Abstract

Digite 1 iodotironina deiodinase (DIO1) catalisa a conversão da tiroxina hormônio para a activa da hormona da tiróide de 3,3 ‘, 5-triiodotironina (T3), importante regulador da proliferação celular e diferenciação. expressão DIO1 é reduzida no tipo mais comum de neoplasia renal, células claras carcinoma de células renais (ccRCC). MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes, que regulam a expressão de genes a níveis pós-transcricional. O objetivo deste estudo foi analisar o regulamento potencial de expressão DIO1 por microRNAs em ccRCC. análise bioinformática revelou que 3’UTR do humano

DIO1

transcrito do gene contém miR-383 locais-alvo, que são conservadas entre espécies de mamíferos miR-224 e. Em tempo real semi-quantitativa da PCR foi utilizada para analisar a expressão de miR-224 e miR-383 em 32 amostras de tumores ccRCC (T) e em 32 combinados de controlo (C) amostras. Observou-se estatisticamente significativa (p = 0,0002) mais do que quatro vezes de aumento na expressão de miR-224 e cerca de duas vezes de aumento na expressão de miR-383 em amostras de T em comparação com alterações específicas C. As amostras de tumor na expressão de miR-224 negativamente correlacionados com alterações na expressão DIO1 e T3 concentração intracelular. A transfecção da linha de células HeLa com miR-224 e miR-383 suprimiu a actividade de um repórter da luciferase contendo o 3 ‘UTR de

DIO1

. Este foi abolida quando as construções mutantes no miR-383 locais-alvo miR-224 e foram utilizados em vez disso, o que indica que miR-224 e miR-383 ligam-se diretamente para

DIO1

3’UTR. Finalmente, a expressão induzida de miR-224 em células Caki-2 resultou numa significativa (p 0,01) redução de

DIO1

ARNm. Este estudo fornece um novo mecanismo de regulação mediada por miRNA de

DIO1

expressão em ccRCC

Citation:. Boguslawska J, Wójcicka A, Piekiełko-Witkowska A, Mestre A, Nauman A (2011) MiR -224 Metas 3’UTR do Tipo 1 5′-deiodinase iodotironinas possivelmente contribuindo para Tissue Hipotireoidismo em Câncer renal. PLoS ONE 6 (9): e24541. doi: 10.1371 /journal.pone.0024541

editor: Marian Ludgate, da Universidade Cardiff, Reino Unido

Recebido: 12 de maio de 2011; Aceito: 12 de agosto de 2011; Publicação: 02 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Boguslawska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pelo Comité de Polish Estado para científicos investigação (NN 401 071 939, NN 401 0386 37), e do Centro Médico da Educação Grant Pós-Graduação (501-2-1-24-06 /08) (a AN). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os hormônios da tireóide: 3,5,3-L-triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), desempenham um papel importante no crescimento, desenvolvimento, diferenciação e regulação de vias metabólicas nas células. tipo humano 1 deiodinase iodotironina (DIO1), produto da

DIO1

gene catalisa dois tipos de reação deiodinação, uma outer-ring (5′-deiodinação – 5’d) e um interno-anel (5-deiodinação – 5D). Estes processos resultam, respectivamente, na activação e inactivação de hormonas da tiróide (1). DIO1 é um selenoenzyme expresso principalmente no fígado, rins, tiróide, pituitária e. Relatos anteriores mostraram que a expressão desta enzima é perturbado de diferentes tipos de cancro. Por exemplo,

DIO1

ARNm e actividade estão diminuídos em carcinoma papilar da tiróide (2-5) e o aumento em adenoma e carcinoma folicular da tiróide folicular (2). Em trabalhos anteriores que mostraram diminuição da expressão de

DIO1

mRNA e atividade (6), e perturbado splicing alternativo de

DIO1

pré-mRNA em células claras carcinoma de células renais (ccRCC) (7).

DIO1

expressão também tem sido proposto como um marcador de diferenciação das células cancerosas (8, 9).

ccRCC representa a histologia do câncer renal mais comum, representando 75% das neoplasias malignas primárias de rim ( 10, 11). O tratamento geralmente utilizado é a ressecção cirúrgica enquanto quimioterapia e radioterapia permanecem ineficiente. Nenhum dos vários marcadores moleculares propostas foi aprovado para uso clínico (10).

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes, que controlam a expressão de genes por completa ou parcialmente complementar de ligação ao 3 ‘não traduzida região de ARNm alvo (12, 13), causando a degradação do ARNm ou, mais comumente, tradução de bloqueio (14-16). Estudos anteriores demonstraram que miARNs desempenham papéis importantes em processos essenciais, tais como a diferenciação, proliferação e apoptose (17, 18). Atualmente resultados emergentes revelou que miRNAs estão envolvidos na patogênese do câncer. alterações frequentes de expressão miARN foram encontrados numa variedade de malignidades humanas, tais como da tiróide (19), do pulmão (20), pâncreas (21), do cólon (22), da mama (23), do fígado (24), da próstata (25) ou outros tumores sólidos (26, 27). Vários estudos têm identificado painéis de microRNAs que são diferencialmente expressos entre o tecido renal normal e tumoral ou entre os subtipos histológicos de tumor renal (28-33). MicroRNA perfil de expressão demonstrou diversas aplicações clínicas para o diagnóstico, prognóstico e fins preditivos (34, 35). Vários função miARNs como oncogenes ou supressores de tumor, e vários genes que codificam para miARNs estão localizados em regiões genómicas envolvidos em cancros (36).

Os resultados anteriores (6) têm mostrado que a actividade DIO1 mal se correlaciona com o seu nível de ARNm em tecidos renais saudáveis. Esta observação sugere regulação pós-transcricional significativo de

DIO1

expressão que poderia ser mediada por miRNAs. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar o potencial

DIO1

regulação por miRNAs e para determinar se a desregulamentação dos DIO1 em ccRCC poderia resultar de acções alterados de miRNAs.

Resultados

previsão computacional de miRNAs ligação a

DIO1

3’UTR

para identificar os miRNA putativos segmentação da 3’UTR do

DIO1

mRNA, foram utilizados programas computacionais, TargetScan, PicTar, miRBase e Miranda. Os 1087 nucleótidos de 3’UTR de

DIO1

foram selecionados para a complementaridade para semear sequências de miRNAs conhecidos. Apenas o miARNs identificado por pelo menos dois dos quatro abordagens bioinformática independentes foram consideradas para análise adicional. Foram identificados 7 potenciais miRNAs visando o 3’UTR de

DIO1

(Tabela 1) humana: miR-224, miR-383, miR-610, miR-659, miR-637, miR-1202 e miR- 1266.

miR-224 e miR-383 são sobre-expressos em ccRCC

em estudos preliminares, usando semi quantitativa PCR em tempo real (SQ-PCR), determinou-se a expressão relativa de 7 miRNAs candidatos em ccRCC e amostras de controlo dos jogos emparelhados de 32 pacientes em uso de primer universal UniAmpHindIII (37) com a sequência de homologia com saliências de primers utilizados em iniciadores de transcrição reversa e específicos de miRNA (sequências são mostrados em dados suplementares, na Tabela S2). Observamos diferentes expressão de miR-224 e miR-383, enquanto que a expressão dos cinco outros miRNAs candidatos: miR-610, miR-637, miR-659, miR-1202 e miR-1266 não diferiram significativamente entre ccRCC e tecido controle (Figura S1, Supplemental Data).

expressão induzida de miR-224 e miR-383 em ccRCC foi confirmada em um ensaio TaqMan microARN específica. Estes estudos revelaram estatisticamente significativa (p = 0,0002) ao longo de quatro vezes de aumento na expressão de miR-224 e cerca de duas vezes de aumento (p = 0,0236) na expressão de miR-383, nas amostras T, em comparação com amostras de controlo C (Figura 1 ). Alteração média de dobragem de miR-224 e miR-383 foi analisada em diferentes graduações tumorais, mas não dependem do grau de diferenciação de amostra de tumor. No entanto, a variação média dobra de miR-224 tenderam a diminuir quando as notas de diferenciação aumentou de G1 a G3 (Figura 1).

A. O aumento da expressão de miR-224 em amostras de tumor ccRCC (T), em comparação com amostras de controlo (C). A expressão é apresentado como percentagem de controlo C. B. A média de dobrar T: C alteração de expressão de miR-224 224 em amostras divididas de acordo com os tipos diferenciação tumoral (G1, G2, G3). C. O aumento da expressão de miR-383 em amostras de tumor ccRCC (T), em comparação com amostras de controlo (C). A expressão é apresentado como percentagem de controlo C. D. A média de dobrar T: C alteração de expressão de miR-383 224 em amostras divididos de acordo com os tipos diferenciação tumoral (G1, G2, G3). Os dados são apresentados como média ± SEM n = 32 para T, n = 32 por C (em A e C), n = 11 para G1, n = 11 para G2, n = 10 para G3 (em B e D). A análise estatística foi realizada utilizando emparelhado

t

-teste para comparar amostras C e T (em A e C) ou ANOVA para comparar G1, G2, G3 e as amostras (em B e D) * p 0,05, * ** p .. 0.001

Assim, a expressão perturbada de miR-224 e miR-383 em ccRCC foi confirmado por duas diferentes abordagens analíticas

miR-224 correlaciona negativamente com DIO1 e os níveis de T3 em ccRCC

análise SQ-PCR revelou 2,7 downregulation dobra de

DIO1

mRNA em 32 emparelhado tumorais e de controlo amostras de tecido (p = 0,0009), o que é consistente com os nossos relatórios anteriores ( 6) (Figura 2). Como mostrado na Figura 2, foi observada uma correlação negativa significativa estatisticamente entre o miR-224 e

alterações específicas do tumor DIO1

ARNm de expressão de Spearman (R

s = -0,556, p = 0,001). Em contraste, não houve correlação para miR-383 e

DIO1

. Além disso, análise de Western-blot realizado em onze amostras pareadas de ccRCC e tecido renal normal revelou perda de proteínas DIO1 (Figura 2B).

A. Expressão de

DIO1

mRNA em amostras de tecido. n = 32 para o t e n = 32 para C. A expressão é apresentado como percentagem de controlo C. O gráfico mostra os valores medianos com IC de 95% como dados não foram distribuídos normalmente. A análise estatística foi realizada utilizando Wilcoxon pareado para comparar amostras C e T. *** P 0,001. B. Ocidental-blot de DIO1 realizados em amostras de controle-ccRCC pareados por par. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo interno. amostras de quatro controle de representante (C) e tumor (T) são mostrados. C e D. Scatter parcelas do T: rácios C de

DIO1

mRNA

contra

T: C miR-224 (C) e T: C miR-383 (D) rácios de expressão. análise de correlação não-paramétrico de Spearman foi realizado em dados de 32 pares de amostras de controlo e de tecido do tumor. p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. lotes E e F. dispersão de concentração de T3 razão T: C em relação T: C miR-224 (E) e rácios de expressão de miR-383 (F). A análise de correlação de Pearson foi efectuado em dados a partir de 11 pares de amostras de controlo e de tecido tumoral. p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

DIO1 é um regulador de hormônios da tireóide biodisponibilidade.. Em nosso estudo recente verificou-se que a concentração T3 foi diminuída em tumores ccRCC comparação com pares combinados controles. Para verificar se a regulação negativa miR-224-mediada de DIO1 afeta produto actividade DIO1, T3, foi analisada a correlação entre as alterações específicas do tumor dos níveis de miR-224 e T3. os níveis de T3 foram analisados ​​em 11 amostras ccRCC e controle pareados por par que foram utilizados para a análise DIO1 Ocidental-blot. concentração de T3 foi avaliada como descrito anteriormente (37). Encontramos uma diferença estatisticamente significativa (Pearson r = -0,624, p = 0,04) correlação negativa entre T: rácios C de miR-224 e T3 intratumoral (Fig. 2). miR-383 mudanças fez nem se correlacionam com T3.

concentrações de T3 intratumorais abaixadas pode resultar não só de diminuição da expressão de DIO1 mas também do aumento da actividade do tipo 3 deiodinase (DIO3), que é uma hormona da tiróide inativação de enzima. Usando Q-PCR, analisamos a expressão de mRNA DIO3 em 11 amostras ccRCC e controle pareados por par. DIO3 ARNm não era detectável em todas as amostras analisadas (resultados não mostrados). Assim, confirmou-se que a diminuição das concentrações de T3 intratumorais resultar de expressão DIO1 reduzido.

A transfecção com miR-224 diminui a expressão de endógena

DIO1

Para determinar o efeito funcional do miR -224 e miR-383 em endógena

DIO1

ARNm, Caki-2 as células foram transfectadas com pré-miR-224, pré-miR-383 (precursores microRNA), anti-miR-224, anti-miR- 383 (inibidores microRNA), ou mexidos controle. A transfecção com sucesso foi confirmada em análise de PCR QE por um grande indução de miR-224 e miR-383 após a transfecção com os precursores microRNA e diminuição significativa da expressão miARNs quando os inibidores foram usadas (Figura 3).

. Expressão de

DIO1

ARNm na linha de células Caki-2. As células foram transfectadas com 37,5 pmol de pré-miRs, anti-miRs mexidos ou pré-miR (controlo negativo); 48 h após o RNA total foi extraído para posterior análise por PCR-SQ de

DIO1

nível. A expressão é apresentado como percentagem do controlo (células transf ectadas com microARN scrambled). Os dados são apresentados como média ± SEM. Os dados foram analisados ​​por ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. ** P 0,01. B e C. O nível de miR-224 (B) e miR-383 (C) em células transfectadas com pré-miRs ou anti-miRs. Os dados são apresentados como percentagem do controlo (células transf ectadas com microARN scrambled). Os dados são apresentados como valores médios ± SEM para miARNs foram normalizados para gene U6. Os dados foram analisados ​​por ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. *** P . 0.001

níveis de mRNA de

DIO1

foram medidos por SQ-PCR e uma redução significativa (56%, p 0,01) do

DIO1 nível de transcrição

foi observada após a introdução da pré-miR-224. pré-miR-383 não tem esse efeito (Figura 3). Transfecção de Caki-2 células com anti-miR-224 resultou em aumento de

DIO1

expressão, em 45%, p 0,01, quando comparado com o controle mexidos. Não se observou essa superexpressão quando as células foram transfectadas com anti-miR-383 (Figura 3).

Estes dados mostram que endógena

DIO1

expressão de ARNm nas células Caki-2 é modulado por miR -224.

O 3’UTR de

DIO1

é um alvo direto de miR-224 e miR-383

A análise computacional de

DIO1 Sims 3 ‘UTR com TargetScan5.1 revelou dois locais putativos de ligação para miR-224 e miR-383, localizadas nos nucleótidos 1788-1794 e 898-904 da

DIO1

transcrição (NM_00792.5), respectivamente (Figura S2 em dados suplementar). Estes dois locais foram conservadas entre as espécies de mamíferos. Para estudar a interação direta entre o miR-224, miR-383 e

DIO1

transcrição que clonou o 3’UTR de

DIO1

a jusante do gene repórter luciferase no vector-control pGL3 – (DIO1-3’UTR). plasmídeo de controlo, em que DIO1 UTR 3 ‘foi inserido numa orientação inversa (DIO1-rev3’UTR) foi também construído. Em paralelo, criamos duas repórter adicional constrói em que as regiões de segmentação conservadas foram especificamente mutado, para abolir a ligação de miRNAs (Figura 4). linha de células HeLa, exibindo baixa expressão endógena de

DIO1

foi utilizado para experiências de transfecção. As células foram co-transfectadas com construções e precursores de microRNAs obtidos: pré-miR-224, pre-miR-383 ou controlo (mexidos miRNA). Em células HeLa transitoriamente transfectadas com o

DIO1

-3’UTR construção e precursores de miARN, observou-se uma inibição significativa da actividade de luciferase. Tanto o miR-224 e miR-383 causou redução na actividade de luciferase em cerca de 45% e 25%, respectivamente, em comparação com o controlo scrambled miARN. Ambos os pré-miRNAs não conseguiu exercer um efeito significativo sobre

DIO1

-rev3’UTR eo vetor vazio pGL3-Control (Figura 4).

A.

DIO1

3’UTR clonado a jusante da luciferase no vector pGL3-Control. A do tipo selvagem e mutante 3’UTR de

DIO1

com a região da semente (negrito) e substituições de base (fonte grande e sublinhado), que suprime a ligação de um determinado miRNA (verificado

in silico

) são apresentados a seguir. Dois tipos de mutantes 3’UTR foram construídos:

DIO1

-3’UTR224mut e

DIO1

-3’UTR383mut. B. ensaio de luciferase duplo. A actividade luciferase relativa de construções com o 3’UTR de

DIO1

:

DIO1

-3’UTR,

DIO1

-rev3’UTR,

DIO1

-3’UTR224mut,

DIO1

-3’UTR383mut e pGL3-Control na presença de pré-miRNA ou mexidos pré-miRNA (controle negativo). Os dados são expressos como valores médios ± SEM e estão apresentados como percentagem do controlo (células transf ectadas com microARN scrambled). Cada barra representa os valores de três experiências independentes, medidos em triplicado. A actividade relativa da expressão da luciferase do pirilampo foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. Os dados foram analisados ​​por ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. . ** P 0,01

A actividade luciferase do repórter constrói:

DIO1

-3’UTR224mut e

DIO1

-3’UTR383mut, em que alvo sítios reconhecidos pelos microARN foram mutados, não foi afectada por pré-transfecção com miR-224 ou pré-miR-383, respectivamente (Figura 4). Esta observação confirma a especificidade da acção de ambas as microARNs como mutação no local de reconhecimento deve impedir de miARN ligação a 3’UTR. O que é mais importante, a mutação no local de reconhecimento de uma microARN não influencia a ligação de outro miARN analisados. A actividade luciferase em células transfectadas com

DIO1

-3’UTR383mut foi inibida em 40% após pré miR-224-disso, enquanto transfecção com

DIO1

-3’UTR224mut e pré-miR- 383 resultou numa diminuição ~ 23% na actividade da luciferase (Figura 4).

Tomados em conjunto, estes dados mostram que o 3 ‘UTR de

DIO1

contém sítios de ligação específicos para microARNs miR-224 e miR-383.

Discussão

neste estudo nós mostramos pela primeira vez que o tipo 1 iodotironina deiodinase transcrição é um alvo funcional direta para microRNA miR-224. A ligação de miR-224 a

DIO1

resultados 3’UTR em regulação baixa de endógena

DIO1

expressão em células de cancro renal. Além disso,

DIO1

3’UTR contém sítios de ligação conservados específicas para miR-224 e miR-383, como mostrado em ensaios de repórter de luciferase. Ambos os microRNAs são marcadamente sobre-expressos em câncer renal de células claras e possivelmente responsáveis ​​por perda de

expressão DIO1

no tumor. Este foi apoiado pela correlação negativa entre as mudanças específicas do tumor em miR-224 e

DIO1

níveis de mRNA e perda de proteínas em amostras DIO1 ccRCC. Além disso, as alterações específicas do tumor em concentração de produto de actividade DIO1, T3, correlacionam negativamente com mudanças de miR-224 de expressão. Estes resultados fornecem uma forte evidência para um novo mecanismo de

DIO1

regulamentação.

Os mecanismos de regulação

DIO1

expressão são mal compreendidos. Em nossos estudos anteriores, observamos a falta de correlação entre a proteína DIO1 e nível de mRNA em ccRCC (6), que sugeriu o possível envolvimento de mecanismos pós-transcricional, como a regulação dependente de microRNA. No presente estudo observou-se redução de quase 3 vezes de

DIO1

expressão de mRNA enquanto a proteína DIO1 estava perdido em amostras de tumor. Uma observação interessante feita no presente estudo é que a expressão de miR-224 tende a mudar com graus de diferenciação do tumor e é maior no G1 e menor no G3 (Fig. 2). Embora estas alterações entre os respectivos graus de diferenciação do tumor não são estatisticamente significativos que podem, possivelmente, sugerem que à medida que progride o impacto do tumor de miR-224 em

DIO1

expressão diminui e talvez outros mecanismos de pós-transcrição estão envolvidos. Como já demonstrado anteriormente, um outro mecanismo que contribui para a expressão DIO1 prejudicada em ccRCC é o seu splicing alternativo perturbado resultando possivelmente a partir de mudanças na expressão de fatores de splicing (7, 38). Nas experiências realizadas em Caki-2 células, o miR-383 não afectou a expressão endógena de DIO1. Isto pode sugerir que miR-383 atua em um nível pós-transcricional, causando obstrução de tradução em vez de degradação do

DIO1

mRNA. A segunda possibilidade é que os outros factores (incluindo miR-224) podem exercer efeito mais forte sobre a expressão DIO1 em ccRCC. Esta ideia é suportada pelos resultados de experiências luciferease em que o miR-383 induzidas expressão resultou em apenas 25% de redução da actividade de luciferase em comparação com o efeito de miR-224 que fez com que 45% a regulação negativa da expressão. experimentos luciferase confirmam a hipótese de que a ligação de miR-383 a

DIO1

resultados 3’UTR em bloqueio de tradução, como a actividade luciferase é uma consequência directa dos níveis de proteína luciferase reais.

Desde expressão alterada de miR-224 e miR-383 foi observada em tumores de tecidos que expressam tipo 1 iodotironina deiodinase que sugere que estes tumores também podem apresentar expressão perturbada de

DIO1

. Com efeito, nos cancros da tiróide papilares, expressão de miR-224 foi significativamente elevados (39), enquanto os nossos estudos revelam que nesta cancro, a expressão de

DIO1

é reduzida (3). Por outro lado, no cancro da mama, miR-383 está perdido (40), enquanto

DIO1

expressão aumenta significativamente (41). Se a expressão prejudicada de

DIO1

realmente resulta alterados miR-224 e miR-383 níveis nestes cancros precisa ser avaliada por estudos separados.

A importância de nossos resultados vem do papel da DIO1 na fisiologia celular. DIO1 é uma biodisponibilidade enzima regulação de hormônios da tireóide. Recentemente, foi sugerido que DIO1 não contribui para os níveis circulantes de T3, mas sim actua como um eliminador de enzima envolvida na reciclagem de iodeto (42). No entanto, a possibilidade de que DIO1 contribui para T3 sintetizado localmente no DIO1 tecidos que expressam não pode ser descartada como foi sugerido anteriormente (43, 37). Assim, microRNAs que regulam a expressão DIO1 em ccRCC pode ter o potencial influência sobre os níveis de hormônio da tireóide intratumorais. De fato, como demonstramos no presente estudo, as mudanças específicas do tumor na concentração de T3 intracelular correlacionar com as mudanças de expressão de miR-224. Curiosamente, em nosso estudo recente verificou-se que transcrição do gene da beta do receptor da hormona da tiróide (

THRB

) também é um alvo para a regulação dependente de microRNA (37). miR-204 está sobre-expressos em ccRCC e resulta em downregulation concomitante de expressão

THRB

. Estes resultados, juntamente com resultados do presente estudo sugerem que os microRNAs podem contribuir para o hipotiroidismo tecido ccRCC resultando em desativação de genes-chave da via de hormônio da tireóide,

THRB

e

DIO1

e, em conseqüência , levando à diminuição dos níveis de T3 intratumorais. Esta é uma observação importante uma vez que vários estudos demonstraram que THRB pode actuar como um supressor de tumores e que o hipotiroidismo podem influenciar o crescimento do tumor (44-48). Assim, a regulação dependente de microRNA de Estado da tiróide intracelular possivelmente pode ter o potencial de afetar processo neoplásico. Curiosamente, este pode ser um fenômeno mais geral em tumores com expressão perturbada de

DIO1

e

THRB

. Em nosso estudo recente vários microRNAs que foram regulados positivamente em tumores de tireóide papilar (PTC) foram mostrados para alvejar diretamente transcrição THRB resultando em regulação baixa significativa da sua expressão (49). Seria de interesse para verificar se a expressão de microRNAs alvo

DIO1

também é perturbado em tumores PTC. Os nossos estudos anteriores mostraram que a perda de expressão DIO1 em PTC é acompanhada por falta de correlação entre a expressão de ARNm e proteína (3). Isto sugere possível regulamentação pós-transcricional incluindo o envolvimento microRNA. No entanto, se prejudicada

expressão DIO1

no resultado PTC da desregulamentação mediada por microRNA precisa ser verificada por meio de estudos adicionais.

expressão Disturbed microRNA em ccRCC já foi relatada em outros estudos. Curiosamente, entre microARNs diferencialmente expressos em amostras de controlo e de tumor de miR-224 tem sido repetidamente encontrado por estudos independentes (30, 33, 50). Isto sugere a possível utilização de miR-224 como um marcador de diferenciação de tumores ccRCC tecidos saudáveis. No que diz respeito miR-383, que foi reportado como regulada negativamente em carcinoma hepatocelular (51), da mama e cancro do ovário, melanoma (40), leucemia mielóide aguda (52) e os tumores do sistema nervoso central (53). Assim, o nosso trabalho é o primeiro que mostra a regulação positiva de miR-383 em câncer. Se isto é uma característica específica da neoplasia renal continua a ser verificada por meio de experimentos futuros. Ambos os microARNs, miR-224 e miR-383 são acreditados para ser implicada no controlo da proliferação ou apoptose. miR-224 foi mostrada para aumentar a morte celular por apoptose e a proliferação em carcinoma hepatocelular (54), enquanto que a sobre-expressão de miR-383 inibiu a proliferação de células de carcinoma embrionárias testicular (55). A questão de saber se o miR-224 e miR-383 estão envolvidos na proliferação ccRCC aguarda estudos futuros

Em resumo, demonstramos que

DIO1

3’UTR é alvo de dois microRNAs:. MiR-224 e miR-383. miR-224 medeia perda de DIO1 no cancro renal, o que resulta em diminuição da concentração T3 intratumoral. Estes resultados fornecem uma forte evidência para um novo mecanismo de regulação da expressão de tipo 1 iodotironina deiodinase. Os relatórios anteriores revelaram que a expressão perturbada de THRB, outro gene da via hormona da tiróide, observada em ccRCC, também pode resultar de desregulação dependente de microRNA. Juntos, estes resultados sugerem que a nova classe de RNAs pequenos, não codificantes podem contribuir para o hipotiroidismo intracelular em ccRCC.

Materiais e Métodos

Amostras de tecidos e linhas celulares

as amostras de tecido foram obtidos com a permissão do Comitê de Bioética do Centro Médico de Pós-graduação Educação em Varsóvia, de pacientes com carcinoma de células claras de células renais (32 pacientes). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes envolvidos neste estudo. As amostras foram divididas em dois grupos: as amostras de tumor (n = 32, T) e amostras de controlo (tecido normal emparelhado a partir do pólo oposto do rim malignas sem evidência histológica do tumor; n = 32, C). carcinoma de células renais claras celular foi diagnosticada histologicamente de acordo com critérios da OMS (56). Os tumores foram divididos em três grupos, dependendo do grau de diferenciação:. G1 (bem diferenciado), G2 (grau intermédio de diferenciação), G3 (cânceres pouco diferenciadas)

O câncer cervical (HeLa) e de células renais de células claras linhas celulares de cancro (Caki-2) utilizadas neste estudo foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, (EUA) e cultivadas de acordo com o protocolo de ATCC. As células foram semeadas em placas de cultura de 12 cavidades à densidade de 5 x 10

4 (Caki-2) ou 1 × 10

5 células (HeLa) /poço 24 h antes da transfecção.

repórter de luciferase construções

1023 fragmento de bp de

DIO1

foi amplificada utilizando cDNA da linha de células HeLa (primers

DIO1

-3’UTR F e R, Tabela S1, os dados suplementar), clonado em Xbal local imediatamente a jusante do codão de paragem no vector repórter de controlo pGL3-luciferase de pirilampo (Promega, EUA), sequenciado e denominado

DIO1

-3’UTR, ou

DIO1

– rev3’UTR, dependendo da orientação da inserção clonada. O inversamente inserido

DIO1

-rev3’UTR foi usado como vector de controlo negativo. A mutagénese dirigida ao local das instalações alvo miR-224 e miR-383: GTGACTT de miR-224 dentro nt 1788-1794 e TCTGATCT de miR-383 dentro nt 898-904 no

DIO1

3’UTR foi Breve realizada utilizando kit de mudança-mutagénese (Stratagene, Alemanha). Primers Mut224 F /R e Mut383 F /R (Tabela S1, os dados Suplementar) e

DIO1

plasmídeo -3’UTR como um modelo foram utilizados. Duas construções:.

DIO1

-3’UTR224mut e

DIO1

-3’UTR383mut foram obtidos

reacção sequenciamento foi realizado com Big Dye Terminator v3.1 Kit Cycle Sequencing (Applied Biosystems, EUA).

células transfecção e luciferase ensaio

células Caki-2 foram semeadas a 0,5 × 10

5 células por 12 poços prato e transfectadas 24 horas depois usando Lipofectamine 2000 reagente (Invitrogen, EUA) como descrito pelo fabricante, com 37,5 pmol de miARN precursores: pré-miR-224 e pré-miR-383 (pré-miR

™ miARN Precursor molécula, Ambion, EUA), inibidores miARNs: anti -miR-224 e anti-miR-383 (anti-miR ™ miRNA Inhibitor Molecule, Ambion, EUA) ou controlo mexidos microRNA (controlo negativo microRNA, Ambion, EUA). As células foram colhidas após 48 h para a extracção de RNA.

precursores de miARN são dúplices de ARN sintéticos que mimetizam miARNs endógenas, enquanto que os inibidores têm uma sequência complementar para amadurecer miARNs e funcionar por meio de sequestrante /degradar miARNs endógenos.

Para os ensaios de gene repórter, as células HeLa foram semeadas a 1 x 10

5 em placas de 12 poços e 24 h mais tarde, co-transfectado com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA). Cada reacção continha 100 ng de cotransfecção vector pRL-TK (Promega, EUA) que expressam a luciferase da Renilla, 1 ug de PGL-3 ‘UTR vectores e 37,5 pmol de pré-miRs microARN ou mexidos. Após 48 horas, as células foram lisadas e a actividade de luciferase foi analisada em ensaio de luciferase dupla (Promega, EUA), utilizando um luminómetro Synergy2 (BioTek, EUA). Firefly atividade luciferase foi normalizada para a actividade luciferase Renilla. Em todas as experiências, ensaios de transfecção e de luciferase foram realizadas em triplicado.

isolamento de ARN e a transcrição reversa

O ARN celular total foi isolado como descrito anteriormente (37). A transcrição reversa foi realizada utilizando RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Lituânia). Para transcrição reversa, 200 ng de RNA total foi utilizado com iniciadores aleatórios Hexâmero ou primers haste-laço específicos com 5′-saliências (Tabela S2, os dados Suplementar) para microRNAs.

cDNA para miR-224 e miR- 383 foi também sintetizada com iniciadores específicos de miARN TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems, EUA) e reagentes do kit TaqMan MicroRNA Transcrição reversa (Applied Biosystems, EUA).

SQ-PCR

DIO1

análise da expressão em células Caki-2 foi realizada utilizando ADN SYBR Green I Mestre (Roche Diagnostics, Alemanha) em triplicado de acordo com os protocolos dos fabricantes. SQ-reacção de PCR foi realizada sob as seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos de:. 95 ° C, 15 s; 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, 68 ° C, 15 s; seguido por análise de curva de fusão: 95 ° C, 5 min .; 65 ° C, 1 min .; leitura contínua da fluorescência a partir de 65 ° C a 97 ° C com uma taxa de rampa de 0,11 ° C /s e 5 aquisições por cada ° C. Os resultados foram normalizados para a expressão do gene hospedeiro-18sRNA

RN18S1

.

DIO1

e

DIO3

análise de expressão em amostras de tecido foi realizado como descrito anteriormente (37). As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela S1, (dados adicionais). B).