Abstract

DNA mitocondrial (mtDNA) é particularmente suscetível a danos oxidativos e mutação devido à alta taxa de espécies reativas de oxigênio de produção (ROS) e capacidade de reparo do DNA limitada em mitocondrial. Estudos anteriores demonstraram que o aumento do número de cópias do mtDNA de reparação do dano, que foi associado com o tabagismo, foi encontrado para ser associado com o risco de câncer de pulmão entre os fumantes pesados. Dado que o comum e “não-patológica” variações mtDNA determinar diferenças no desempenho fosforilação oxidativa e produção ROS, um importante determinante do risco de câncer de pulmão, a hipótese de que as variações de mtDNA podem desempenhar papéis no risco de câncer de pulmão. Para testar essa hipótese, realizamos um estudo de caso-controle para comparar as frequências dos haplogrupos do DNA mitocondrial e um 822 bp mtDNA exclusão entre 422 pacientes com câncer de pulmão e 504 controles. A análise de regressão logística multivariada revelou que haplogroups D e F foram relacionados à resistência individual do câncer pulmonar (OR = 0,465, IC 95% = 0,329-0,656,

p Art 0,001; e OR = 0,622, IC 95% = 0,425-0,909,

p

= 0,014, respectivamente), enquanto haplogroups G e M7 pode ser fatores de risco para o cancro do pulmão (OR = 3,924, IC 95% = 1,757-6,689,

p

0,001; e OR = 2,037, IC 95% = 1,253-3,312,

p

= 0,004, respectivamente). Além disso, a análise de regressão logística multivariada revelou que o cigarro era um fator de risco para o 822 bp mtDNA eliminação. Além disso, o aumento das freqüências da deleção mtDNA em indivíduos tabagismo do sexo masculino de casos e controles com haplogrupo D combinados indicaram que o haplogrupo D pode ser suscetível a danos no DNA de ROS externas causadas pelo tabagismo pesado

Citation.: Zheng S, Qian P, Li F, G Qian, Wang C, Wu L, et ai. (2012) Associação de variações de ADN mitocondrial com Lung Cancer Risk em um Han população chinesa do sudoeste da China. PLoS ONE 7 (2): e31322. doi: 10.1371 /journal.pone.0031322

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 28 de setembro de 2011; Aceito: 05 de janeiro de 2012; Publicação: 21 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado por doações do National Natural Science Foundation da China (Nos. 30772456, 81170044), doações da Fundação de Ciência Natural da Terceira Universidade médica Militar (Nos. 2007XG57, 2010XLC29), bem como subsídios da Fundação de Ciência Natural de Chongqing (No. 2009BA5055) atribuído à Fuyun Ji. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão tem substituído cancro do fígado para se tornar a principal causa de mortes relacionadas ao câncer na China, sendo responsável por 22,7% de todas as mortes por câncer [1]. As taxas de morbidade e mortalidade continuam a subir rapidamente e os pacientes com cancro do pulmão vai chegar a um milhão em 2025 se não forem tomadas medidas eficazes de controlo [2]. Fumo de cigarro e amianto são os dois principais causas de cancro do pulmão, no entanto, nem todos aqueles que foram expostos aos factores de risco desenvolverá cancro do pulmão, o que sugere que outras causas, incluindo a susceptibilidade genética, pode contribuir para o risco individual cancro do pulmão e podem existir que as interações gene-ambiente [3] – [5]

até agora, muitos estudos têm sido focada nas variantes genéticas de genes que codificam DNA genômico nucleares para investigar a interação gene-ambiente de variantes genéticas de. genes com o risco de câncer de pulmão e descobriram que vários polimorfismos de genes tais como CYP2E1, CYP1A1, XRCC1, e outros estão associados com o risco de câncer de pulmão [6] – [9]. No entanto, poucos estudos têm investigado o papel do DNA mitocondrial variações (mtDNA) em suscetibilidade individual ao câncer de pulmão. Através do ciclo de Krebs e fosforilação oxidativa (FOX), mitocôndrias produzem tanto ATP para ajudar as células sobrevivem e cerca de 85% de espécies de oxigénio reactivas intracelulares (ROS), o que pode promover a diferenciação celular ou induzir apoptose. mtDNA humano é uma molécula circular de aproximadamente 16,5 kb, RNAs de transferência de codificação 22 (tRNAs), 2 RNAs ribossomais (rRNAs) e 13 subunidades da cadeia respiratória que são essenciais para as funções respiratórias das mitocôndrias [10], [11]. Estudos anteriores demonstraram que alguns haplogrupos do DNA mitocondrial estão associados com a susceptibilidade humana para doenças metabólicas e degenerativas, e influência longevidade e carcinogênese em condições em que a produção de ROS mitocondrial é pensado para desempenhar um papel [12] – [15]. Além disso, o comum e “não-patológicos” variações mtDNA que definem ADNmt haplogroups foram encontrados para determinar as diferenças de desempenho OXPHOS e a produção de ROS em ratinhos e seres humanos [16] – [19].

Tem sido estabelecido que o mtDNA é particularmente susceptível ao dano oxidativo e mutação devido à alta taxa de produção de ROS e da capacidade de reparação de ADN limitada em mitocôndrias [20], [21]. O tabagismo é uma exposição que induz estresse oxidativo através da criação de ROS dentro do corpo humano [22], [23]. o stress oxidativo crónico pode provocar danos mtDNA, levando a mutações pontuais, inserções ou deleções [24], [25]. A acumulação de danos oxidativos e as variações da sequência, resultando no mtDNA pode em última análise, levar a OXPHOS anormal em células afectadas, que pode desempenhar um papel na ocorrência de doenças relacionadas com a mitocondriais. Recentemente, o aumento do número de cópias do mtDNA de reparação do dano foi encontrado para ser associado positivamente com o subsequente risco de câncer de pulmão entre os fumantes pesados ​​[26].

Dado que o comum e “não-patológicos” variações mtDNA que definem um haplogrupo mitocondrial contribuem para as diferenças no desempenho e ROS intracelular produção OXPHOS e que o nível de ROS presente é um importante determinante do risco de câncer, que a hipótese de que as variações do mtDNA que definem alguns haplogrupos do DNA mitocondrial podem desempenhar um papel na susceptibilidade ao câncer de pulmão. Para testar esta hipótese, um estudo de caso-controle foi conduzido para investigar o papel da variação mtDNA no risco de câncer de pulmão na população chinesa Han do sudoeste da China. Além disso, foram analisadas as interações gene-ambiente entre as variações do mtDNA e fumar cigarros cumulativo.

Materiais e Métodos

Grupo de estudo

Os pacientes (n = 442) com primário câncer de pulmão diagnosticados entre setembro de 2007 a dezembro de 2008 foram recrutados no Instituto de Doenças respiratórias Humano de Xinqiao Hospital. Todos os pacientes foram recentemente diagnosticados, histologicamente confirmado e não tratados previamente. 504 idade e amostras de controle pareados por sexo foram coletados de indivíduos no centro do exame físico do Xinqiao Hospital entre novembro de 2007 e dezembro de 2008. O critério de exclusão para o grupo controle foi de qualquer história de câncer. Todos os indivíduos eram não relacionado, pelo menos, dentro de três gerações. Depois de explicar a finalidade e os procedimentos do estudo, todos os participantes assinaram um termo de consentimento informado por escrito e completaram um questionário detalhado sobre os seus hábitos tabágicos. As amostras de sangue foram colhidas em tubos de Na-EDTA a partir de todos os indivíduos e armazenado a -70 ° C durante a extracção do ADN genómico. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Xinqiao, Terceira Universidade Médica Militar.

MtDNA haplogrouping

DNA genômico foi extraído de sangue total usando o Kit DNA QIAamp Sangue Mini de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN, Maryland, EUA). MtDNA haplogrouping foi concluída tal como descrito por Li [27]. Resumidamente, a amostra inteira foi amplificada em mtDNA 22 que se sobrepõem os fragmentos de PCR e, em seguida, digerido com 14 endonucleases de restrição [28], [29]. Um controle negativo foi incluído em cada PCR-restrição polimorfismo de fragmento de análise (PCR-RFLP) para mtDNA haplogrouping para evitar a contaminação artificial causada pelo potencial de crossover amostra. A análise de PCR-RFLP foi suplementado por sequenciação do segmento hipervariável I (HVS-I, a partir de posições 16024 a 16383, em relação ao revisto Cambridge Sequência de referência do mtDNA, valores RCR) [30]. Além disso, mtDNAs selecionados que representam as principais linhagens (incluindo haplogrupos A, B, D, F, G, M7 e M8) foram completamente sequenciados. Os haplótipos de mtDNA, com base nas sequências de PCR-RFLP e hvsi, foram classificados em haplogroups de acordo com as análises filogenéticas de mtDNAs e Mitomap-filogenia [31] – [36]

A detecção de uma deleção de 822 pb no. mtDNA

os iniciadores utilizados para a detecção de um 822 bp de mtDNA deletado foram as seguintes: mtDNA-1 (para a frente): 5′-TTCGCCTACACAATTCTCCG-3 ‘e mtDNA-2 (reverso): 5’-3-ACAGATACTGCGACATAGGG ‘. As amplificações de PCR foram realizadas num volume total de 25 uL, contendo 200 mmol /L de cada dNTP, 0,35 umol /L de cada um dos iniciadores directo e inverso, 50 mmol /L de KCl, 10 mmol /L de Tris-HCl (pH 9,0) , 1,5 mmol /L MgCl

2, e 1 U de Taq DNA polimerase (Promega, Xangai, China). As condições de amplificação incluíram um único passo de pré-desnaturação a 94 ° C durante 4 min, seguido por 39 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 40 s, hibridação a 59 ° C durante 30 s, de alongamento a 72 ° C durante 1 min, e uma incubação final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram visualizados por electroforese em géis de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio. Cinco bandas contendo a deleção seleccionados aleatoriamente foram cortadas a partir de géis de agarose e o ADN foi purificado utilizando um kit de ADN Gel Extraction (GENERAY, Xangai, China). Em seguida o ADN purificado foi clonado no vector pMD®18-T de acordo com as instruções do fabricante (Takara, Dalian, China). Vinte clones foram selecionados aleatoriamente para a sequenciação subsequente. As localizações dos limites deleção (ões) foram determinadas por alinhamento da sequência do produto de PCR com os valores RCR de mtDNA [30]. A fim de detectar níveis extremamente baixos de a eliminação do mtDNA, foi aplicado um método de PCR-nested. Os iniciadores mtDNA-1 e mtDNA-2 foram usadas para a reacção de PCR primária. 1 uL dos produtos de PCR primários foi então utilizada como um molde para a reacção secundária utilizando iniciadores mtDNA-1 e mtDNA-3 (reverso: 5′-GGCTTTATGACCCTGAAGTAG-3 ‘). As condies de PCR para as reacções secundárias foram semelhantes aos descritos para a PCR primária. Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 2,0% corado com brometo de etídio.

analisa dados

O tabagismo foi estratificada por o número médio de anos-maço de casos e controles combinados (1 pack-ano = 20 cigarros por dia durante 1 ano). Casos e controles foram comparadas pelo estudante de

t

-teste para variáveis ​​contínuas e teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher para as variáveis ​​categóricas. Para comparações múltiplas de haplogrupos do DNA mitocondrial, a correção de Bonferroni foi utilizado (nível de significância required = 0,05 por número de comparações). Para avaliar o efeito independente de cada haplogrupo mitocondrial análises de regressão logística, multivariada, com ajustes para possíveis fatores de confusão (idade, sexo e tabagismo), foram realizados para calcular as razões ajustadas de chances (OR) e intervalos de confiança de 95% (95% CI) . Avaliação da associação entre mtDNA deleção e o consumo de cigarros foi realizada utilizando um teste de associação linear-por-linear após a estratificação com base no consumo do cigarro. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for Social Science 15 para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA).

Resultados

características Assunto

No total, 442 pacientes não relacionados e 504 controles não relacionados foram recrutados a partir sudoeste da China para o estudo. Nenhuma mulher fumantes de cigarro foram recolhidas. As características descritivas da população do estudo foram apresentados na Tabela 1. O número médio de anos-maço de casos e controles combinados foi utilizado como ponto de corte para estratificar os assuntos tabagismo. Como mostrado na Tabela 1, a distribuição de tipos de tumor entre os doentes foi o seguinte: adenocarcinoma, 37,33%; carcinoma de células escamosas, 26,02%; outro carcinoma de células não pequenas, 22,4%; e carcinoma de células pequenas, 14,25%. Como esperado, casos fumavam mais cigarros (

p Art 0,001).

MtDNA haplogrouping

O haplogrouping mtDNA foi concluída para todos os casos e controles. Todos os indivíduos foram classificados em 17 haplogrupos comuns asiática mtDNA por PCR-RFLP analisa e HVS I sequenciamento. A distribuição de haplogrupos do DNA mitocondrial em ambos os casos e controles foi mostrada na Tabela 2. teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher revelou que, em comparação com os controles, haplogrupos do DNA mitocondrial G, M7 e M8 (M8a + C + Z) foram significativamente mais elevados e haplogroups D e F significativamente menor entre os casos (

p Art 0,001,

p

= 0,001,

p

= 0,003,

p Art 0,001 e

p

= 0,001, respectivamente). Quando a correção de Bonferroni foi aplicada (nível de significância required = 0,05 por número de comparações), haplogrupo M8 não poderia chegar ao ajustado

p

valor de corte de 0,0029. regressão logística multivariada com ajustes para idade, sexo e tabagismo revelou que, com base em um

p valor

de 0,05, haplogrupos D e F foram associadas com resistência ao câncer de pulmão dos indivíduos (OR = 0,465 , 95% CI = ,329-,656,

p Art 0,001; e OR = 0,622, IC 95% = ,425-,909,

p

= 0,014, respectivamente), enquanto haplogroups G e M7 pode ser fatores de risco para o cancro do pulmão (OR = 3,924, IC 95% = 1,757-6,689,

p Art 0,001; e OR = 2,037, IC 95% = 1,253-3,312,

p

= 0,004, respectivamente).

Detecção da pequena deleção no mtDNA

iniciadores mtDNA-1 e mtDNA-2 foram utilizados principalmente para detectar a supressão do mtDNA. No tipo de largura de mtDNA, os iniciadores produziu apenas um produto com 1129 pb. Em indivíduos com a deleção mtDNA, os primers produtos amplificados com 1129 pb e um produto aberrante cerca de 300 bp (Fig. 1A). Os fragmentos de ADN purificados a partir de cinco bandas seleccionadas aleatoriamente contendo a deleção foram clonados no vector de pMD®18-T e sequenciados. dados de sequenciamento revelou que a parte excluída do fragmento mtDNA foi de aproximadamente 822 pb, começando entre 15587-15591 posições de nucleótidos (NPS) e terminando entre 16408-16412 nps (Fig. 1C). Porque ambas as extremidades da região deletada têm os mesmos 5 BP nucleotídeos (CTCCG, 5 repetições diretas bp curtas), não foi possível determinar os exatos pontos de início e fim da exclusão. A fim de detectar níveis extremamente baixos de a eliminação do mtDNA, um método de PCR aninhada foi aplicado para todos os casos e controlos. No tipo de largura mtDNA, os iniciadores do mtDNA-1 e mtDNA-3 só produziu um produto com 956 pb. Em indivíduos com a deleção mtDNA, os primers produtos com 956 pb e um produto aberrante com 134 pb (Fig. 1B) amplificados.

Produtos de PCR

(A) amplificados com iniciadores mtDNA-1 e mtDNA-2. A pista da direita é molecular DL marcador 2000. W1, W2 e W3 mostrando produtos de PCR com 1129 pb do tipo largo mtDNA, M1, M2, M3 e M4 indicando produtos de PCR com 1129 pb e 307 pb do mtDNA mutante. produtos (B) de PCR amplificado com primers mtDNA-1 e mtDNA-3. A pista da direita é molecular DL marcador 2000. W1 e W2 mostrando produtos de PCR com 956 pb do tipo largo mtDNA, M1, M2, M3 e M4 indicando produtos de PCR com 956 pb e 134 pb do mtDNA mutante. (C) A 822 pb mtDNA deleção na representação esquemática de um genoma mitocondrial linearizado. nucleótidos mitocondriais foram numeradas de acordo com valores RCR de mtDNA [30]. repetições de nucleotídeos em ou perto dos locais de clivagem estão entre colchetes. A colocação de ▾ acima do suporte indica que o local de clivagem exacto dentro da repetição de nucleótidos era desconhecida. O fragmento de mtDNA excluído coberto 15587-15591 nps para 16408-16412 nps. CTCCG mostrou os 5 repetições directas curtas pb em ambas as extremidades das regiões de deleção. A supressão foi formado por clivagem dentro dos 5 BP repetições diretas.

Distribuição do 822 bp mtDNA deleção entre os casos e controles

Quando os sujeitos de ambos os casos e controles foram reunidas e estratificados por número médio de anos-maço de casos combinados e controles, um posterior linear-by-linear teste de associação revelou uma tendência crescente para o mtDNA eliminação de fumar em grupos para fumadores pesados ​​(ambos

valor p

e

P

tendência 0,001) (Figura 2A).. As frequências de mtDNA deleção entre os sujeitos heavy-fumadores agrupados de casos e controles e estratificados por hábitos tabágicos light-fumantes e foram comparados e dada na Fig. 2B. teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher revelou que a eliminação ocorreu significativamente mais frequentemente em indivíduos pesados ​​fumadores (

p Art 0,001). A análise de regressão logística multivariada ajustada para idade e sexo revelou que o tabagismo pode ser um fator de risco para a eliminação mtDNA (OR = 6,540, IC 95% = 3,247-13,174, ajustado

p Art 0,001). Além disso, em comparação com os controles, a deleção mtDNA foi significativamente enriquecida em casos de câncer de pulmão (

p Art 0,001) (Fig. 2C). análises de regressão logística multivariada com ajuste para idade, sexo e tabagismo revelou que o risco de casos de câncer de pulmão para a eliminação mtDNA foi de 3,8 vezes maior que a dos controles (OR = 3,776, IC 95% = 2,662-5,355, ajustados

P

0,001). Curiosamente, a ocorrência de mtDNA eliminação foi significativamente maior em indivíduos não-fumadores do sexo feminino do que em indivíduos não-fumadores do sexo masculino de casos e controles combinados (

p Art 0,001) (Fig. 2D). regressão logística multivariada ajustada por idade revelou que o risco de indivíduos não-fumadores do sexo feminino para a eliminação mtDNA foi de 5,8 vezes maior do que a de indivíduos do sexo masculino não-fumadores (OR = 5,814, IC 95% = 3,279-10,309, ajustado

p

. 0,001)

Del, eliminação. O número médio de anos-maço de casos e controles combinados foi utilizado como ponto de corte para estratificar os assuntos tabagismo. O single de barras que representa a proporção de indivíduos que tiveram a exclusão ou não. * Indicando

p Art 0,001. (A) Distribuição da deleção mtDNA entre os indivíduos agrupados de casos e controles e estratificados por anos-maço de cigarro. Não-fumantes que não tinham qualquer história de consumo de cigarros; Luz-fumantes que fumavam 1-30 anos-maço de tabagismo; Heavy-fumantes que fumavam 30 maços-anos de tabagismo;

p

tendência foi calculada pelo teste do qui-quadrado para linear-by-linear associação (ambos

p valor

e lt

p

tendência 0,001). (B) Distribuição da deleção mtDNA entre light-cigarro e heavy-cigarro indivíduos fumadores de casos e controles combinados. Luz-fumantes que fumavam 0-30 anos-maço de tabagismo; Heavy-fumantes que fumavam 30 maços-anos de tabagismo. RUP (IC95%) e

valor p

determinada pela análise de regressão logística multivariada, ajustado para idade e sexo (OR = 6,540, IC 95% = 3,247-13,174, ajustado

valor de p

0,001). (C) Distribuição da deleção mtDNA entre os casos e controles. Comparados com os controles, a deleção mtDNA foi significativamente enriquecida em casos de câncer de pulmão (

p Art 0,001). RUP (IC95%) e

valor p

determinada pela análise de regressão logística multivariada com ajuste para hábitos de idade, sexo e tabagismo (OR = 3,776, IC 95% = 2,662-5,355, ajustados

p

0,001). (D) Distribuição da deleção mtDNA entre indivíduos fumadores não-cigarro agrupados de casos e controles e estratificada por sexo. Os não-fumantes que não tinham qualquer história de tabagismo. RUP (95% IC) e

p valor

determinada pela análise de regressão logística multivariada ajustados para idade (OR = 5,814, IC 95% = 3,279-10,309, ajustado

p Art 0,001).

Distribuição do 822 bp mtDNA eliminação nos principais haplogrupos do DNA mitocondrial de casos e controles combinados

as frequências de mtDNA eliminação nas principais haplogrupos do DNA mitocondrial de casos e controles combinados foram apresentados na Tabela 3 . Como mostrado na Tabela 3, o teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher revelou que a eliminação ocorreu significativamente mais frequentemente em indivíduos com mtDNA haplogroups D (

p Art 0,001). A análise de regressão logística multivariada ajustada para idade, sexo e tabagismo revelou que haplogrupo D pode ser um fator de risco para o 822 bp mtDNA eliminação (OR = 1,906, IC 95% = 1,359-2,738, ajustado

p Art 0,001). As frequências de mtDNA eliminação nos principais haplogrupos do DNA mitocondrial entre sujeitos tabagismo do sexo masculino e indivíduos fumadores não-cigarro do sexo masculino de casos e controles combinados foram apresentados na Tabela 4 e 5, respectivamente. Como apresentados na Tabela 4, haplogrupo D foi encontrado para ser um fator de risco para a eliminação mtDNA entre os indivíduos do sexo masculino tabagismo (OR = 2,752, IC 95% = 1,699-4,456, ajustado

p Art 0,001). Como mostrado na Tabela 5, a deleção foi enriquecida em indivíduos com mtDNA haplogroups L entre sujeitos do sexo masculino não-tabagismo (

P

= 0,036). regressão logística multivariada ajustada por idade revelou que, com base em um

valor p

de 0,05, haplogrupos G pode ser um fator de risco para a eliminação mtDNA em indivíduos fumadores não-cigarro do sexo masculino de casos e controles combinados (OR = 3,906, IC 95% = 1,381-12,255, ajustado

p

= 0,017).

Discussão

no presente estudo, mtDNA haplogrupos D e F foram encontrados para ser benéfico para a resistência dos indivíduos para o cancro do pulmão, enquanto haplogroups G e M7 foram associados com um risco aumentado de câncer de pulmão na população chinesa Han do sudoeste da China. Além disso, o tabagismo era um fator de risco para o 822 bp mtDNA exclusão e haplogrupos do DNA mitocondrial D era suscetível a danos causados ​​por ROS externas causadas pelo tabagismo. Os resultados forneceram evidências do ponto de mtDNA que a interação gene-ambiente existe na suscetibilidade individual ao câncer de pulmão. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a relatar a associação do risco de cancro do pulmão com as variações do mtDNA e do tabagismo com o 822 bp mtDNA deleção que começa entre 15587-15591 nps e termina entre 16408-16412 nps.

o 822 pb mtDNA deletado foi encontrado acidentalmente para estar presente em muitas amostras quando os iniciadores de mtDNA-1 e mtDNA-2 foram utilizados para amplificar o fragmento de mtDNA para a sequenciação subsequente de HVS I no estudo. Em princípio, utilizando o protocolo nested-PCR, é possível concentrar moléculas eliminados no primeiro passo do PCR e detectar moléculas individuais. Assim, todas as amostras (casos e controlos) foram, em seguida, re-amplificada utilizando o método mais sensível nested-PCR para detectar níveis extremamente baixos de a deleção mtDNA. Para investigar o papel da deleção mtDNA na população do estudo, as freqüências de mtDNA exclusão foram comparados entre os sujeitos tabagismo leves e indivíduos fumadores de cigarros pesados ​​de casos e controles combinados. A comparação revelou que a deleção mtDNA foi significativamente mais frequente em indivíduos pesados ​​fumantes em comparação com indivíduos fumantes leves. A análise de regressão logística multivariada revelou que o cigarro era um fator de risco para a eliminação mtDNA. Muitas das substâncias na fumaça do cigarro são produtos químicos que podem criar ROS dentro do corpo humano para introduzir o estresse oxidativo que foi pensado para ser envolvidos na carcinogênese de pulmão [37], [38] e mutações do mtDNA [39] – [41]. Recentemente, foi relatado que o aumento do número de cópias do mtDNA foi associada com o desenvolvimento futuro de câncer de pulmão entre os fumantes pesados ​​de indemnização por danos devido à capacidade de reparação do ADN limitado de mitocondrial [26]. Assim, os achados anteriores, que pesados ​​fumantes de cigarros teria doses internos mais elevados de ROS [42], [43] e aumentou mtDNA número [26] copiar do que leves fumantes de cigarro suportado nossas descobertas de que fumantes pesados ​​teria aumento das freqüências da deleção mtDNA em comparação com luz fumantes de cigarro.

eliminações mtDNA são geralmente acredita-se ser o resultado de dano ao DNA induzido oxiradicais-, mas o mecanismo de supressão é mal compreendida. A maioria das delecções mtDNA são predominantemente (-85%) flanqueado por repetições directas curtas [44], [45]. Atualmente, existem duas propostas sobre a formação de deleções do mtDNA. Uma proposta é que mtDNA exclusão poderia ser gerado através de um mecanismo de replicação de suporte escorregou [46]. Mas a proposta foi contestada pela recente alteração do modelo de deslocamento de cadeia que argumenta que não existem grandes regiões de DNA de fita simples, em vez disso, o modelo de atraso vertente é amplamente protegido por RNA [47], [48]. Outra proposta é que eliminações mtDNA poderia ser gerada durante o reparo de DNA danificado causado pelo aumento do estresse oxidativo de causa qualquer que seja [49]. A proposta mais tarde foi apoiada por muitas evidências de

E. coli

, ratos para células humanas [50] – [53]. A 822 pb mtDNA deleção detectada no estudo também é flanqueado por 5 BP curto repetições directas (CTCCG) (fig. 1C). Nossos resultados forneceram evidências indiretas para apoiar a proposta mais tarde que as exclusões do mtDNA pode ser criado durante o reparo de DNA danificado gerado pelo tabagismo. Compreender o mecanismo envolvido na geração e posterior expansão clonal vale a pena investigar mais.

Em comparação com os controles, a deleção mtDNA foi encontrado para ser enriquecido em casos. A fim de investigar se a deleção mtDNA foi associada com alguns haplogrupos do DNA mitocondrial, as freqüências da deleção mtDNA em grandes haplogrupos do DNA mitocondrial de casos e controles combinados foram analisados ​​e os dados revelaram que a eliminação ocorreu significativamente mais frequentemente em mtDNA haplogrupos D e logística multivariada análises de regressão revelou que o haplogrupo D pode ser um fator de risco para a eliminação mtDNA. Uma vez que o fumo do cigarro foi um fator de risco para a eliminação mtDNA e há indivíduos fumadores de cigarros do sexo feminino foram recolhidos no estudo, os indivíduos do sexo masculino reunidos a partir de casos e controles foram estratificados pelo tabagismo em sujeitos tabagismo do sexo masculino e indivíduos fumadores não-cigarro do sexo masculino para analisar ainda mais a associação de mtDNA supressão com haplogrupos do DNA mitocondrial. A análise das freqüências da deleção mtDNA em grandes haplogrupos do DNA mitocondrial entre indivíduos do sexo masculino tabagismo também revelou que o haplogrupo D pode ser fatores de risco para a eliminação mtDNA. Não houve diferença significativa semelhante foi encontrado entre os indivíduos do sexo masculino Não fumante de cigarro. No entanto, mtDNA haplogroup G foi encontrado para ser um fator de risco para a eliminação entre os indivíduos do sexo masculino Não fumante de cigarro. Curiosamente, a exclusão foi enriquecido em indivíduos fumadores não-cigarro do sexo feminino em comparação com indivíduos não fumadores de cigarros do sexo masculino de casos e controle combinados. Uma das razões que a hipótese para explicar esta diferença é que cozinhar fumaça de óleo poderia ser um fator de risco maior para a eliminação mtDNA para as mulheres que cozinham com muito mais frequência do que os homens no sudoeste da China.

Vários haplogrupos do DNA mitocondrial foram encontrados para desempenhar papéis na longevidade humana, carcinogênese, neuropatia hereditária de Leber óptica (LHON), e outras doenças metabólicas e degenerativas. MtDNA haplogrupo D é um desses haplogrupos do DNA mitocondrial. Haplogrupo D é definido pelo C5178A variação específica em NADH desidrogenase mitocondrial subunidade 2 (CD2). Estudos anteriores mostraram que o efeito protetor de uma substituição Leu → Met no aminoácido 237 (L237M) do ND2 (C5178A) contra danos oxidativos para a mitocôndria não só contribui para a longevidade humana [13], [16], mas também fornece uma forte anti- efeitos ateroscleróticas em pacientes diabéticos e protege contra infarto do miocárdio [14]. Assim, o efeito protector de D haplogrupo contra o dano oxidativo também pode diminuir o risco de cancro do pulmão. A frequência de haplogrupo J, que foi encontrado para ser correlacionada com a menor eficiência da cadeia de transporte de elétrons (ETC), ATP diminuiu, diminuiu a produção de ROS, e acumulação em pessoas idosas, foi aumentada em pacientes com LHON e esclerose múltipla devido a sua limitada potência para compensar a deficiência energética mitocondrial [18], [19]. Da mesma forma, haplogrupo D poderia explicar o aumento da frequência da variante C5178A em pessoas idosas, que é causada por diminuição do dano oxidativo [13], [16]. No entanto, uma vez que as ROS externos criados por Fumar aumenta de cigarros, a frequência dos mtDNA de eliminação aumenta em indivíduos Canceroso com haplogrupo D. Uma das razões que a hipótese para explicar os fenômenos que o haplogrupo D mtDNA foi encontrado para ser protetor em enquanto o cancro do pulmão a eliminação mtDNA foi enriquecido em indivíduos fumantes de cigarro do sexo masculino com mtDNA haplogrupo D de casos e controles combinados é que indivíduos com o haplogrupo D pode ser suscetível a danos de ROS externas causadas pelo tabagismo. Os resíduos de metionina têm sido propostos para constituir um mecanismo de defesa anti-oxidante importante [54]. De acordo com o modelo previsto de humano ND2 molecular [55], a substituição de Leu → Met no aminoácido 237 (L237M) de ND2 (C5178A) é exposta na superfície do complexo I e podem desempenhar papéis importantes no efeito protector contra danos oxidativos para mitocôndrias como um captador de oxidante eficaz [13]. A localização do resíduo de metionina (Met Leu →) na superfície do complexo I pode também ser um alvo para danos de ROS aumentada o que causou. O resíduo ou superfície de estrutura danificada do complexo I pode causar ou agravar a exclusão de mtDNA. A outra razão que vamos explicar os fenômenos é que o risco de câncer de pulmão e a exclusão mtDNA não foram influenciados apenas pelas variações do mtDNA. O fundo nuclear em que os haplogrupos do DNA mitocondrial são classificados e a exclusão mtDNA foi encontrado também podem contribuir para a susceptibilidade dos indivíduos ao risco de câncer de pulmão e a exclusão mtDNA. Investigar a geração de ROS endógeno e o efeito protetor contra danos oxidativos para a mitocôndria, sob diferentes condições de diferentes haplogrupos do DNA mitocondrial com o mesmo fundo nuclear, ou investigando a fundo nuclear diferente com os mesmos haplogrupos do DNA mitocondrial, pode ajudar-nos, pelo menos em parte, a explorar os mecanismos fundamentais.

haplogroup F também foi identificada com menos frequência em casos de câncer de pulmão como haplogrupo D, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas frequências de a eliminação mtDNA entre os indivíduos de cigarros fumantes do sexo masculino com haplogrupo F. haplogroup