Abstract

Purpose

miRNAs pode regular os processos biológicos, incluindo diferenciação, proliferação e apoptose. DICER e Drosha são dois membros da família de RNase III, jogando um papel central na via de miRNAs biogênese. Neste estudo, a hipótese de que as variações genéticas dos genes Dicer e Drosha foram associados com o risco de câncer de bexiga.

Experimental Design by

Foi realizado um estudo de 685 casos de câncer de bexiga de caso-controle e 730 controles para investigar a associação entre os sete SNPs funcionais de

DICER Comprar e

Drosha

genes e risco de câncer de bexiga. Em seguida, avaliamos a funcionalidade dos SNPs importantes

Resultados

Nós descobrimos que rs10719T . C polimorfismo localizado na região 3 ‘não traduzida (UTR) do

gene Drosha

foi associado com o aumento do risco de cancro da bexiga. A análise estratificada sugeriu que rs10719TC /CC genótipo pode aumentar o risco de cancro da bexiga entre os pacientes do sexo masculino (OR ajustado = 1,34, 95% CI = 1,05-1,70,

P

= 0,018), e nunca fumantes (1,56, 1.14- 2.14, 0.006), em comparação com o genótipo TT. Além disso,

Drosha

rs10719T polimorfismo C foi previsto para regular a actividade de ligação do conjugado de HSA-miR-27a /b. Luciferase relatou ensaio de gene confirmou que rs10719 T à substituição G interrompeu o sítio de ligação para HSA-miR-27b, resultando o aumento dos níveis de proteína Drosha.

Conclusões

No seu conjunto, estes resultados sugerem que

Drosha

rs10719T . C polimorfismo pode ser associado com o risco de cancro da bexiga em uma população chinesa, e hsa-miR-27b pode influenciar a expressão da proteína Drosha por ligação com 3’UTR

Citation : Yuan L, Chu H, Wang M, Gu X, Shi D, Ma L, et al. (2013) Variação genética em

Drosha

3’UTR Regulado por hsa-miR-27b está associado com cancro de bexiga de Risco. PLoS ONE 8 (11): e81524. doi: 10.1371 /journal.pone.0081524

editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de junho de 2013; Aceito: 14 de outubro de 2013; Publicação: 28 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela National Natural Science Foundation da China (81230068, 30901166, 81202268 e 81102089), Natural Science Foundation da província de Jiangsu (BK2011773 e BK2011775), o Programa chave de Pesquisa básica de Jiangsu Departamento Provincial da Educação (11KJB330002 e 12KJA330002) , Jiangsu Provincial Six Projeto Talento Peaks (2012-SWYY-028), Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da Educação Superior (20123234110001), Jiangsu Provincial Graduados Projeto Inovador (CXZZ12_0594), o Projeto Qing-Lan de Jiangsu Departamento Provincial da Educação, ea prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (Saúde Pública e Medicina preventiva). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga por aproximadamente 2% de todos os tumores malignos humanos com uma estimativa de 72,570 novos casos e 15.210 mortes nos EUA, só em 2013 [1]. Na China, a incidência global de cancro da bexiga registrada foi de 7,49 /100.000 em 2008, e a incidência de cancro da bexiga estava subindo durante 1998-2008 (taxa de crescimento média por ano, 4,60%) [2]. Mais de 90% do cancro da bexiga é o carcinoma de células transicionais. A incidência de cancro da bexiga é geralmente elevada nos EUA e na Europa, mas baixa na Ásia. Como outros cânceres comuns, câncer de bexiga é uma doença complexa causada por ambos os fatores de risco genéticos e ambientais. Fumar cigarros, ocupacional e exposições ambientais são fatores de risco conhecidos bem estabelecidos para o câncer de bexiga [3]. Tem sido relatado que a mutação de FGFR3 foi associada com a bexiga de baixo grau do tumor e estágio, e as mutações de TP53 e FGFR3 mostrou uma relação inversa [4-6]. Recentemente, vários estudos de associação do genoma (GWAS) com repetições identificaram que as variações genéticas comuns estão associados com a susceptibilidade ao cancro da bexiga [7-11]. Tang et al. também identificaram que uma variante de codificação incomum de

UGT1A

loco (GWAS relacionado) pode afetar

UGT1A

expressão de mRNA e diminuir o risco de cancro da bexiga [12], no entanto, os mecanismos exatos da bexiga cancer não ser esclarecidas.

os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos não-codificantes moléculas de RNA de ~ 22 nucleotídeos, que regulam a expressão de genes em nível pós-transcricional através da ligação região 3 ‘não traduzida (UTR ) de genes alvo de ARNm [13]. miARNs são gerados numa via de processamento de dois gradual mediada por dois enzimas principais (Dicer e Drosha): No núcleo, os precursores mais longos são transformados em RNAs primárias (pri-miARNs) pela RNase II e, em seguida, pri-miARNs são processados ​​pela enzima RNase (Drosha) em precursores (pré-miRNAs) com uma estrutura de haste-laço [14,15]. Os pré-miRNAs são exportados a partir do núcleo para o citoplasma pela proteína exportina-5. No citoplasma, pré-miARNs são processadas em miARNs maduros por uma outra enzima RNase (DICER). Os miARNs maduras desempenham papéis mediante a incorporação no complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC) [16]. Tem sido sugerido que miARNs são previstos para regular de 30% dos genes humanos [17]. Recentemente, vários estudos mostraram que miARNs poderia actuar como oncogenes e supressores tumorais, visando 3’UTR de genes importantes [18,19] e os variantes genéticas em 3’UTR dos genes miARN alvo poderiam afectar a regulação de genes mediada por miARN, eventualmente resultando o aumento do risco de cancro [19,20]. Vale a pena notar que DICER e Drosha desempenhar o papel crucial na carcinogênese. Evidências acumuladas mostram que o desequilíbrio

DICER

e

Drosha

níveis de expressão estão associados com o risco de cancro da bexiga [21-23]. Recentemente, Han e seus colegas também descobriram que

DICER

e

Drosha

níveis de expressão foram regulados positivamente em tecidos de cancro da bexiga em comparação com os tecidos da bexiga normais correspondentes, e silenciando DICER ou Drosha pode inibir células a proliferação e induzir a apoptose de células [24]. Aqui, propomos que se justifique, para investigar os papéis do

DICER

e

Drosha

na susceptibilidade ao câncer de bexiga.

Até agora, vários estudos têm investigado a associação entre as variantes genéticas do

DICER

e

Drosha

genes e risco de doenças. Lin et ai. informou que o

DICER

e

Drosha

haplótipos foram associados com a sobrevivência alterada e recorrência do paciente carcinoma de células renais em caucasianos [25]. No entanto, as variantes genéticas do

DICER

e

Drosha

não foram associados com o desenvolvimento de carcinoma de células renais [26]. Além disso, Yang et ai. Também observamos o resultado similar do cancro da bexiga em caucasianos [27]. Recentemente, Qin et ai. mostrou que o

DICER

e

Drosha

polimorfismos pode modificar o risco de parâmetros seminais anormais e ser associado com a infertilidade masculina chinesa [28]. Tomados em conjunto, temos a hipótese de que as variantes genéticas do

DICER

e

Drosha

também ser associado com a susceptibilidade ao cancro da bexiga em uma população chinesa.

Com base essa postulação, foram selecionados sete polimorfismos de

DICER

(rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC e rs3742330AG) e

Drosha

(rs2291109AT, rs10719TC e rs642321CT) para avaliar a associação entre as variantes genéticas

DICER Comprar e

Drosha

genes eo risco de cancro da bexiga. Neste estudo, verificou-se que

Drosha

3’UTR polimorfismo rs10719TC pode aumentar o risco de cancro da bexiga em uma população chinesa, que foi localizado perto de um local de ligação miRNA. Além disso, foi realizada uma série de ensaios funcionais em

Drosha

3’UTR polimorfismos para revelar seu mecanismo molecular.

Materiais e Métodos

Os sujeitos do estudo

No presente estudo, foram incluídos 685 histologicamente confirmados carcinoma de células transicionais da bexiga e 730 controles sem câncer. sujeitos do estudo incluídos foram recrutados a partir do Primeiro Hospital Filiado e Huai-An Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing, província de Jiangsu e Hospital de Medicina Tradicional Chinesa (MTC), entre janeiro de 2003 e janeiro de 2010. O método detalhado de temas de estudo de recrutamento para o estudo teve sido descrito anteriormente [29]. diagnóstico patológico para o estágio do tumor da bexiga foi de acordo com o 2002 Internacional Cancer Union Against tumor-nós-metástase classi fi cação e da Organização Mundial da Saúde 1973 classificação do papiloma urothelial foi utilizado para definir o grau de cancro da bexiga: bem diferenciado (grau 1, G1), moderadamente diferenciados (grau 2, G2) ou pouco diferenciado (grau 3, G3). doentes com cancro da bexiga foram excluídos, se o que tinha câncer anterior, metástase de câncer a partir de outra origem, radioterapia prévia ou quimioterapia. Os indivíduos sem câncer foram recrutados os que estavam a procura de cuidados de saúde nos ambulatórios no hospital. Os controles sem câncer foram pareados por idade (± 5 anos) e sexo dos casos, que foram geneticamente relacionada aos casos e não tinham história individual de câncer, incluindo câncer de pele melanoma. Os indivíduos sem câncer que tinham sintomas sugestivos de câncer de bexiga, tais como hematúria, foram excluídos. Utilizou-se um breve questionário para obter a informação demográfica e fator de risco dos sujeitos incluídos. Neste estudo, definiu-se cada vez fumantes (ex e atuais fumantes) com base na condição de fumar. Os indivíduos que fumavam diariamente por 1 ano, foram definidos como nunca fumantes. Nunca fumantes que haviam parado de fumar por 1 ano foram definidos como ex-fumantes e os demais como fumantes atuais. Este estudo de caso-controle foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Médica de Nanjing. Todos os indivíduos assinaram consentimentos informados, e cada sujeito doou 5 ml amostra de sangue para extração de DNA genômico.

SNPs selecionando e genotipagem

Neste estudo, foram estudadas as variantes genéticas de

DICER

e

Drosha

genes que desempenham papéis importantes na biogênese miRNA. Aqui, nós nos concentramos em estudar os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que medem esses dois genes (HapMap Data Release 27), incluindo 2 kb a montante e 2 kb a jusante usando o software Haploview [30]. Os seguintes critérios devem ser incluídos: (i) os SNPs deve estar localizado em “região flanqueadora 5 ‘da UTR 5, 3’UTR, e região com alterações de aminoácidos que codifica, (ii) menor frequência de alelos (MAF) 5% em Han chinês em Pequim (CHB). De acordo com os critérios, quatro SNPs foram identificados em

DICER

(rs12323635, rs13078, rs1057035 e rs3742330) e três SNPs em

Drosha

(rs2291109, rs10719, e rs642321).

o ADN genómico foi extraído a partir de linfócitos de sangue periférico do sujeito. Os incluídos sete SNPs foram genotipados em todos os 1415 indivíduos usando o MGB TaqMan sonda Assay (7900HT Tempo real Sistema de PCR, a Applied Biosystems, Foster City, EUA). Cerca de 10% das amostras foram seleccionados aleatoriamente para a genotipagem repetido para validação, e os resultados foram de 100% concordante. Genótipo análise foi realizada por duas pessoas, independentemente, de forma cega e os controlos foram incluídos em cada placa para assegurar a precisão da genotipagem. No entanto, várias amostras falhou na genotipagem foram devido a qualidade do DNA, e gostaríamos de excluí-los nas análises posteriores. Quadro 1, desde a informação primária dos selecionados sete SNPs.

Gene (acesso.) E lócus

NCBI rs não.

Posição

a

Localização

alteração Base de Dados

MAF

P Compra de HWE

c

taxa de Genotipagem (%)

HapMap

b

caso

Controles

DICER

(NM_030621) 14q31rs1232363595625711promoterC T0.3330.3760.3780.06798.2rs13078955567473’UTRT A0.0560.0570.0610.13199.1rs1057035955541423’UTRT C0.1110.1120.1100.741100.0rs3742330955533623’UTRA G0.2670.3310.3320.25799.6

DROSHA

(NM_013235) 5p14-p13rs229110931532301promoterA T0.2110.2190.2340.062100.0rs10719314014473’UTRT C0.2330.2820.2430.43799.7rs642321314010033’UTRC T0.4670.4740.5050.655100.0Table 1. A informação primária de SNPs genotipados.

Posição aSNP no NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).bMAF dos bancos de dados HapMap (https://www.hapmap.org) .cHWE

P valor

no grupo de controle. CSV Baixar CSV

análise bioinformática de

Drosha

3’UTR

Com base na análise bioinformática, previmos que hsa-miR-27a /b podem se ligar com a região 3’UTR de

Drosha

usando quatro sites comuns (alvo da análise: https://www.targetscan.org/~~number=plural, Miranda: https://www.microrna.org/~~number=plural, Microcosmo: https://www.ebi.ac metas .uk /Enright-SRV /microcosmo /cgi-bin //v5 /genome.pl, e pita: https://genie.weizmann.ac.il/~~number=plural) (Figura 1A). Considerou-se que a combinação destas abordagens iria reduzir grandemente a possibilidade de falsos positivos.

(A) Drosha 3’UTR foi previsto um local de ligação para HSA-miR-27a /b. A sequência de HSA-miR-27a e hsa-miR-27b só tinha uma diferença de base (sublinhada). A digitalização de cerca de ± 100 pb regiões do local de ligação, que só se encontra rs10719T que C foi localizado nesta região. Prever efeito da variação alélica em rs10719 em HSA-miR-27a /b reconhecimento e a construção de pGL3-Drosha 3’UTR-T /C contendo o gene de luciferase Renilla e 3’UTR de comprimento completo do gene Drosha com diferentes alelos de rs10719 ( seta: T substituição C). (B, C) Os ensaios de repórter de luciferase para medir rs10719T ou alelo C diferença com a presença ou a interferência de HSA-miR-27a /b. Em (B), células T24 semeados em placas de 24 poços foram transientemente co-transfectadas com constructos e HSA-miR-27a /b imita ou controlo negativo estável (NC). Em (C), as células J82 semeadas em placas de 24 poços foram transientemente co-transfectadas com constructos e HSA-miR-27a /b inibidores ou inibidores NC. Os resultados são apresentados como a actividade de luciferase relativa em relação NC. Os dados foram de três experiências de transfecção independentes.

**,

P Art 0,05.

reversa em tempo real quantitativa de transcrição-PCR (RT-PCR)

A fim de avaliar o nível de expressão endógena de hsa-miR-27a /b, quatro bexiga linhas celulares de cancro (EJ, T24, J82, 5637) e inoculadas em 20 cm

2 placas foram submetidos a extracção do ARN total isolado a partir de células utilizando Trizol Reagent (Invitrogen, CA, EUA). Tabela S1 no arquivo S1 mostrou a primers informações de hsa-miR-27a /b e U6. As reacções de transcriptase reversa (10 ul) continham 2 ul de ARN total (500 ng /uL), 1 ul de tampão 10 × AMV RT, 10 pmol de cada um dos dNTP (Toyobo, Tsuruga, Japão), 0,75 ul de anti-sentido anelada mistura de iniciador, 0,25 U /ul de ARNase Inibidor (Toyobo, Tsuruga, Japão), 1U /ul de AMV transcriptase reversa. A mistura foi incubada a 16 ° C durante 15 min, 42 ° C durante 60 min, e 85 ° C durante 5 min. Em seguida, Applied Biosystems 7900HT Tempo real sistema de PCR foi utilizado para realizar a quantificação em tempo real de PCR (ABI, CA, EUA) com base no método de SYBR-Green (Toyobo, Tsuruga, Japão). Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Dobre mudanças foram normalizados para os níveis de U6 expressão

Para a detecção da correlação entre os níveis de

Drosha

mRNA e rs10719 T . Polimorfismo C

in vivo

, um total de 61 tecidos de tumor da bexiga com genótipos diferentes (32, 24 para TT por TC, e 5 para os genótipos CC) foram submetidos a extracção do ARN total utilizando Trizol Reagent (Invitrogen, CA, EUA). tecidos de tumores de bexiga foram conservadas em azoto líquido depois de ter sido retirado do corpo. O ARN total foi avaliada por ambas as reacção de transcriptase reversa e PCR em tempo real quantitativo com base no método de SYBR-Green (Toyobo, Tsuruga, Japão). O cDNA foi utilizado para a amplificação de

Drosha

gene e um gene de controlo endógena

GAPDH. O primers informações de

Drosha

e

GAPDH

genes foram incluídos na Tabela 1. Alterações Fold foram normalizados pelos níveis de expressão

GAPDH

e cada ensaio foi realizado em triplicado .

Drosha

3’UTR contendo rs10719TC construções de gene repórter e ensaios de repórter de luciferase

Para construir os plasmídeos repórter luciferase de

Drosha

3’UTR,

Drosha

fragmentos 3’UTR (937bp) que transportam o alelo principal rs10719T foram amplificados por PCR. Os iniciadores foram 5′-ACCTTGGTACCCCAGATGAGACTGAAGACATC-3 ‘(directo) e 5′-ACCTTCTCGAGGCACTCACTATATATTTGCTG-3′ (inverso). Os produtos de PCR foram extraídos e separados por gel de agarose, que foram clonados com kit de clonagem TA (Invitrogen, CA, EUA). Além disso, o fragmento contendo o alelo menor rs10719C foi efectuada utilizando os seguintes iniciadores: 5’-TAGTTTTCCTGCAGACAATGAACGAAGTGTGC-3 ‘(directo) e 5′-TTTATTTCAATGAGCACACTTCGTTCATTGTC-3’ (inverso). Finalmente, o fragmento amplificado realização alelo T ou C foi inserido a jusante do gene da luciferase em pGL3-um plasmídeo promotor e, em seguida, foi realizado o plasmídeo contendo T ou alelo C, que foram confirmados por sequenciação.

Para repórter de luciferase ensaio, as células T24 e J82 foram colocadas em placas de 24 poços (1 × 10

5 células por poço) e, em seguida, co-transfectado com pGL3-

Drosha

3’UTR-T ou pGL3-

Drosha

3’UTR-C e pRL-SV40 (50: 1). Os imitadores e inibidores de HSA-miR-27a /b e os seus controlos negativos (GenePharma, Xangai, China) foram co-transf ectadas com os plasmídeos repórter a uma concentração final de 20nmol /ul. Quarenta e oito horas após a transfecção em células T24 e J82, a actividade da luciferase nos lisados ​​foi medida com um duplo-Luciferase Reporter Assay System (Promega, WI, EUA) e normalizados contra a actividade da PRL-SV40. Os ensaios foram seguidos por sugestões do fabricante. experiências em triplicado independentes foram realizadas para cada construção de plasmídeo.

A análise estatística

O equilíbrio de Hardy-Weinberg da distribuição dos genótipos entre os controles foi aplicado usando uma bondade-de -Fit χ

2 teste. As distribuições das variáveis ​​demográficas selecionadas entre os casos e controles de freqüência foram testados usando χ

2 de teste. odds ratio específicas de genótipo (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados por análise de regressão logística uni e multivariada incondicional. O ajuste multivariada incluiu o status de idade, sexo e tabagismo (nunca e sempre fumando). Além disso, foram utilizados Kruskal-Wallis ANOVA one-way para analisar os resultados do

Drosha

expressão de mRNA

in vivo

. Neste estudo, a expressão do gene repórter de luciferase relativa para o alelo T ou C foi calculado separadamente.

t

teste de Student foi utilizado para avaliar as diferenças nos níveis de expressão do gene repórter luciferase entre os subgrupos. Todos os testes foram em frente e verso usando o software SAS (versão 9.1; SAS Institute, Inc, Cary, NC, EUA) e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Estudo de associação entre os polimorfismos de

DICER

e

Drosha Comprar e cancro da bexiga risco

as características dos pacientes com carcinoma de células transicionais 685 bexiga e 730 controles estão resumidos na Tabela 2. Aqui, não se observou diferença estatística na distribuição da idade (

P

= 0,144) e sexo (

P

= 0,825) entre pacientes e controles. No entanto, havia mais que nunca fumantes (55,6%) entre os pacientes mais do que entre os controles (38,4%), e esta diferença foi estatisticamente significativa (

P Art 0,001). Essas variáveis ​​foram ajustadas para a análise de regressão logística multivariada subsequente. Dos 685 casos, havia 315 de tumor de grau 1 (46,0%), o grau do tumor 261 2 (38.1%) e o grau do tumor 109 3 (15,9%) pacientes. Casos Além disso, 435 (63,5%) tinham tumores superficiais e restantes 250 (36,5%) tinham tumores invasivos.

Variáveis ​​

(n = 685)

Controls (n = 730)

P

a

N

%

N

%

Idade ≤ 6532948.037951.90.144 6535652.035148.1Sex Male55480.958780.40.825 Female13119.114319.6Smoking estatuto Never30444.445061.6 0,001 estágio Ever38155.628038.4 Former17225.1729.9 Current20930.520828.5Tumor grau G131546.0 G226138.1 G310915.9Tumor Superficial (PT

a-pT

1) 43.563,5 Invasiva (PT

2-Pt

4 ) 25036.5Table 2. as distribuições de freqüência de variáveis ​​selecionadas entre os casos de câncer de bexiga e controles sem câncer.

atwo-sided χ

2-teste para a distribuição de frequência das variáveis ​​selecionadas entre os casos de câncer de bexiga e controles sem câncer CSV Baixar CSV

os sete frequências SNPs dos genótipos entre o controle estavam de acordo com os equilíbrios de Hardy-Weinberg (

P Art 0,05; Tabela 1). Como mostrado na Tabela 3, observou-se que indivíduos com os (genótipos TC e CC)

Drosha

rs10719C alelo 3’UTR teve um CI 1,24 vezes maior risco de cancro da bexiga (OR ajustado = 1,25, 95% = 1,01-1,55,

P

= 0,041) em comparação com o genótipo rs10719TT. Entretanto, observou-se que a distribuição de genótipos rs10719TC entre os casos e controles apresentaram diferença significativa (

P

= 0,017). No entanto, não foram observadas diferenças significativas na distribuição dos genótipos do

DICER

rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, rs3742330AG e

Drosha

rs2291109AT, polimorfismos rs642321CT entre os casos e controles (todo o

P

0,05, tabela 3). Nós avaliamos o efeito do incluídos sete polimorfismos no risco de câncer de bexiga estratificando por status sexo e tabagismo. Como mostrado na Tabela S2 no arquivo S1, descobrimos que o polimorfismo rs10719TC pode aumentar o risco de cancro da bexiga entre os pacientes do sexo masculino (OR ajustado = 1,34, 95% CI = 1,05-1,70,

P

= 0,018), e sempre fumantes (OR ajustado = 1,56, 95% CI = 1,14-2,14,

P

= 0,006).

interações genótipos

Cases

Controls

bruto ou (IC 95% )

OR ajustado (95% CI)

a

P

a

P

b

N

%

N

%

DICER

rs12323635CT680710CC26639.128640.31.00 (Referência) 1,00 (referência) 0.887CT32147.231143.81.11 (0.88-1.40) 1,09 (0.86-1.37) 0.485TT9313.711315.90.89 (0.64-1.22) 0,88 (0.63-1.22) 0.441CT /TT41460.942459.71.05 ( 0.85-1.20) 1,03 (0.83-1.28) 0.793rs13078TA679723TT60388.864088.31.00 (referência) 1,00 (referência) 0.640AT7511.17810.81.02 (0.73-1.43) 0,99 (0.70-1.39) 0.937AA10.250.70.21 (0,03-1,82 ) 0,30 (0,03-2,57) 0.271AT /AA7611.28311.50.97 (0.70-1.35) 0,95 (0.68-1.33) 0.768rs1057035TC685730TT54880.057779.01.00 (referência) 1,00 (referência) 0.857TC12017.514519.90.87 (0,67-1,14) 0,88 (0,67-1,16) 0.371CC172.581.102.34 (0,96-5,23) 2,36 (1,00-5,59) 0.051TC /CC13720.015321.00.94 (0,73-1,22) 0,96 (0,74-1,25) 0.753rs3742330AG683727AA30244.233145.51.00 (referência ) 1,00 (referência) 0.942AG31045.430942.51.10 (0.88-1.37) 1,09 (0.87-1.37) 0.437GG7110.48712.00.90 (0.63-1.27) 0,88 (0.61-1.25) 0.464AG /GG38155.839654.51.06 (0.86- 1,30) 1,05 (0.84-1.30) 0,686

Drosha

rs2291109AT685730AA42161.541957.41.00 (referência) 1,00 (referência) 0.332AT22833.328038.40.81 (0.65-1.01) 0,79 (0.63-0.99) 0.044TT365.3314.31. 16 (0.70-1.90) 1,20 (0.72-2.00) 0.482AT /TT26438.531142.60.85 (0.68-1.05) 0,83 (0.67-1.03) 0.098rs10719TC684727TT35251.541356.81.00 (referência) 1,00 (referência) 0.017TC27840.627537.81.19 (0,95-1,48) 1,20 (0,96-1,50) 0.116CC547.9395.41.63 (1,05-2,51) 1,61 (1,03-2,50) 0.036TC /CC33248.531443.21.24 (1,01-1,53) 1,25 (1,01-1,55) 0.041rs642321CT685730CC19728. 817624.11.00 (referência) 1,00 (referência) 0.107CT32647.637150.80.79 (0.61-1.01) 0,79 (0.61-1.02) 0.075TT16223.718325.10.79 (0.59-1.06) 0,78 (0.58-1.06) 0.112CT /TT48871.255475.90 0,79 (0,62-1,00) 0,79 (0.62-1.01) 0.056Table 3. as freqüências genotípicas do

DICER

e

Drosha

SNPs entre casos e controles de câncer de bexiga e sua associação com o risco de cancro da bexiga .

aAdjusted para a idade, sexo e tabagismo (nunca e sempre) em regressão logística teste qui-quadrado model.bTwo-sided para a distribuição de freqüência do alelo (alelo menor em relação alelo principal). CSV Baixar CSV

Drosha

3’UTR rs10719TC afeta

expressão Drosha

regulando o hsa-miR-27b ligação

A fim de explorar o possível mecanismo da

Drosha

3’UTR no risco de câncer de bexiga, realizamos os ensaios funcionais. Com base na análise bioinformática, o

Drosha

3’UTR foi previsto um sítio de ligação para HSA-miR-27a /b (Figura 1A). Aqui, nós demonstramos que rs10719TC foi localizado 46bp a jusante da HSA-miR-27a /b sítio de ligação no

Drosha

3’UTR.

Conforme mostrado na Figura S1 no arquivo S1, bens -tempo ensaio quantitativo de RT-PCR sugeriram que os níveis de expressão endógenos de HSA-miR-27a /b na linha de células J82 foram mais significativamente maior do que outras células (T24, EJ, e 5637) (

P

0,001 ). Aqui, escolhemos linhagens de células J82 e T24 no posterior ensaio de luciferase. Em seguida, foram utilizados os plasmídeos para co-transfecção transiente com as células T24 [estável controle negativo (NC) miRNA: NC estáveis ​​ou HSA-miR-27a /b imita] e células J82 (inibidor NC ou HSA-miR-27a /b inibidor). Como se mostra na Figura 1B (células T24), HSA-miR-27a /b suprimida a expressão de luciferase na presença do alelo rs10719T, comparando com NC (

P

0,05), mas não o alelo rs10719C (

P Art 0,05). Além disso, também descobrimos que a inibição de HSA-miR-27a /b expressão pode aumentar a expressão de luciferase de forma eficiente para o plasmídeo contendo rs10719T em vez do plasmídeo contendo rs10719C em células J82 (

P

0,05; Figura 1C). No entanto, também descobrimos que uma diminuição significativa na expressão de luciferase, quando adicionamos inibidor da HSA-miR-27a para alelo C em células J82. O resultado similar não ser observada na adição de inibidor hsa-miR-27b para alelo C em células J82. Talvez, hsa-miR-27a não afetou diretamente a expressão da luciferase Drosha. Nossos dados sugerem que rs10719 T para substituição atos C como uma mutação de perda de função e afetaria expressão de luciferase Drosha por alvo hsa-miR-27b.

No presente estudo, também realizado ensaio de RT-PCR para explorar se hsa-miR-27b afetados expressão Drosha degradando mRNA ou supressão de tradução do mRNA pós-translacional (Figura S1 no arquivo S1). Um total de 61 tecidos tumorais de bexiga com diferentes genótipos do

Drosha

polimorfismo rs10719TC foram utilizados para avaliar a expressão de

Drosha

mRNA. Não foi observada níveis de diferença significativa de

Drosha

mRNA entre indivíduos com a TT, TC e genótipos CC (

P Art 0,05). Tomados em conjunto, hsa-miR-27b podem afetar a expressão Drosha regulando a tradução da proteína.

Discussão

No presente estudo, foi investigada a associação entre sete polimorfismos de

DICER

e

Drosha

risco genes e bexiga câncer em uma população chinesa, e identificou que o polimorfismo rs10719TC adjacente ao local obrigatório em HSA-miR-27b

Drosha

3’UTR foi associada com um aumento significativo do risco de cancro da bexiga. ensaios funcionais indicaram que

rs10719 Drosha

T à substituição C pode diminuir a actividade de ligação do HSA-miR-27b com

Drosha

3’UTR.

Drosha é um membro da ARNase III e superfamília é uma nuclease importante que executa o passo de processamento inicial em miARN cortando pri-miARN de pré-miARN [31]. interferência de ARN de Drosha resultou na acumulação de pri-miARN e redução de pré-miARN e ARN maduros [31]. Até agora, vários grupos têm estudado o papel da

Drosha

no câncer [32,33]. Ele relatou que

Drosha

genótipo rs644236 TT e AA rs7737174 genótipo foram associados com o risco de câncer de mama em mulheres na pós-menopausa [32].

Drosha

rs10719 3’UTR está em forte desequilíbrio de ligação com rs644236 com base nos dados de mil genomas (r

2 = 0,88) [33]. No presente estudo de associação, descobrimos que

Drosha

polimorfismo 3’UTR rs10719TC foi associado com o risco de cancro da bexiga. A análise estratificada demonstrou que rs10719TC genótipos /CC pode aumentar significativamente o risco de cancro da bexiga, especialmente entre os homens e fumantes. Uma possível explicação é que o cigarro foi estabelecido como o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de cancro da bexiga, que contém centenas de produtos químicos, tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos [34,35]. Assim, nunca fumantes podem ser propenso a ser câncer. Outra razão pode ser que, em comparação com o sexo feminino, as pessoas do sexo masculino são mais propensos a expor a fatores de risco ambientais acumulados envolvidos na etiologia do cancro da bexiga tais como o tabagismo, exposição ocupacional (ou seja, fabricação de corantes, trabalho de couro). Além disso, temos o tamanho relativamente pequeno da amostra de pessoas do sexo feminino. Portanto, não podemos detectar a associação significativa em pessoas do sexo feminino. Weng et ai. Também propôs que o polimorfismo rs10719TC estava relacionado com o risco de tumor maligno da bainha do nervo periférico, que apoiou nossos resultados [33]. Sobre expressão de Drosha demonstrou induzir a proliferação celular e previu mau prognóstico no câncer de esôfago [36], câncer de ovário [37], o cancro da mama [38], e cancro do colo do útero [39]. estudo anterior tinha também revelou que mais expressão de Drosha pode promover a proliferação celular e inibir a apoptose celular em câncer de bexiga [24]. Portanto, a hipótese de que

Drosha

alelo rs10719C 3’UTR pode aumentar o risco de cancro da bexiga, principalmente através da regulação da expressão de Drosha.

Foi proposto que algumas das 3’UTR polimorfismos podem estar na sítio de ligação a miARN ou na vizinhança do local de ligação e pode interferir com a função de miARN que conduz a expressão diferencial de genes para afectar o desenvolvimento do cancro [19,20]. Nossos ensaios de gene luciferase relatados indicaram que

rs10719 Drosha

T à substituição C interrompido um sítio de ligação para HSA-miR-27b, resultando o aumento dos níveis de

Drosha

expressão de luciferase 3’UTR. Assim, o alelo C é associada a um risco aumentado de cancro da bexiga, potencialmente através de um aumento da expressão Drosha, que foi consistente com o achado anterior [24]. Além disso, não houve diferença significativa de o

Drosha

nível de expressão de ARNm entre os diferentes genótipos rs10719TC foi observada em tecidos de tumor da bexiga utilizando um ensaio de RT-PCR. Estes resultados sugerem que o SNP não afecta a expressão de ARNm, no entanto, dado que miARN ligação ao ARNm nem sempre conduz à clivagem transcrição, e, por vezes, leva à repressão tradução, é possível que o SNP conduz a uma alteração na proteína Drosha. No entanto, nós não testar isso em nosso estudo, e, portanto, continua a ser uma possibilidade, mas não comprovada. Estes dados sugerem que hsa-miR-27b podem afetar a expressão Drosha regulando a tradução da proteína. Valeu a pena notar que os nossos resultados funcionais estavam de acordo com os resultados de um estudo caso-controle.

No presente estudo, hsa-miR-27b foi primeiramente relatado para regular a expressão de

Drosha

no cancro da bexiga.