacionada com a Protecção do distal Nephron contra hiperosmolalidade e alta Ambiente de sódio: possíveis implicações para Cancer Chemotherapy. PLoS ONE 8 (6): e68049. doi: 10.1371 /journal.pone.0068049

editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, França |

Recebido: 07 de janeiro de 2013; Aceito: 23 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fonseca et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa de Oncobiologia (FECD /FAF /ONCO II), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Programa de Apoio AOS Núcleos de Excelência (PRONEX). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a multirresistência (MDR) ainda é a principal causa de falha na quimioterapia do cancro. Embora MDR é multifactorial, que se caracteriza principalmente por uma redução dependente de ATP na acumulação de droga intracelular, devido à sobre-expressão de três proteínas pertencentes aos transportadores ABC super-família: P-glicoproteína (ABCB1), proteína de cancro da mama (BCRP ou ABCG2) ou resistência a múltiplos fármacos associada a proteína 1 (MRP1 ou ABCC1). Embora inicialmente observada em células tumorais, estas proteínas também estão presentes em células normais. Em rins, tanto ABCB1 e ABCG2 são expressos na membrana apical de túbulos proximais, sugerindo um papel na secreção de drogas [1], [2].

ABCC1, anteriormente conhecido como MRP1, é uma proteína transmembranar originalmente reconhecida como transportador relacionadas com fenótipo de resistência a múltiplas drogas em algumas células cancerosas [3] – [6], mas estudos subsequentes mostraram que esta proteína é expressa ubiquamente em praticamente todos os órgãos em mamíferos, incluindo seres humanos [7], [8]. Este transportador tem uma grande importância nos processos inflamatórios e dano oxidativo, uma vez que ele transporta tanto glutationa reduzida e oxidada, C4 leucotrienos e prostaglandinas [7], [9]. A sua função fisiológica tem sido estudada em vários órgãos e sistemas e uma das descobertas mais importantes é o facto de que a sua presença é essencial para a resposta hipertensiva a angiotensina II [10].

No entanto, sobre o papel fisiológico de ABCC1 no rim, não é provável que esta proteína apresenta qualquer tipo de papel secretora, devido ao facto de que é restrita a glomérulos e para a membrana basolateral tanto do ramo ascendente grosso da ansa de Henle e a conduta medular recolha de [11 ]. Esta conclusão acabou adiada mais estudos sobre a importância deste transportador em rins, embora algumas evidências apontam para um papel de ABCC1 nos mecanismos de concentração urinária. Por exemplo, a espessura ramo ascendente e túbulos distais são especialmente sensíveis à depleção de GSH promovida por maleato de dietilo (DEM), o qual forma complexos com a GSH, a redução dos níveis intracelulares deste tripéptido. Animais submetidos ao tratamento com DEM apresentaram deficiências concentração urinária graves [12], [13]. Além disso, foi mostrado que induzida por etoposido em abcc1 poliúria (- /-) ratos, o que sugere que esta proteína é de alguma forma associada a reabsorção de água [14]

Vários fármacos anti-cancerígenos são conhecidos para induzir a nefrotoxicidade.. Por exemplo, a nefrotoxicidade induzida por cisplatina, uma droga utilizada na terapia anti-cancro, limita a sua utilização no tratamento do cancro, e várias pesquisas são realizadas para diminuir o efeito adverso [15] – [17]. Além disso, demonstrou-se recentemente que a nefrotoxicidade associada a doxorrubicina, uma droga altamente utilizada na quimioterapia do cancro da mama e outras formas de cancro, é devido a perturbações mitocondriais e genes que regulam a morte celular [18].

Uma vez que é a nefrotoxicidade associado a vários fármacos anti-cancerígenos [19], [20], e uma vez que o papel de ABCC1 no rim permanece sem solução, o presente estudo teve como objetivo reconhecer um possível papel desta proteína nas células renais. Observou-se evidências de que ABCC1 está relacionada com a protecção do néfron distal contra hiperosmolalidade devido a um ambiente de sódio de alta e que GSH é importante para manter a viabilidade das células néfron distal.

Materiais e Métodos

Todos os procedimentos com animais foram previamente analisado e aprovado pelo Comitê animal Assunto do Centro de Ciências da Saúde – UFRJ com o protocolo número 082/2009 IBCCF

Cultura de células

linha de células de embrião de macaco MA104. , as células epiteliais de rim de porco LLC-PK1 e a linha celular epitelial de rim de cão MDCK foram todos obtidos a partir de células do Rio de Janeiro Banco. As células foram cultivadas a 37 ° C em Dulbecco Modified Eagle Médium (Gibco, EUA) com penicilina e estreptomicina (Gibco, EUA) e suplementado com soro de bovino fetal a 10% (Gibco, EUA) e L-glutamina (Gibco, EUA).

o tratamento com osmólitos

para aumentar a osmolalidade do meio de cultura, NaCl 100 mM, ureia 200 mM, manitol 200 mM, ou 50 mM de ureia 100 mM de NaCl (concentrações finais) foram adicionados o meio, elevando a sua pressão osmótica para cerca de 450 mOsm /Kg H

2O. As soluções foram adicionadas, quer gradualmente, ao longo de um período de 72 horas, ou em uma única adição, como descrito nas legendas das figuras.

Ensaio MTT

ensaio colorimétrico

MTT [21] foi usada para avaliar a viabilidade da linha de células MA104 incubadas em meio hiperosmótico. Aproximadamente 2 x 10

4 culas por po foram semeadas em placas de 96 poços. No dia seguinte, NaCl, ureia, manitol ou NaCl + ureia foram adicionados ao meio, como descrito acima. Em algumas experiências butionina-sulfoximina, um inibidor da síntese de GSH (BSO-Fluka, EUA), e MK571, um inibidor ABCC1, também foram adicionados. Após períodos de incubação de 24, 48 ou 72 h, 20 uL de 10 mg /mL azul de tiazolilo tetrazólio (Sigma, EUA) foram adicionados à cultura e as células foram incubadas durante mais 3 h a 37 ° C. No final do tempo de incubação, o sobrenadante foi descartado e 100 mL de dimetilsulfóxido foram adicionados por poço para dissolver o sal de formazano recém-formado. A absorvância foi medida a 490 nm utilizando um leitor de placas de ELISA (Índice de referência, BioRad). Os valores médios foram calculados a partir de 3 experiências independentes.

Trypan Blue Coloração

Outro método usado para acessar a viabilidade celular foi celular contando com a coloração azul de tripano. Neste caso, 1 × 10

5 células /poço foram semeadas em placas de 24 poços e após a incubação com os osmólitos como descrito acima, as células foram contadas num hemocitómetro.

A glutationa

usando um kit comercial monochlorobimane como substrato (Millipore, EUA) foi utilizado para medir os níveis de glutationa (GSH). Para este ensaio, 1 × 10

6 as células foram semeadas em frascos de cultura, tratados como acima descrito, e colhidas com tripsina. GSH ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. níveis de fluorescência foram lidos utilizando um leitor de placa com um conjunto de filtros de 380/460 nm.

ABCC1 Actividade

As células foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com osmólitos como descrito acima. diacetato de carboxi-fluoresceína (CFDA – Molecular Probes, EUA) é uma molécula não fluorescente que é convertido em uma fluorescente, carboxi-fluoresceína (FC) por esterases intracelulares. Esta molécula é um substrato para ABCC1. Portanto, para determinar a actividade ABCC1, as células foram incubadas durante 30 minutos com 2 uM de CFDA (para permitir a absorção do corante, a acção de esterase, e acumulação de CF), lavado com tampão fosfato salino (PBS), para lavar o corante e incubadas durante mais 30 minutos em DMEM CFDA-livre para CF extrusão. As células foram então colhidas com tripsina, lavadas e ressuspendido em solução salina. fluorescência intracelular foi medido num fluxo de Beckton-Dickinson citómetro (FACSCalibur). A análise dos dados foi realizada por meio do software de Cúpula (Dako Inc., EUA).

A marcação com anticorpo anti-ABCC1

As células foram semeadas em placas de 24 poços e o ensaio de marcação foi realizada como descrito em trabalho anterior no nosso grupo [22]. A A23 anticorpo policlonal de coelho (Alexis Biochemicals, EUA) e Alexa Fluor 488 (Invitrogen, EUA) foram usados, respectivamente, como anticorpos primários e secundários fluorescentes.

Western blotting para Tamms-Horsfall Proteína (THP ou Uromodulin) e aquaporin 2 (AQP2)

A expressão de THP e AQP2 foi avaliada por imunotransferência utilizando anticorpos específicos. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma 5 × 10

5 células /poço e incubadas a 37 ° C. Após 48 horas de incubação, o meio de cultura foi aspirado; as células foram lavadas três vezes com PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente, raspadas, e centrifugadas a 14000

g

durante 60 segundos. As células foram então suspensas em tampão de amostra (base de Trisma 0,76% m /v; glicerol 12,56% m /v e de sódio dodecil sulfato de 2,3% m /v; pH 6,8). Depois de homogeneização, uma pequena amostra foi utilizada para a medição de proteína. O tampão foi, em seguida complementado com 0,6% ditio-L-treitol (DTT), 0,5% β-mercaptoetanol, e azul de bromofenol (1 mg /mL). As proteínas foram então sujeitas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) e transferidos para uma membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas com uma solução de bloqueio Ocidental Breeze (Invitrogen, EUA) e incubaram-se com anticorpos específicos contra o THP ou AQP2. A fosfatase alcalina Kit Ocidental Breeze (Invitrogen, EUA), foi usada para visualizar as bandas nas membranas. O C7 subclone da linha celular MDCK foi usada como um controlo positivo para AQP2, uma vez que ele é composto de células principais do ducto de recolha [23]. Outros controles eram extratos de medula renal de ratos e córtex. Para isso, os ratos tiveram Whistar seus rins retirados, dissecados e armazenados a -80 ° C para processamento. Os órgãos foram homogeneizados em seguida, uma solução composta de PMSF (1 mM), sacarose (250 mM), EDTA (1 mM) e imidazolo (20 mM) até se obter um homogenato.

Análise estatística

Cada experiência foi repetida a partir de três a cinco vezes. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e foram analisados ​​utilizando teste t de Student ou ANOVA de uma via com Dunnett ou testes post Bonferroni para comparação das diferenças. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

caracterização de células MA104

Uma vez que não existe uma linha celular humana de néfron distal comercialmente disponíveis, nós tentamos testar se a linha de células de macaco renal MA104 foi originado de néfron distal. Em primeiro lugar, comparou-se a sensibilidade de linhas de células renais três mamífero a ureia: MDCK, uma linha de células de rim canino com características de nefrónio distai [24] – [26]; LLCPK1, uma linha celular renal porcino com características de túbulos proximais [27] e MA104, ainda não caracterizado. As células foram incubadas durante 48 h com várias concentrações de ureia e o número de células e a viabilidade celular foram medidos através de coloração com Azul de Tripano. Como pode ser visto na Fig. 1, as células MA104 são tão resistentes à ureia como as células MDCK, enquanto que as células LLC-PK1 são mais sensíveis.

As células foram semeadas em placas de 24-poços e ureia foi adicionada 24 h depois em várias concentrações. Após 48 h de incubação, o número de células e viabilidade foram medidos por coloração com azul de tripano (n = 4). um – diferente de 37,5 mm (P 0,01); b – diferente de 75 mM (p 0,001).

MDCK é uma linha de células de rim de cão, e há diferenças consideráveis ​​entre cães e seres humanos. Além disso, vários anticorpos criados para os seres humanos não marcar as proteínas do cão. Por outro lado, MA104 é uma linha de células de rim de macaco, e é bem aceite que os primatas não humanos compartilham numerosos características com os seres humanos. Temos anteriormente mostrado que anticorpos contra ABCB1 humana e ABCC1 também marcado esta linha celular [28], [29]. Dado que ABCC1 é expressa apenas nas membranas basolaterais de túbulo distai linear e os epitélios de recolha de condutas [11], e tendo em conta a resistência das células MA104 a ureia, parece provável que essas células veio de nefrónio distai. Portanto, avaliou-se algumas características de segmentos de nefrónios distais nesta linha celular. Os nossos resultados mostraram que células MA104 não apresentou marcação significativa com PNA, um marcador para células intercaladas e não manifestou uromodulin, uma proteína que é expressa apenas no túbulo reto distal, mas expressam AQP2, uma característica da proteína de células principais do colector conduta (Fig. 2). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as células MA104 são originados a partir do tubo colector, o que os torna um bom modelo para estudar o possível papel da ABCC1 na resistência das células renais para hiperosmolalidade.

A. A expressão da proteína em células THP cortical do rim de rato (pista 1) e meldullary (pista 2) e extractos de MA104 (pista 3) na membrana superior e β-actina na membrana inferior; B. Expressão de Aquaporin 2 em células MDCK-C7 (pista 1) e MA104 (pista 2); C e rotulagem D. PNA (100 M) de MDCK-C11 (C) e MA104 (D).

sensibilidade das células MA104 a vários osmólitos

O próximo passo foi determinar o efeito de diferentes osmólitos na sobrevivência de células MA104. osmolalidade meio foi gerado com o cloreto de sódio, ureia ou manitol numa única adição (um choque osmótico) e a viabilidade foi medida pelo ensaio de MTT. A concentração de NaCI utilizada foi previamente determinada como sendo a concentração mínima de NaCl para conseguir o efeito máximo sobre a sobrevivência das células (dados não apresentados). FIG. 3 mostra que a adição de cloreto de sódio reduziu significativamente a sobrevivência celular, enquanto a ureia e manitol teve apenas um pequeno efeito. Este resultado sugere que a viabilidade reduzida das células tratadas com NaCl não é devido à própria hiperosmolalidade, uma vez que o manitol não produzem o mesmo efeito.

Após uma incubação inicial de 24 horas a 37 ° C, foram adicionados a osmólitos o meio de cultura e as células foram incubadas durante 48 horas adicionais. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 3). um – diferente do controlo (p 0,05); b – diferente de NaCl (p 0,01)

Desde NaCl pode afetar várias funções, tais como canais de sódio, canais de cloro, sódio-potássio ATPase etc, e uma vez que não há dados no científico. literatura sugerindo se na

+ ou Cl

– é a principal causa da diminuição da viabilidade celular, decidimos estudar este ponto. Para comparação, utilizou-se cloreto de colina, a qual mantém a mesma força iónica do meio whithout a presença de Na

+. Na Fig. 4 é mostrado que o NaCl e cloreto de colina igualmente reduziu a viabilidade celular, o que sugere que o ião cloreto é a responsável por este efeito.

Após uma incubação inicial de 24 horas a 37 ° C, osmólitos foram adicionados ao meio de cultura e as células foram incubadas durante 48 horas adicionais; A. Células tratadas com NaCl ou NaCl + ureia. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 3). um – diferente do controlo (p 0,05); b – diferente de NaCl a 175 mM (p 0,001) e B. As células tratadas cloreto de colina (como mostrado colina) ou cloreto de colina + ureia (n = 3). um – diferente do controlo (p 0,001); b – diferente de colina 175 mM (p 0,001)

Efeito da uréia na sensibilidade das células MA104 para NaCl e cloreto de colina

Alguns autores observaram que as células protegidas uréia contra. lesão induzida por cloreto de sódio [30]. Como hiperosmolalidade medular no rim é principalmente devido à ureia e NaCl, nosso próximo passo foi investigar um possível efeito protetor da uréia sobre a viabilidade celular sob alta concentração de NaCl. As células foram então submetidas a um choque osmótico com NaCl na presença ou na ausência de ureia. A fim de manter a mesma pressão osmótica do meio, diferentes quantidades de NaCl e ureia foram usadas (a osmolaridade final do meio com ureia mM de NaCl 50 mM 150 foi semelhante ao do meio adicionada com NaCl 175 mM sozinho, aproximadamente 561 mOsm /kg H

2O como medido por um osmómetro). Para efeito de comparação, também foi utilizado cloreto de colina. Pode ser visto na Fig. 4 que as células de ureia protegida submetidas a elevadas de NaCl, mas o efeito da ureia nas células tratadas com cloreto de colina foi muito menos do que a observada para o NaCl. Isto sugere que ambos os íons (Na

+ e Cl

-) participar na morte celular, mas o efeito da ureia é mais pronunciado em um ambiente NaCl, o que está de acordo com o ambiente medular renal. Desde cloreto de colina não é uma osm�ito na medula renal, nós não utilizar esta substância nos seguintes experimentos.

níveis intracelulares de GSH em células MA104 Tratados com osmólitos

Existem várias evidências de que NaCl chumbo a danos oxidativos [31], [32]. Uma vez que a GSH é um dos mais importantes moléculas intracelulares relacionados com a protecção contra o stress oxidativo [33], os níveis de GSH intracelular foram avaliadas em células MA104 após o tratamento com os osmólitos. Para este ensaio, os osmólitos foram adicionados de uma forma gradual, ao longo de 72 horas e o conteúdo de GSH foi medida. Na Fig. 5 é mostrado que o tratamento de células com NaCl causou um aumento significativo (cerca de 50%) dos níveis intracelulares de GSH reduzidos em células MA104. Ureia sozinhos não alterou o conteúdo intracelular de GSH, mas em sentido inverso o aumento de GSH observada em células tratadas com NaCl. Para testar se esta elevação nos níveis de GSH pode estar relacionado com a sobrevivência da célula, utilizou-se BSO, um inibidor da sintase de glutationa, o que prejudicaria a esta elevação nos níveis de GSH. As células foram pré-incubadas com BSO antes dos tratamentos com NaCl ou ureia. Como esperado, a inibição da síntese de GSH pela BSO reduzida em 50% a sobrevivência das células tratadas com NaCl, mas não alterou a de células tratadas com ureia ou ureia + NaCl (Fig. 6), sugerindo que a morte celular na presença de ureia NaCl + ocorre por uma forma diferente do que com NaCl sozinho e não é dependente de GSH.

células foram incubadas, conforme indicado na Figura 4 e os níveis intracelulares de GSH foram medidos tal como descrito em materiais e métodos. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 8); p 0,05 (a – diferente tanto de controlo e ureia)

Após uma incubação inicial de 24 horas a 37 ° C, BSO (1 mM) foi adicionado ao meio de cultura e após 24 horas. de incubação osmólitos foram adicionados à cultura e as células foram incubadas durante mais 48 horas. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 3); p 0,05. (A – diferente de NaCl).

A expressão de ABCC1 em células MA104 Tratados com osmólitos

Uma vez que a manutenção dos níveis de GSH intracelular está intimamente associado com o transporte ABCC1 [34], [ ,,,0],35] e dado que MA104 e células do ducto coleta expressar ABCC1 [14], [22], nos próximos experimentos procuramos estudar um possível papel do ABCC1 na resposta das células MA104 de NaCl e uréia. No entanto, ao realizar citometria de fluxo, observou-se que o chumbo NaCl a alterações na granularidade da célula (visto por alterações no lado espalhamento-SSC), sem alterações no volume da célula (visto por alterações na frente espalhamento-FSC), como pode ser visto na Fig . 7A. Portanto, estudou primeiramente tais alterações. Para fazer isso, as células foram separadas em duas regiões: a região R1, contendo as células com SSC normal e R2 região contendo as células com alto SSC (Figura 8A).

células foram incubadas durante 96 horas a 37. ° C com os osmólitos. A – gráficos de pontos que mostram a diferença entre dispersão para a frente (FSC) e espalhamento lateral (SSC), representando, respectivamente, do volume da célula e granularidade. B – Percentagem de células que exibem granularidade normal para cada grupo de tratamento. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 4); (A – diferente do controlo; p 0,001 e b- diferente de NaCl; p 0,01).

As células foram incubadas com os osmólitos durante 96 horas a 37 ° C. As células foram então marcadas com o anticorpo anti-ABCC1 e a expressão desta proteína foi analisada por citometria de fluxo. Cada grupo de tratamento foi dividido em dois subgrupos de acordo com valores de SSC. A – histogramas que mostram as duas subpopulações (SSC normal e alta) para cada condição e B – Porcentagem de células ABCC1 positivo de ambas as subpopulações SSC normal e alto. Os resultados são expressos como média ± EP (n = 5). um – diferente do controlo (p 0,01) e diferente da de NaCl b-; p . 0,01)

Na Fig. 7B mostra-se que 90% das células de controlo têm SSC normal e que o tratamento durante 72 h, com ureia isoladamente não alteram granularidade da célula. No entanto, NaCl aumentou muito este parâmetro, com quase metade da população com maior SSC. Além disso, a ureia reverteu essa alteração, uma vez que 76% das células submetidas a NaCl + uréia foi na região com SSC normal e isso não foi estatisticamente diferente a partir de células de controlo. Embora este aumento na granularidade célula poderia ser devido a um volume da célula reduzida, devido à queda do teor de água das células, não poderíamos observar isso. O FSC de células submetidas a todos os tratamentos foram semelhantes aos das células de controlo, sugerindo que não houve alteração no volume da célula depois de um tratamento prolongado com NaCl, ureia ou ureia NaCl + (Fig. 7A).

Em vista do observado efeitos de tratamento em SSC NaCl, para o estudo da expressão e actividade ABCC1 separamos as células em duas regiões, uma relacionadas com células com SSC normal e a outra relacionada com células com alto SSC. Os resultados representados na Fig. 8 mostrou que, para as células com SSC normais, aproximadamente 85% das células de controlo expressar ABCC1. Esta percentagem é reduzida para cerca de 50% em células tratadas com NaCl, e ureia não inverter esta. Para as células com alto SSC, a percentagem de células que expressam ABCC1 é cerca de 50% em células de controlo. NaCl este aumento para cerca de 92%, e ureia alterou esta, retornando os valores próximos para as células de controlo (54%).

O passo seguinte foi o de estudar a actividade ABCC1 por citometria de fluxo. Ao fazer isso, observou-se que as células de controlo de acumular muito mais CF (um substrato comum usado para ABCC1) do que as células tratadas com osmolytes, provavelmente porque o hiperosmolalidade da mídia com NaCl, ureia e NaCl + ureia dificultado a captação celular dos corantes ( A Fig. 9). Embora este prejudicou a comparação das células tratadas com osm�ito com células de controlo, ainda poderíamos comparar células com SSC normal ou alta dentro do mesmo tratamento. Portanto, na Fig. 10 é mostrada a acumulação e o efluxo de células tratadas com NaCl normal (Fig. 10A e 10B) e SSC elevada (Fig. 10C e 10D). Pode ser visto que a captação celular de CFDA foi semelhante independentemente do normal ou alta SSC (Fig. 10A e 10C). No entanto, o efluxo de corante fluorescente de células com alto SSC estava quase completa (Fig. 10D), enquanto que em células normais com SSC aproximadamente 50% das células não efluxo do corante (Fig. 10B). Por outro lado, as células tratadas com NaCl + ureia foram igualmente capazes de efluxo de corante, independentemente normal ou alta SSC (fig. 11b e 11d).

população total de células foi incubada durante 96 horas a 37 ° C com os osmolitos e a fluorescência celular, que mostram a acumulação de CF após 30 min de incubação foi medida como descrito em materiais e Métodos. O painel A mostra a acumulação de CF em células de controlo, tal como evidenciado pela elevada fluorescência. Os painéis B, C e D mostram a acumulação de CF em células tratadas respectivamente com NaCl, ureia ou NaCl + ureia. Histogramas representativos de 3 experiências diferentes.

As células foram incubadas com NaCl durante 96 horas a 37 ° C e a actividade de ABCC1 foi medida como descrito em Materiais e Métodos. Após a análise, as células foram divididas em dois subgrupos de acordo com os valores de dispersão lateral. painéis da esquerda: CF acumulação pelas células com normal (A) e alta (C) SSC; painéis da direita: CF efluxo a partir de células com normal (B) e alta (D) ES. representante histogramas de 3 experiências diferentes. Os valores de cada painel referem-se a percentagem de células com fluorescência, o que significa que as células que se acumulam CF (nos painéis A e C) e as células que não foram capazes de efluxo de corante após 30 minutos em meio isento de corante (em painéis B e D).

as células foram incubadas com NaCl + ureia durante 96 horas a 37 ° C e a actividade de ABCC1 foi medida como descrito em materiais e Métodos. Após a análise, as células foram divididas em dois subgrupos de acordo com os valores de dispersão lateral. painéis da esquerda: CF acumulação pelas células com normal (A) e alta (C) SSC; painéis da direita: CF efluxo a partir de células com normal (B) e alta (D) ES. Histogramas representativos de 3 experiências diferentes.

Discussão

MA104 é uma linha de células derivadas de rim de embriões de macacos africanos [36]. É expressa várias características das células epiteliais polarizadas, tais como a formação de “cúpulas”, o estabelecimento de uma resistência eléctrica e maturação transmonolayer polarizada de vírus com envelope [37]. Mostrámos previamente que esta linha celular expressa pelo menos duas proteínas relacionadas com a resistência a múltiplas drogas, ABCB1 e ABCC1 [28], [29], [38]. No presente estudo, caracteriza ainda mais essas células, e parece muito provável que MA104 originado de ducto coletor, provavelmente células principais. Tal caracterização é importante para estabelecer esta linha de célula como um modelo para o estudo de ABCC1 no rim.

Uma vez caracterizado, mostrou que o aumento da osmolalidade em função de NaCl ou cloreto de colina (mas não ureia) causou uma diminuição na o crescimento celular. Além disso, a ureia a partir de células protegidas a inibição do crescimento ou morte celular induzida pelo cloreto de NaCl, mas não de colina (Fig. 3-4). Estes resultados estão de acordo com outros autores, que mostraram que a ureia pode reverter o efeito deletério atribuída a NaCl [30]. Também tem sido mostrado que, embora a ureia possa induzir a lesão oxidativa, é também capaz de activar os mecanismos de protecção contra tais danos oxidativos, e que os mecanismos de protecção de NaCl também activados, mas apenas quando foi gradualmente adicionada ao meio de [39], [ ,,,0],40]. No entanto, os mecanismos através dos quais ocorrem estes efeitos ainda não são compreendidos. O processo exato pelo qual NaCl provoca redução na viabilidade celular ainda é desconhecida. Alguns autores parecem concordar que altas concentrações de NaCl causar interrupção do ciclo celular. Ambos Michea e Kultz alegação de que mIMCD sofrer parada do ciclo celular em G2 após incubação com concentrações de cloreto de sódio, levando à proliferação reduzida [41], [42]. Dimitrieva adiciona a este pedido, mostrando que os níveis de p53 aumentam rapidamente em células mIMCD3 após incubação com cloreto de sódio, reduzindo a proliferação de células no primeiro momento [43]. Um estudo posterior sugere novamente que o NaCl induz uma redução na proliferação, agora devido a um aumento na expressão de Egr-1, o que serviria como um estímulo para a diferenciação [44]. Kultz [45] alega ainda que NaCl em concentrações elevadas leva a quebras de fita dupla do DNA, que poderiam ser causados ​​por radicais livres. Além disso, Zhou e Zhang concorda que a alta NaCl provoca um aumento da ROS e consequentemente dano oxidativo [46], [47]. Tal como está, a evidência parece apontar que a redução da viabilidade tende a apontar para o estresse oxidativo como um ponto de partida.

A proteção oferecida por uréia é tão controversa quanto é NaCl induzida danos. Um estudo sugere que a própria ureia leva ao aumento nos ROS, mas também é capaz de induzir a expressão de heme oxigenase-1 (HO-1) em células de rim, o qual pode incluir parte da adaptativa ou sistema de protecção para hiperosmolaridade [40]. Zhang et ai, mostra que a adição de ureia para as células tratadas NaCl leva à inibição da actividade de caspase-3 [30]. Além disso, Santos mostrou que as células de rim de medula interna tratados tanto com NaCl e ureia mostraram um aumento no HSP70 que se correlaciona com o aumento da osmolaridade. Os autores sugerem que este achado, associado com a redução da proliferação vista nas células tratadas poderia ser parte do mecanismo de protecção que permite que as células sobrevivam na medula do rim [48]. Tomados em conjunto, os dados sugerem que, apesar de NaCl (e, em alguns modelos, ureia) leva a um aumento na ROS e consequente dano de ADN, um tratamento concomitante com ureia conduz à activação dos mecanismos de resposta, tais como expressão chaperona que conduz à protecção de ADN. No entanto, os nossos resultados mostraram que a protecção de ureia é contra danos induzidos por Na principalmente

+ iónica e não necessariamente de NaCl. Isto sugere que as novas investigações são necessários para compreender tanto o efeito letal de NaCl e ureia e a interacção entre esses dois componentes em medula renal.

Dado que a GSH é a principal molécula antioxidante não enzimática, estudámos os níveis de GSH intracelular de células tratadas com NaCl e /ou ureia. Observou-se que o NaCl, mas não ureia, aumentou os níveis de GSH intracelular e que a ureia inverteu o aumento nos níveis de GSH em células tratadas com NaCl (Fig. 5). O aumento no conteúdo de GSH em NaCl tratada células pode ser devido à inibição da actividade ABCC1 ou expressão, mas também poderia ser devido a um aumento do estresse oxidativo. Além disso, BSO reduzida em 50% a sobrevivência das células tratadas com NaCl, mas não alterou a sobrevivência das células tratadas com ureia ou ureia + NaCl (Fig. 6). [30].