Abstract
As propriedades mecânicas dos tumores e o ambiente do tumor fornecer informações importantes para a progressão e caracterização de câncer. Os tumores são rodeados por uma matriz extracelular (ECM) dominado por colagénio I. As propriedades geométricas e mecânicas da ECM desempenham um papel importante para o passo inicial na formação de metástases, apresentada pela migração de células malignas para novas, bem como assentamentos o sistema vascular e linfático. A extensão desta invasão celular dentro do ECM é um marcador de prognóstico médico chave para o cancro.
In vivo
estudos revelam um aumento da rigidez e arquitetura diferente do tecido tumoral quando comparado com os seus homólogos saudáveis. A organização do colágeno paralela observada na fronteira do tumor e arranjo radial na zona de invasão levantou a questão sobre os mecanismos de organização dessas estruturas. Aqui se estuda o efeito das forças contráteis originado de esferóides modelo de tumor embebidas numa colágeno biomimético I matriz. Mostramos que as forças contrácteis agir imediatamente após a sementeira e deformar a ECM, conduzindo assim a forças radiais de tracção no interior da matriz. Relaxamento dessa tensão através de cortar o colágeno faz reduzir a invasão, mostrando uma relação mecânica entre o estado de tensão do ECM e invasão. Por sua vez, estes resultados sugerem que as forças de tracção no ECM facilitar a invasão. Além disso, a contracção simultânea do crescimento do tumor ECM e conduz à condensação e a reorientação do colagénio na superfície do esferóide. Propomos um modelo baseado em tensão para explicar a organização do colágeno eo início da invasão pelas forças provenientes do tumor
Citation:. Kopanska KS, Alcheikh Y, Staneva R, Vignjevic D, Betz T (2016) de tração forças originários da Cancer Spheroids Facilitar Tumor Invasion. PLoS ONE 11 (6): e0156442. doi: 10.1371 /journal.pone.0156442
Autor: Adam J. Engler, Universidade da Califórnia, San Diego, Estados Unidos
Recebido: 28 Dezembro, 2015; Aceito: 13 de maio de 2016; Publicação: 07 de junho de 2016
Direitos de autor: © 2016 Kopanska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Os dados podem ser acessado a partir de:. https://osf.io/up847/
Financiamento: Este trabalho recebeu apoio no âmbito do programa «Investissements d’Avenir» lançado pelo Governo francês e implementado pela ANR com as referências ANR – JCJC SVSE 5 2011 (TB) e PSL Labex CelTisPhyBio ANR-10-LBX-0038 ANR-10-IDEX-0001-02 (TB, KK e DV), células em movimento Cluster de Excelência (EXC 1003 – CIM) , Universidade de Münster, Alemanha (TB), Câncer Institut thématique multi-organismes – Plano de Câncer 2014-2019 e Ecole Doctorale Frontières du Vivant (FDV) – Programa Bettencourt (RS). A imagiologia intravital foi apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM N ° DGE20111123020), o Cancerople-IdF (n ° 2012-2-EML-04-IC-1), o INCA (Instituto Nacional do Câncer, n ° 2011-1 -label-IC-4), e SiRIC (INCA-DGOS- 4654), PICT-IBiSA e Nikon Imaging Center @ CNRS-Institut Curie
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
a metástase é uma das principais causas de morte de pacientes com câncer e o resultado final de um processo de várias etapas que envolve invasão tumoral local, a disseminação de células tumorais para órgãos distantes e uma adaptação a diversas tecidos [1]. Os mecanismos de invasão têm sido amplamente estudadas no passado [2]. células invasoras muitas vezes exibem epitelial característica a mesenquimais Transição (EMT) marcadores, tais como jusante regulação da E-caderina e regulação positiva de vimentina, e perder algumas características epiteliais, tais como apical- polaridade basal [3].
microambiente do tumor é caracterizado por propriedades mecânicas distintas, em comparação com os tecidos saudáveis. A matriz extracelular (ECM), composta principalmente de colagénio [4], acumula-se no estroma do tumor e que é responsável pelo aumento da rigidez observada em muitos tumores [5]. a progressão do tumor é também acompanhada por uma distintas arquiteturas de colágeno [6], denominado assinaturas de colágeno associadas ao tumor (TAC), que foram correlacionados com o prognóstico do paciente. Inicialmente, há um aumento na quantidade de colagénio no tecido circundante (TACS-1). Em estados posteriores fibras de colagénio ficam alinhadas paralelamente à superfície do tumor (TACS-2) [4-6]. Finalmente, em tumores invasivos, as fibras de colagénio encontram-se a ser alinhada perpendicularmente ao perímetro do tumor (TAC-3), que também se correlaciona com a direcção de invasão celular [7]. TACS ter sido descrito como um marcador de prognóstico para a sobrevivência do paciente [5]. Do mesmo modo, uma forte correlação entre a potência e metastático alinhamento matriz intra-tumoral, incluindo radial e alinhamento paralelo das fibras de colagénio foi descrito no modelo de rato colorectal câncer [8]. Um feedback positivo entre o tumor mediado mudanças no colágeno e o câncer, assim como tipos de células de câncer associado tem sido sugerido [9], o que pode explicar a ocorrência estável e reprodutível destas estruturas de colágeno.
As modificações de o estroma tumoral é conhecido por ser um resultado de processos enzimáticos /bioquímicos, onde as células cancerosas, bem como cancro associado fibroblastos (FAC) desempenham um papel fundamental na degradação e remodelação da matriz [8,10-12]. Esta remodelação bioquímica tem sido extensivamente estudada e depende da degradação por metaloproteinases de matriz (MMPs) e enrijecimento ECM por lisil-oxidase (LOX) [10]. O endurecimento da matriz foi sugerida como sendo um factor determinante para a invasão [13], no entanto estudos mais recentes identificam o tamanho do poro da matriz, em vez de rigidez como a propriedade crítica modular a invasão de células de cancro [14,15]. Aqui nós abordar a questão em que medida uma remodelação de ECM mecânica puro tumor pode ser gerado pelas forças aplicadas pelas células tumorais no ECM. Tais forças puxando o ECM que são criados pelas próprias células cancerosas, ou por câncer associado fibroblastos (FAC) são conhecidos por contribuir para o endurecimento da matriz e do alinhamento das fibras ao redor do tumor [16-23].
Devido à complexidade espacial do tumor 3D ambiente, a regulamentação e os resultados das forças de tracção sobre colágeno são difíceis de estudar
in vivo
. No entanto, os recentes avanços no desenvolvimento de
in vitro
modelos confiáveis câncer 3D, permitem a dissecção de um processo de remodelação mecânica. Especialmente, esferóides multicelulares cancerosas incorporados na ECM têm sido encontrados útil para estudar invasão [24,25]. Estudos utilizando estes modelos esferóides 3D mostrou que as células mudar activamente a matriz circundante por alinhamento mecânico e estirpe de endurecimento [26]. Em sistemas de esferóides tumor cerebral, tanto a pressão de compressão e de tensão sobre o microambiente matriz tem sido mostrado para ser ligada a dinâmica invasivas do tumor [27]. As dinâmicas detalhadas e correlação entre a remodelação mecânica e invasão ainda não foi estudado. Além disso, estudos mostraram que a pressão mecânica e elasticidade ECM regular o crescimento de esferóides [28,29].
Estudos anteriores mostraram que as células cancerosas individuais exercem forças de tração em proteínas da matriz fibrilares que levam a ECM deformação [12]. Análise do alinhamento das fibras de colágeno
in vivo
e
in vitro
tinha sugerido que as forças provenientes do esferóide tumor são importantes para esse alinhamento [7,20,21,23]. Embora as forças contrácteis foram observados no contexto de células individuais para reorganizar as fibras de colagénio [12,30], o crescimento de um tumor em vez sugere que empurra da ECM na superfície do tumor, o que comprime eficazmente a matriz de colagénio. Por conseguinte, duas contribuições de compressão pode ser isolado, uma força que empurra devido ao crescimento do tumor e uma força de tracção que é aplicada pelas células cancerosas no ECM. No colágeno superfície do tumor pode fivela, mas também quebrar ou ser degradado. O efeito da contractilidade em outros sistemas de células, tais como fibroblastos tem sido bem estudada, onde foi demonstrado que a contracção do colagénio cria padrões de tensão e o alinhamento das fibras, que facilitam a migração das células [31-33]. A importância de tensão na migração celular também é fornecido por estudos em cultura de fibroblastos em flutuante, géis 3D baixa tensão, bem como (impedido), géis de alta tensão ancorados [34,35].
O principal objectivo da trabalho apresentado neste trabalho é estudar o efeito da contração da ECM mediada por tumor e para mostrar que a tensão é gerado e afeta invasão celular.
resultados
modelo tridimensional da invasão da célula cancerosa
para estudar a invasão das células cancerosas no ECM foi utilizado um ensaio de invasão 3D colagénio anteriormente descrito que foi adaptado às nossas experiências (S1A e S1B FIG) [25,36]. Esferóides derivadas da linha celular murina de carcinoma do cólon CT26 [37], transfectadas para expressar estavelmente GFP citoplasmática, são registados por fiação disco microscopia para visualizar invasão. células CT26 são caracterizados por um fenótipo mesenquimal, especialmente por falta de expressão de E-caderina [37]. Portanto, eles têm um elevado potencial invasivo e quando encontram um ambiente favorável (ECM) que migram para fora do esferóide. esferóides multicelulares foram gerados utilizando um protocolo de almofada de agarose clássica e embebidos em colagénio do tipo I ligado à superfície do prato (Fig S1B). gel de colágeno foi polimerizado à temperatura ambiente (≈22 ° C) para oferecer uma arquitetura de matriz comparável ao
in vivo
. Geraldo et al. mostrou que o colágeno polimerizado
in vitro
em temperatura ambiente se assemelha fibras encontrado
in vivo
em modelos animais com uma rede composta por uma mistura de alguns feixes finos e muitos pacotes de espessura variando de 0,72 até 1,56 um de espessura. Em contraste, o colagénio polimerizado em 37 ° C não mostrou semelhanças com o tecido animal [38]. Em nosso estudo foi escolhido a condição de polimerização fisiologicamente mais relevante à temperatura ambiente (S1C Fig e S1 Filme) [25]. Isto é, além disso, apoiado pela
in vivo
estudo no cancro do cólon do rato, onde observamos a organização semelhante ao sistema reconstituído usados aqui.
Figura 1A mostra imagens representativas confocal de fluorescência (projeção 3D) um esferóide GFP-CT26, onde as células de difusão a partir do esferoide na ECM, portanto, imitando invasão.
(a) perfil radial de fluorescência da GFP do esferóide durante 72 horas de invasão em colagénio do tipo I. diferentes zonas do esferóide podem distinguir-se: área escura, como anteriormente descrito núcleo necrótico (linha ponteada), aro proliferativa (linha a tracejado) e invasão (linha e área sombreada). Inserir: Imagem representativa de esferóide (GFP) 24 horas após a semeadura. Barra de escala: 100? m. (B) a mudança Morfologia ao longo do tempo de diferentes tamanhos esferóides semeadas em no colágeno tipo I. Spheroids foram fotografadas no campo brilhante e fluorescência (GFP). Barra de escala: 200? m. cinética de (C) de crescimento de esferóides para três diferentes tamanhos iniciais ( 300 uM, 350-400 ^ M e 400 m). Os valores são a média ± desvio padrão de N = 6-12 a partir de três experiências independentes.
esferóides aumento no tamanho (Figura 1B) como um resultado da proliferação de células. Como mostrado por Alessandri et ai. [36], o núcleo de esferóides CT26 é necrótica, semelhante a outros sistemas de esferóides. Em contraste, as células na borda separar e invadir o colagénio. Nos perfis radiais da fluorescência da GFP pode ser observado o desenvolvimento dependente do tempo das zonas diferentes. No instante t = 0h (Fig 1A, amarelo) a fluorescência no interior esferóide é apenas ligeiramente menor do que na fronteira. No entanto, após 24 horas de três zonas são aparentes, (Fig 1A, vermelho): o núcleo necrótico (a área escura dentro do esferóide, baixa intensidade de sinal), o aro proliferativa (picos de intensidade de sinal), e zona de invasão (área sombreada). Esses recursos imitar a morfologia do
in vivo
tumores [24].
Para escolher o tamanho inicial ideal de esferóides que contêm três zonas distintas, analisamos o crescimento (Fig 1C) e invasão de esferóides de três diâmetros diferentes, a saber, 450 uM, 350 uM e 250 uM (Fig 1B). A área escura em esferóides mais pequenas (250 um) se torna visível após aproximadamente três dias, quando o esferóide atingiu 300 um de diâmetro (Figura 1B), enquanto os esferóides maiores desenvolver o núcleo já depois de um dia de cultura em colagénio. Para testar se o tamanho inicial de esferóides afecta a invasão, que quantificar a área da invasão por esferóides de diferentes diâmetros iniciais e encontrar nenhuma dependência significado da área invasão relativa do tamanho do esferóide inicial (valor de p 0,05) (dados não mostrados ). Como os pequenos esferóides mostram um crescimento contínuo e proporcionar o acesso mais fácil para imagens 3D, nós exclusivamente utilizar esferóides entre 300-350 mm em tamanho inicial para este estudo.
As células cancerosas contrato rede de colágeno
Para estudar o rearranjo dinâmico da matriz de colagénio durante a invasão foi realizada imagens ao vivo com uma resolução temporal de 1h mais de 24 horas (S2 Filme). Os aumentos de esferóides iniciais de tamanho ao longo do tempo (Fig 2A, campo brilhante e GFP) e em 9 horas primeiras células são observados para deixar o esferóide (início da invasão) (seta branca Fig 2A). A distribuição de células invasoras em 24 horas é uniforme em torno do esferóide.
(A) sequência de imagens de CT26-GFP (verde) a invasão de células no colagénio de tipo I marcado com TAMRA (vermelho). Células iniciar invasão (seta branca) após aproximadamente 9 horas (início da invasão). Barra de escala: 50 ^ m. (B) Kymographs de colágeno e células a partir da sequência de imagens (S2 Filme). As imagens foram recolhidas de hora a hora durante 24 horas. Escala de 50