Abstract

Fundo

Observamos expressão HOXB7 anormal em carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC) previamente. Este estudo foi avaliar o significado prognóstico da HOXB7 e revelar o potencial mecanismo.

Métodos

A imuno-histoquímica foi utilizada para confirmar a expressão anormal de HOXB7 em ESCC. O significado prognóstico da expressão HOXB7 foi analisada em duas coortes independentes. ARNi foi usada para estabelecer duas estirpes de células knockdown-HOXB7 estáveis. CCK8 ensaio, ensaio de curva de crescimento de células, o ensaio de formação de colónias, análise do ciclo de fluxo e ensaio de tumorigenicidade em ratinhos nus foram utilizados para investigar o efeito de HOXB7 sobre a proliferação in vitro e in vivo.

Resultados

a imuno-histoquímica confirmou que a expressão anormal de HOXB7 CICAc em comparação com a mucosa paracancerous (18/23 versus 23/09, p = 0,039). expressão HOXB7 foi positivamente correlacionada com a fase T, metástases linfonodais e estágio TNM. A sobrevida média dos pacientes com alta expressão HOXB7 foi significativamente menor do que aquela com baixa expressão (45 meses versus 137 meses, p = 0,007 para a coorte 1; 19 meses versus 34 meses, p = 0,001 para coorte 2). A análise multivariada mostrou que a expressão HOXB7 foi outro fator prognóstico independente (HR [IC 95%] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 para a coorte 1; HR [IC 95%] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 para a coorte 2). Experimentos in vitro e in vivo mostraram que após knockdown de HOXB7, a taxa de proliferação caiu, taxa de crescimento desceu, a capacidade colónia-formação reduzida, paragem na fase G1 ocorreu e a tumorigenicidade reduzido notavelmente.

Conclusões

HOXB7 pode promover a proliferação de células cancerosas e pode ser um fator prognóstico independente para pacientes com CICAc

Citation:. Li H, Shen LY, Yan WP, Dong B, Kang XZ, Dai L, et al. (2015) desregulada Expressão HOXB7 prediz pior prognóstico dos pacientes com esôfago carcinoma espinocelular e Regula Cancer Proliferação celular in vitro e in vivo. PLoS ONE 10 (6): e0130551. doi: 10.1371 /journal.pone.0130551

Editor do Academic: Nikki Pui-yue Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 27 Janeiro, 2015; Aceito: 21 de maio de 2015; Publicação: 15 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Atualmente, o câncer de esôfago é um dos tumores malignos mais comuns em todo o mundo, e carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) possui o tipo patológico mais comum na população chinesa [1, 2]. Embora o tratamento multidisciplinar dominado por cirurgia tem avançado significativamente nos últimos duas décadas em relação ao diagnóstico e tratamento de ESCC, e o resultado do tratamento foi melhorado, a sobrevivência a longo prazo ainda é insatisfatória [3]. Uma das medidas eficazes para melhorar a sobrevida global envolve a identificação de biomarcadores clínicos com significado prognóstico para orientar o tratamento. genes HOX são um grupo de genes que regulam o desenvolvimento embrionário. A família, com 39 membros, é dividido em quatro grupos, ou seja, A, B, C, e D, que estão localizados em quatro diferentes cromossomas [4, 5]. genes HOX codificar uma família de fatores de transcrição, e sua expressão anormal é muitas vezes associada a doenças, atraindo cada vez mais atenção na pesquisa do câncer [6, 7]. Estudos anteriores em biologia do desenvolvimento mostraram que HOXB7 é normalmente expresso no desenvolvimento do esófago humano [8]. Entre os 39 genes HOX examinados no nosso estudo anterior, oito foram expressas apenas no tecido maligno de pacientes CICAc, mas não nos tecidos normais adjacentes emparelhados, incluindo a taxa de HOXB7 com expressão positiva 58,3% [9]. Portanto, a hipótese de que HOXB7 desempenhou um papel específico na ocorrência e desenvolvimento de ESCC e pode ser um marcador molecular útil para predizer o prognóstico e até mesmo orientar o tratamento. Para o melhor do nosso conhecimento, não são raros estudos sobre a expressão HOXB7 e prognóstico em ESCC envolvendo uma grande tamanho da amostra, e não in vivo e in vitro discutir o mecanismo subjacente. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar o significado prognóstico e do mecanismo funcional do HOXB7 em tecidos CICAc.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

foi aprovada Toda pesquisa envolvendo seres humanos pelos Comitês de Ética do Hospital do Câncer Pequim, China, e conduzida de acordo com a Declaração de Helsinki. consentimentos informados por escrito ter sido obtido de todos os participantes.

Pacientes e amostras de tecido

Para validar a alta expressão de HOXB7 em tecidos CICAc relatados em nossos estudos anteriores [9], 23 pacientes foram recrutados CICAc eo tumor embebido em parafina e emparelhado cortes de tecidos não cancerosos foram recuperados

Para investigar a associação da expressão da proteína HOXB7 com o prognóstico de pacientes com ESCC, duas coortes de estudo independentes foram incluídos:.

a coorte I.

O nosso grupo de pesquisa criou um banco de dados prospectivo para câncer de esôfago desde janeiro de 2000 e de 1249 casos com esofagectomia realizada por uma equipe de cirurgião única (Dr. KN Chen) foram consecutivamente recolhidos. Neste estudo, os critérios de inclusão foram os seguintes: os pacientes que foram diagnosticados com patologicamente CICAc e submetidos a esofagectomia radical, sem terapia de indução antes da cirurgia entre janeiro 2000 e dezembro de 2011. Um total de 177 casos preencheram os critérios (Tabela 1). A 7ª edição do sistema de estadiamento TNM (AJCC e UICC, 2009) foi usado para classificar os pacientes.

O grupo II.

O grupo II incluiu 103 pacientes que foram diagnosticados com patologicamente ESCC e foi submetido a esofagectomia radical por vários cirurgiões, sem terapia de indução antes do nosso banco de dados prospectivo estabelecida 1996-2002 (Tabela 1). Os dados foram coletados retrospectivamente de acordo com os registros médicos de pacientes sem dados prospectivos. O sistema de estadiamento TNM da UICC de 1987 foi utilizado para avaliar pacientes.

métodos de acompanhamento

Os dados de acompanhamento de coorte I foi cobrada do nosso banco de dados prospectivo. Após a cirurgia, ambulatório visitas de acompanhamento foram realizados uma vez a cada três meses nos primeiros 2 anos, uma vez em cada 6 meses 2-5 anos, e uma vez em cada ano após 5 anos. A sobrevivência global foi definida como o tempo desde a data da cirurgia para a morte ou a última seguimento. O último ponto de verificação de acompanhamento foi de agosto de 2013. A taxa total de follow-up para o nosso banco de dados foi de 96,1%: 80,2% visitas ambulatoriais e 15,9% telefone ou carta de acompanhamento. O telefone ou carta follow-up envolvidos principalmente aqueles pacientes sem visitar a ambulatório dentro do cronograma. Ambulatoriais seguimentos envolvidos gravação de sintomas e vários exames, incluindo tomografia computadorizada, imagiologia gastrointestinal superior, abdominal e ultra-som supraclavicular bilateral e gastroscopia, se necessário. Depois de 2010, alguns pacientes foram submetidos a exames de tomografia por emissão de pósitrons CT (PET-CT).

Os dados de acompanhamento de coorte 2 foram coletados a partir da revisão de prontuários do paciente. O último tempo de seguimento foi de Fev de 2008 e taxa de acompanhamento foi de 80%.

As culturas de células

As linhas celulares CICAc humanos EC109 e KYSE150 foram obtidos a partir de Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências médicas, Beijing, China. EC109 foi cultivada em meio DMEM (Gibco) suplementado com FBS a 10% (Gbico) a 37 ° C numa atmosfera de ar com CO2 a 5%. KYSE150 foi cultivada em meio RPMI 1640 (Gibco) com 10% de FBS (Gbico) a 37 ° C numa atmosfera de ar com CO2 a 5%.

Vectors infecção construção e Lentivirus

Para a regulação negativa de HOXB7, quatro short hairpin (shRNA) sequências (GCCGAGTTCCTTCAACATGCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/ACCTGTTCTGTAGCTTTCTGG) foram clonados em pGLV-H1-GFP-puro. sequência mexidos (ACTACCGTTGTTATAGGTG) foram utilizados como controle. construção do vector lentiviral e embalagem foi realizada por GenePharma Company (Xangai, China). As células foram infectadas com 50 uL de sobrenadante filtrado lentivírus (1 × 10

9 TU /ml) em cada poço da placa de 24 poços, com a presença de 8 ug /ml de polibreno (Millipore). linhagens celulares transfectadas estáveis ​​que expressam shHOXB7 foram seleccionados com 2 ug /ml de puromicina.

extracção de ARN, a RT-PCR e PCR em tempo real

O ARN total de células foi extraído por TRIzol (Invitrogen, Carlsbad , Califórnia). O ARN foi transcrito reverso para ADNc por RT-PCR (Fermentas Life Science). Quantitativa em tempo real de PCR foi realizado utilizando PCR em tempo real SYBR Green Maser Mix (Applied Biosystems) para detectar os níveis de expressão de ARNm de genes alvo. GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato) foi utilizado como controlo endógena. A sequência dos iniciadores utilizados são os seguintes: para HOXB7, directo 5′-TATGGGCTCGAGCCGAGTT- 3 ‘, reverso 5′-GGCCTCGTTTGCGGTCAGT -3′; para GAPDH, frente 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 ‘, reverso 5′- GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3’. Todos os ensaios foram realizados em triplicado sob 7500 em tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems) e repetida três vezes de acordo com o protocolo do fabricante. Avaliação da expressão relativa foi calculada pelo método comparativo CT (ciclo limite). 2

-ΔΔCt referiu-se à dobra da expressão do mRNA do gene alvo em relação à expressão GAPDH na mesma amostra.

Western blot

extractos celulares totais foram preparados em 1 × SDS tampão de carga, separaram-se por SDS-PAGE, transferidas para membranas de PVDF, em seguida feita imunorreagir com o anticorpo monoclonal de rato anti-HOXB7 (Abnova) como anticorpo primário. IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano foi usado como um anticorpo secundário. A imunorreactividade foi detectada com um kit de reacção de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare). Como um controlo de carga, glyceraldehyde- 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi detectada utilizando um anticorpo monoclonal de murganho (Abcam).

A imuno-histoquímica

Após desparafinização rotina e hidratação, as secções de tecido foram tratadas com três % de peróxido de hidrogénio e, em seguida, aquecida em solução de citrato (pH = 6,0) para a recuperação de antigénio. A reacção HOXB7 antigénio-anticorpo realizou-se durante a noite a 4 ° C Após bloqueio de soro de cabra. O anticorpo monoclonal de ratinho anti-HOXB7 (Abnova) foi utilizado a 1 ug /ml (1: 1000), e IgG de cabra anti-ratinho conjugado com biotina foi utilizado como anticorpo secundário. Os sinais de imuno-histoquímica foram marcados por dois observadores independentes. As pontuações foram calculados como o número de células coradas, dividido pelo número total de células cancerosas. Cinco campos de alta potência representativos (X400) por slide foram calculadas e os resultados foram calculados. coloração inequívoca do núcleo em 25% das células cancerosas foi considerada alta expressão

ensaio CCK8 e crescimento celular curva

A proliferação celular foi determinada pela Cell Counting Kit-8 coloração (Dojinodo. , Shanghai, China) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade inicial de 5 x 10

3 células /poço. Em cada ponto de tempo, as células foram coradas com corante CCK8 10 uL em meio de cultura de 90μl durante 2 h a 37 ° C. A absorvância foi medida a 450 nm, com 650 nm como o comprimento de onda de referência. Os resultados são confirmados por contagem de células manuais. As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade inicial de 5 x 10

3 células /poço e recolhidos em diferentes tempos e contadas utilizando um hematocytometer. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Colónia ensaio de formação de

As células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 6 poços (300-500 células /poço) e cultivadas durante 3 semanas. As colónias foram coradas com corante de Giemsa durante 30 min após fixação com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos. Três experimentos independentes foram realizadas.

análise do ciclo celular

distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. 1×10

6 células foram coletadas e fixadas com etanol frio a 70%. Após a fixação, foi adicionada a solução PI-coloração com RNase A (BD Biosciences). Após 30 minutos de incubação, as amostras coradas foram executados no citometria FACScan (BD Biosciences), e os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo (Árvore Star).

Tumorigênese em ratinhos nus

As experiências com animais eram aprovado pelos Comitês de Ética do Hospital do Câncer Pequim, China, e conduzida de acordo com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de laboratório. Os ratos foram mantidos sob os cuidados da Unidade de Laboratório Animal do Hospital do Câncer Pequim, China. shRNA células transfectadas estáveis ​​(1 × 10

6) em 100 ul de DMEM isento de soro /RPMI 1640 foram injectados s.c. no flanco direito de 4 a 6 semanas de idade do sexo feminino BALB /c atímicos murganhos nude. Todos os ratos foram alojados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. tumores de xenoenxerto foram gerados e os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical dentro de 4 semanas. Os tumores foram excisadas, medido por um paquímetro e ponderado por uma balança analítica eletrônica. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a seguinte fórmula:. volume do tumor = [(comprimento) x (largura) x (largura)] /2. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a norma orientações institucionais da Peking University School of Oncology para experiências com animais

a análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS 19.0 estatística. Todas as experiências in vitro foram realizadas pelo menos três vezes em triplicado. As comparações entre os grupos para significância estatística foi realizada com o teste t de Student não pareado 2 caudas. Barras e as barras de erro nos gráficos, bem como dados no texto representam média ± DP. Comparações entre o câncer e os tecidos normais emparelhados foram testados utilizando teste de Wilcoxon. As relações entre a expressão HOXB7 e características clínico-patológicas foram testadas por meio do teste do qui-quadrado. As curvas de sobrevida foram traçadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log rank. O modelo de riscos proporcionais de Cox com um procedimento passo a passo foi utilizado para análise multivariada. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A expressão de HOXB7 foi regulada em ESCC comparação com emparelhado tecidos não cancerosos

O hotel tinha anteriormente relatados 8 de 39 genes HOX, incluindo HOXB7 , expressa de forma anormal em tecidos CICAc mas não em tecidos cancerosos usando transcrição reversa-PCR [9]. Para elucidar melhor a expressão da proteína em HOXB7 CICAc, imuno-histoquímica (IHC) mancha foi realizado em tumores e tecidos emparelhados não cancerosas de pacientes CICAc. Notou-se que a proteína HOXB7 foi localizada principalmente no núcleo das células epiteliais normais esofágicas nas camadas basais e suprabasais, enquanto que nos tumores, células HOXB7-positiva amplamente distribuído. Análise comparativa indicou que HOXB7 foi significativamente regulada positivamente em 23 amostras de tumores examinadas (18/23), em comparação com os tecidos adjacentes não cancerosos (9/23) (Figura 1A, P = 0,039).

(A) amostra representativa de emparelhado tecidos normais (a, b) e CICAc (c, d). No epitélio esofágico normal, expressão HOXB7 foi principalmente limitada para o núcleo das células epiteliais localizadas nas camadas basais e suprabasais, ao passo que no CICAc, células HOXB7-positivos foram amplamente observado no tumor (Processo n. 53865). (B) A figura a e b, controle negativo, com o anticorpo primário substituído por PBS (Processo no. 40146). Figura c e d, baixa expressão de HOXB7 em ESCC (Processo no. 42873). Figura E e F, alta expressão de HOXB7 em ESCC (Processo no. 36840). (C) de Kaplan-Meier de sobrevivência para 177 pacientes na coorte I. O tempo médio de sobrevivência foi de 45 meses para os pacientes com elevada expressão, que foi significativamente menor do que os 137 meses para pacientes de expressão baixa (P = 0,007). (D) da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para 103 pacientes na coorte II. O tempo médio de sobrevivência foi de 19 meses para os pacientes elevados de expressão, o que foi significativamente menor do que os 34 meses para pacientes de baixo de expressão (p = 0,001).

expressão da proteína HOXB7 foi associado com características clínicas e sobrevida global

na coorte I, foi observada alta expressão da proteína HOXB7 em 124 de 177 amostras (70,1%) tumor (Fig 1B). O teste do qui-quadrado mostrou que os níveis de proteína HOXB7 expressão significativamente correlacionada com o estádio TNM (P = 0,034), estágio T (P = 0,036) e metástase ganglionar (Tabela 1, P = 0,042). A análise univariada indicou que pacientes que tinham baixos níveis de expressão HOXB7 viveram muito mais tempo (Fig 1C, P = 0,007). O tempo médio de sobrevivência foi de 45 meses para os pacientes com elevada expressão, que foi significativamente menor do que os 137 meses para pacientes com baixa expressão (Tabela 2). A análise multivariada confirmou que a expressão HOXB7 e estágio TNM foram dois fatores prognósticos independentes para a sobrevida global em pacientes com ESCC (Tabela 3, HR [IC 95%] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 para HOXB7 baixa expressão).

na coorte II, a alta expressão da proteína HOXB7 foi detectado em 61 de 103 (59,2%) casos de amostras de tecido tumoral (Fig 1B). O teste do qui-quadrado mostrou que os níveis de proteína HOXB7 expressão significativamente correlacionada com o estádio TNM (P = 0,001), estágio T (P = 0,000) e metástase ganglionar (Tabela 1, P = 0,006). A análise univariada usando o teste de log rank mostrou que pacientes com baixos níveis de expressão HOXB7 tiveram uma sobrevida mais longa média do que com a expressão alta HOXB7 (34 mons vs. 19 mons, p = 0,001) (Fig 1D, Tabela 2). A análise multivariada indicou que o nível de expressão HOXB7 e estágio TNM foram dois fatores prognósticos independentes para a sobrevida global em pacientes com ESCC (Tabela 3, HR [IC 95%] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 para HOXB7 baixa expressão) .

Down-regulação da proteína HOXB7 diminuição da proliferação celular in vitro

Para avaliar o possível papel da HOXB7 na proliferação de células CICAc humanos, temos, em primeiro lugar detectada a expressão de HOXB7 em vários celular CICAc linhas. PCR em tempo real e análise de transferência de western revelou que EC109 e KYSE150 exibiu relativamente elevada expressão endógena de HOXB7. Por isso, escolhemos linhas celulares EC109 e KYSE150 de estudo e derrubado expressão HOXB7 usando RNA de interferência. Dos quatro lentivírus com RNA hairpin curto, o melhor foi selecionado para cepa celular estabelecida com knockdown estáveis ​​de proteína HOXB7. Enquanto isso, um lentivírus com precipitação shRNA foi utilizada como um controlo. Finalmente, EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 e KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 foram estabelecidos. A eficácia de knockdown foi analisada por PCR em tempo real e Western blotting. HOXB7 ARNm e a expressão da proteína foi eficazmente reduzido por 80% a 85% em EC109 e linhas celulares KYSE150 (Fig 2A). CCK8 ensaio mostrou que HOXB7 knockdown diminuiu a proliferação de EC109 e KYSE150 em comparação com as células de controlo (Fig 2B; P 0,05). As contagens de células manual das células confirmada a diminuição da proliferação visto no ensaio CCK8. (Figura 2C; P 0,05). ensaio de formação de colónias de células que revelaram /shHOXB7 EC109 /shHOXB7 e KYSE150 formado colónias muito menos e menores do que a de células de controlo (Fig 2D; P 0,05).

(A) Queda de HOXB7 endógeno em shRNA específica EC109 -transduced estável e KYSE150 células, analisada por PCR em tempo real e western blotting. (B) Queda de HOXB7 inibe o crescimento de células como determinado por ensaio de CCK8. (C) Queda de HOXB7 inibe o crescimento celular tal como foi confirmado por contagens de células manuais. (D) Knockdown de HOXB7 inibe o crescimento celular como mostrou por ensaio de formação de colónias. As barras de erro representam DP ± média de 3 experiências independentes. *, P . 0,05

Down-regulação da proteína HOXB7 diminuiu o crescimento do tumor in vivo

Para confirmar o efeito de HOXB7 sobre a actividade tumorigénica de células CICAc in vivo, foi realizada ensaios de tumorigênese em ratos nus. linhagens celulares com EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 e KYSE150 /Scramble, células /shHOXB7 KYSE150 foram injetadas em ratos nus. Os tumores de xenoenxerto foram removidos 4 semanas após a injecção e foram medidos e pesados. Como mostrado na Fig 3A e 3B, os tumores formados pela EC109 /shHOXB7 e células /shHOXB7 KYSE150 foram significativamente menores do que os tumores de controlo de células formadas. O peso médio e do volume dos tumores no grupo EC109 /shHOXB7 foram 869 ± 295 mg e 870 ± 370 milímetros

3, respectivamente, em comparação com 1292 ± 453 mg e 1416 ± 472 milímetros

3 no grupo EC109 /Scramble (P 0,05). O peso médio e do volume dos tumores no grupo /shHOXB7 KYSE150 foram 415 ± 254 mg e 603 ± 362 mm

3, respectivamente, em comparação com 697 ± 253 mg e 1069 ± 377 mm

3 no grupo KYSE150 /Scramble (P 0,05).

tumores (a) geradas por injecção de EC109 /KYSE150 com células de proteína e de controlo HOXB7 knockdown estáveis. (B) O peso e volume dos tumores a partir de células-knockdown HOXB7 eram relativamente mais baixos do que aqueles das células de controlo. (C) histogramas representativos analisados ​​por citometria de fluxo mostrou os perfis do ciclo celular das células CICAc. Nas células com proteína HOXB7 knockdown estável, o número de células em fases S e G2 diminuiu em comparação com as células de controlo. (D) proporção de células em diferentes fases do ciclo celular. As barras de erro representam DP ± média de 3 experiências independentes. *, P . 0,05

HOXB7 acelerada do ciclo celular progressão

Para explorar o possível mecanismo de HOXB7 na promoção da proliferação celular ESCC, testamos a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig 3C, knockdown de proteína HOXB7 resultou em paragem em G1, com um aumento na proporção G1 e uma diminuição na proporção S e G2. A percentagem de células em fases S e G2 do grupo EC109 /shHOXB7 era 30,18% ± 1,16% e 9,51% ± 0,23%, respectivamente, o qual foi menor do que em células de controlo (31,75% ± 0,55% e 14,36% ± 0,94%, a Fig 3D, P 0,05). O percentual médio de células em fases S e G2 em grupo /shHOXB7 KYSE150 foi 37,31% ± 1,09% e 28,70% ± 1,22%, respectivamente, em comparação com 41,00% ± 1,32% e 30,92% ± 2,21% no grupo KYSE150 /Scramble (Fig 3D, P 0,05). Estes resultados indicaram que HOXB7 pode acelerar o G1 a transição da fase S em linhas celulares CICAc, o que contribui para a proliferação de células ESCC.

Discussão

biomarcadores tumorais Ideal tem bom valor prognóstico e pode guiá-clínica prática e, portanto, a busca de um biomarcador de prognóstico valioso ganhou foco principal na pesquisa oncológica. Entre estes, a expressão anormal de genes relacionados à embriogênese em malignidade sempre recebeu atenção significativa [10]. Por exemplo, a relação entre o antigénio carcinoembrionário (CEA) e o cancro colo-rectal e que entre o alfa-fetoproteína (AFP) e cancro do fígado, que têm sido aplicados com sucesso em ambientes clínicos. No entanto, até agora, bons marcadores tumorais para CICAc não foram identificados para uso na prática clínica. Os nossos estudos anteriores revelaram expressão anormal de 39 membros de genes HOX ao nível do ARNm em tecido de esófago maligna. Entre eles, oito foram expressas apenas no tecido maligno de pacientes CICAc, mas não nos tecidos normais adjacentes emparelhados, incluindo HOXB7 [9]. Outro estudo também mostrou que HOXB7 não é expresso no esófago normal, mas é expressa em níveis mais elevados ao nível do ARNm em CICAc [11]. O presente estudo confirmou estes resultados preliminares. mostrou-se que a expressão de HOXB7 foi significativamente maior em 23 amostras de tecido esofágico maligno do que na mucosa normal adjacente emparelhado, que oferece uma boa base para considerar HOXB7 como um marcador molecular para CICAc potencial. Desde janeiro de 2000, temos vindo a estabelecer um único cirurgião (Dr. Chen) do banco de dados câncer de esôfago prospectiva e consecutivamente recrutados 1.249 pacientes com câncer de esôfago que foi submetido à ressecção cirúrgica. As visitas de acompanhamento foram agendadas para todos os pacientes incluídos no banco de dados até a sua morte. expressão HOXB7 nas extraídos 177 casos que preencheram os critérios foi examinado, e sua relação com o prognóstico foi analisada. Os resultados mostraram que a expressão HOXB7 foi positivamente correlacionada com a fase TNM (P = 0,034), estágio T (P = 0,036), metástase de nódulo linfático (P = 0,042). O tempo médio de sobrevivência de pacientes com alta expressão HOXB7 foi significativamente menor do que a de pacientes com baixa expressão HOXB7 (45 meses versus 137 meses, p = 0,007). Para confirmar ainda mais este resultado, foi realizado um estudo retrospectivo em outra coorte anterior de pacientes sem dados prospectivos. Uma tendência semelhante foi observada em nossos resultados: Expressão HOXB7 nesta coorte também mostrou uma correlação positiva com o estágio TNM (P = 0,001), estágio T (P = 0,000) e metástases em linfonodos (P = 0,006). O tempo médio de sobrevivência de pacientes com alta expressão HOXB7 foi significativamente menor do que a de pacientes com baixa expressão HOXB7 (19 meses versus 34 meses, p = 0,001). Além disso, a análise multivariada com as variáveis, incluindo idade, sexo, localização do tumor, estágio TNM, estádio, estádio N, e expressão HOXB7 mostraram que a expressão HOXB7 e estágio TNM foram fatores prognósticos independentes em 177 pacientes recrutados no banco de dados prospectivo (HR [95% CI] = 0,573, [0.341-0.963], p = 0,036) e 103 pacientes recrutados em outra coorte sem dados prospectivos (HR [IC 95%] = 0,543, [0,350-0,844], p = 0,024), indicando que HOXB7 teve valor prognóstico para pacientes com ESCC.

para explorar ainda mais o mecanismo funcional da HOXB7 na ocorrência e desenvolvimento de ESCC, examinamos a expressão HOXB7 em várias linhas celulares CICAc e pré-seleccionados duas linhas de células com elevada expressão de HOXB7 (EC109 e KYSE150) para in vitro e in vivo.

primeiro, a técnica de interferência de ARN foi utilizado para estabelecer estirpes celulares HOXB7-knockdown estáveis, que foram então usados ​​para realizar CCK8 ensaio, ensaio de taxa de formação de colónia, e a análise do ciclo celular por citometria de fluxo para observar o efeito de HOXB7 sobre a proliferação celular em CICAc. Os nossos resultados mostraram que a taxa de proliferação celular foi mais lento em estirpes celulares knockdown-HOXB7, a taxa de formação de colónias foi reduzido, paragem na fase G1 ocorreu nas células malignas, e a percentagem de células nas fases G1 aumentou significativamente. Para verificar ainda mais o impacto de HOXB7 sobre a proliferação das células in vivo, utilizou-se estirpes de células de knockdown para estabelecer um modelo de tumorigenicidade em ratinhos nus e descobriram que a capacidade tumorigénica de células de estirpes de knockdown foi significativamente menor do que a de células de controlo.

na verdade, a desregulação da expressão HOXB7 tem sido relatada numa variedade de tumores, incluindo cancro da mama [12-14], cancro do ovário [15], cancro oral [16], cancro colorrectal [17], o cancro do pulmão [18] , melanoma [19-21] e câncer pancreático [22-24]. A superexpressão de HOXB7 foi mostrado estar relacionado com mau prognóstico no câncer de mama [14], o câncer bucal [16], o cancro colorectal [17], o cancro do pulmão [18] e adenocarcinoma do pâncreas [22, 23]. Mas o significado clínico da HOXB7 em ESCC raramente são relatados. Havia dois artigos que exploram significado prognóstico de expressão HOXB7 no mRNA e nível de proteína em ESCC recentemente, mas os tamanhos das amostras eram muito limitadas, e eles não confirmar suas descobertas em uma coorte independente [25, 26]. Em comparação com esses estudos, não só verificou a confiabilidade dos nossos achados em dois grupos independentes, incluindo 280 casos, mas também mais estudada para explorar a possível função de HOXB7 em ESCC. Verificou-se que HOXB7 poderia promover a proliferação de células de tumor em outros tumores sólidos [13-19, 27]. Mas até agora não existiam estudos que exploram o possível papel da HOXB7 e seus mecanismos subjacentes em ESCC. Com base nas conclusões preliminares acima discutidas, acreditamos que HOXB7 é susceptível de ser identificada como um biomarcador de prognóstico para pacientes CICAc, e expressão HOXB7 anormal pode afetar a capacidade proliferativa das células.

Enquanto isso, notamos um positivo correlação entre a maior expressão da proteína HOXB7 e metástase em linfonodo regional. Então, realizamos Transwell ensaio de migração e ensaio de invasão Matrigel, que indicou que HOXB7 knockdown migração celular inibida e capacidade invasão do EC109 e KYSE150 (S1 Fig; P 0,05). Mas a função de HOXB7 na invasão celular e metástase em ESCC ainda precisa de uma maior exploração.

Os mecanismos que fundamentam o papel de HOXB7 em ESCC não é clara. A exploração do mecanismo é complicado pela semelhança de sequência entre os genes HOX e redundância funcional reconhecida no sistema de genes HOX [7]. Como factor de transcrição, HOXB7 medeia os seus efeitos através da regulação da transcrição de genes alvo. Embora muitos genes foram mostrados para ser directamente ou indirectamente regulada pela HOXB7 em outras células cancerosas, apenas alguns deles têm sido identificados como alvos directos, incluindo bFGF [13, 22, 28]. HOXB7 pode activar directamente a expressão do factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e promover o crescimento de vários tumores, tais como cancro da mama e melanoma [13, 19, 29]. E bFGF tinha sido implicada em diversos processos biológicos, tais como a proliferação, diferenciação, sobrevivência, migração e [30]. HOXB7 expressão pode promover o crescimento celular, desencadeando de crescimento bFGF vias estimuladoras tanto intracrine e autócrinos em carcinomas do ovário [15]. A expressão de bFGF poderia ativar Ras-RAF-MAPK caminho através cascatas de sinalização autócrina no cancro da mama [12]. foi mostrado que PI3K /AKT e MAPK vias foram ativados por HOXB7 no cancro colorectal, o que pode explicar a aceleração da transição G1-S induzida por HOXB7 [17]. Em conclusão, estes resultados reforçaram os nossos resultados e clarificada a importância de HOXB7 na tumorigénese. Mais estudos para identificar mecanismos cerca HOXB7 activadores a montante, a jusante metas e parceiros funcionais seria útil para compreender melhor o papel de HOXB7 em ESCC

Este estudo tem algumas limitações:. Os dados clínicos foram obtidos a partir do único centro, o tamanho da amostra não foi grande o suficiente, e estudos clínicos foram retrospectiva na verdade. Portanto, em estudos futuros, o tamanho da amostra deve ser aumentada, e os pacientes do centro múltiplos deve ser incluído para esclarecer se HOXB7 pode servir como um marcador de prognóstico molecular específica em CICAc. Além disso, um estudo aprofundado sobre os mecanismos moleculares que estão na base do papel da HOXB7 na promoção da proliferação de células CICAc se justifica.

Informações de Apoio

S1 Fig. HOXB7 promove a migração de células humana CICAc e invasão.

(A) Queda de HOXB7 inibe a migração celular tal como determinado pelo ensaio de migração Transwell. (B) Knockdown de HOXB7 inibe o crescimento celular como mostrou ensaio de invasão Matrigel. As barras de erro representam DP ± média de 3 experiências independentes. *, P 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130551.s001

(TIF)

S1 Arquivo.